任夢云陳彥君張盾杜樂山劉方關瀟張銀東

（1. 中國環(huán)境科學研究院，北京 100012；2. 海南大學農(nóng)學院，?？?570228）

ISSR標記技術在藥用植物資源中的研究進展及應用

任夢云1，2陳彥君2張盾2杜樂山1劉方1關瀟1張銀東2

（1. 中國環(huán)境科學研究院，北京 100012；2. 海南大學農(nóng)學院，海口 570228）

簡單重復系列區(qū)間（inter-simple sequence repeat，ISSR）是在簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）基礎上發(fā)展起來的一種新型分子標記技術。目前藥用植物研究與開發(fā)面臨資源枯竭、藥效物質不明確及質量難以控制等難題，DNA分子標記技術，包括ISSR技術為上述難題提供了新的解決辦法。比較了幾種常用分子標記的優(yōu)缺點，最后著重介紹了目前廣泛應用于藥用植物研究中的DNA分子標記ISSR的技術原理和特點，綜述了ISSR分子標記技術在藥用植物的遺傳多樣性和遺傳結構、種質資源鑒定、中藥品質鑒定，以及遺傳圖譜等方面的研究進展及應用前景，旨為藥用植物的開發(fā)和利用提供參考。

ISSR；分子標記；藥用植物；品質鑒定；基因圖譜

藥用植物是指含有藥性成分、具有醫(yī)療用途、可用于藥物開發(fā)利用的植物資源類群［1，2］，具有極其重要的保護價值和開發(fā)潛力［3］。中國作為藥用植物資源最為豐富的國家之一，其資源種類達到一萬余種［4］。藥用植物作為傳統(tǒng)中藥的主要來源，需進行現(xiàn)代化的研究才能滿足人類的需求。目前藥用植物研究的主要內容包括種質資源的鑒定、親緣關系的劃分及遺傳起源與演化等，將分子生物學技術與藥用植物研究相結合，是現(xiàn)代藥用植物研究的重要手段。

越來越多的科學研究者應用不同的分子標記技術對中國藥用植物進行DNA分子水平的鑒定，張影波等［5］利用擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）和序列相關擴增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）兩種分子標記對我國藥用植物艾納香（Blumea balsamifera）種群的遺傳多樣性進行分析，結果表明兩者都可用于艾納香（B. balsamifera）的遺傳多樣性分析，但與SRAP相比較，AFLP具有多樣性位點多，特征指數(shù)高等優(yōu)點，更適合艾納香的遺傳多樣性研究。Fu等［6］利用（simple sequence repeat，SSR）標記研究棗種質資源遺傳多樣性，作者認為這些標記將有助于研究紅棗的遺傳資源結構，并有助于闡明這一重要作物的進化史。

目前廣泛應用的幾種分子標記技術，如RAPD是一種較為簡單方便的方法，具有快速、靈敏、易檢測等特點，但此種分子技術不能區(qū)分雜合子和純合子，在引物應用數(shù)目及擴增反應條件等實驗技術方面未標準化，穩(wěn)定性和重復性較差［7，8］。SSR雖然為共顯性標記，但引物開發(fā)成本較高，且必須事先知道微衛(wèi)星兩翼序列信息才能設計引物，對不同物種需先構建基因文庫［9-11］。AFLP實驗結果可靠，可快速獲得大量信息，再現(xiàn)性高，重復性好，但該技術技術難度高、成本高，同時放射性同位素標記會對操作人員造成傷害，因此需要特殊的防護措施和儀器設備［12-13］。限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）具有共顯性的特點，可區(qū)分同一位點的等位基因，實驗結果較為穩(wěn)定可靠，但其對DNA的量以及純度要求過高，得到的譜帶也更為復雜且難于解釋［14-18］。相對而言，ISSR結合了SSR和RAPD的優(yōu)點，操作簡單，所需DNA模板量少，實驗成本低，但在不同植物種群中也有所不同，故在具體操作過程中需要摸索條件進行優(yōu)化。

自ISSR分子標記技術問世以來，被廣泛應用于種質資源遺傳多樣性與結構研究、遺傳圖譜構建、種質資源研究等方面［19-21］，已成為現(xiàn)代分子生物學研究與應用的主流。本綜述主要討論ISSR分子標記技術在藥用植物資源研究上的應用與前景，包括種質資源的鑒定、遺傳多樣性評價、親緣關系研究和遺傳圖譜的構建等幾個方面。本文對ISSR標記在藥用植物資源上的應用情況進行綜述，以期為今后的藥用植物分子標記研究提供參考。

1 ISSR分子標記在藥用植物資源中的研究進展

簡單重復系列區(qū)間（inter-simple sequence repeat，ISSR）是Zietkeiwitcz等［22］于1994年提出，在是在簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）基礎上發(fā)展起來的1種新型分子標記技術，其基本原理是以錨定的微衛(wèi)星DNA為引物，即在SSR序列的3'端或5'端加上2-4個隨機核苷酸，通過PCR擴增兩側具有反向排列SSR的一段序列，然后利用電泳技術，根據(jù)譜帶的有無及相對位置分析其多態(tài)性。該技術結合了SSR和RAPD技術的優(yōu)點，具有操作簡單［23，24］、多態(tài)性豐富、重復性強、試驗穩(wěn)定性好［25-28］、DNA模板用量少和實驗成本低等優(yōu)點［28］。

目前分子生物學技術飛速發(fā)展，并逐漸滲透到生命科學的各個領域，為藥用植物的研究提供了新的借鑒方法，并且已被證實是一種評價種屬間遺傳多樣性和親緣關系的有效方法［29］。由于藥用植物種類繁多，對其遺傳起源與演化研究有限，目前國內外有關于藥用植物的研究主要集中在以下幾個方面。1.1 ISSR分子標記在遺傳多樣性研究上的應用

遺傳多樣性是每種生物所固有的特性，可以幫助了解物種的種群遺傳結構和多樣性水平，為研究物種起源、品種分類、品種保護及臨床用藥等提供依據(jù)［30］。遺傳多樣性的高低是物種生存能力的具體體現(xiàn)，而遺傳多樣性的研究是保護生物學研究的核心內容之一，是保護和利用藥用植物資源的前提和基礎，同時也是研究物種起源和演化的依據(jù)［31，32］。近年來，鑒于形態(tài)標記和生化標記方法易受環(huán)境、組織類別以及發(fā)育階段影響的弊端［33］，ISSR分子標記技術被廣泛應用于植物遺傳多樣性和遺傳結構的研究中。大量研究表明，ISSR分子標記技術可以用于種群間或種群內遺傳多樣性分析，了解種群遺傳變異的大小、時空分布及其與環(huán)境變化和人類活動的關系。這對了解藥用植物種群起源、進化歷程和現(xiàn)今分布格局，以及開展藥用植物種質資源育種和采取科學有效的保護措施均具有指導意義。種群遺傳多樣性的高低不僅關系到原位和遷地保護策略的制定，而且是物種可持續(xù)利用的重要基石。

用于藥用植物遺傳多樣性分析的DNA分子標記方法主要有RAPD和ISSR。但實驗發(fā)現(xiàn)，ISSR分子標記技術具有較高的多態(tài)性條帶比例及較多的擴增條帶數(shù)［34］，且ISSR比RAPD更有效率［35］，因此本綜述著重介紹ISSR分子標記技術在遺傳多樣性分析的應用。Zhang等［36］利用ISSR分子標記技術對87個油桐（Vernicia fordii）樣本進行了遺傳關系的研究，作者發(fā)現(xiàn)品種的引進可以加進種群間的遺傳分化，研究結果顯示樣本呈明顯的地理分化。Givnish 等［37］采用此技術研究桔梗（Clermontia）的變異程度，發(fā)現(xiàn)桔梗為雜種，并非單系群，為闡明其系統(tǒng)發(fā)育及花的演變研究做了補充。同樣，ISSR分子標記技術也用于分析植物的遺傳分化程度和遺傳結構，發(fā)現(xiàn)遺傳變異主要發(fā)生在種群內，根據(jù)其遺傳變異規(guī)律，可提出有效的保護措施，比如對苜蓿種質材料的研究［38］、臺灣杉（Taiwania cryptomerioides）的分析等［39］。詹羽姣［40］和王果平［41］都曾采用ISSR分子標記對新疆貝母（Fritillaria walujewii）或貝母屬植物進行遺傳多樣性分析，結果顯示藥用貝母品種整體上有較高的遺傳多樣性，這為其資源收集、品種分類以及種質保護提供了理論依據(jù)。Liu 等［42］利用ISSR對來自新疆3個地區(qū)、10個種群的刺山柑（Capparis spinose）進行遺傳多樣性和種群結構分析，結果表明這3個地區(qū)的刺山柑基因型具有較高的遺傳多樣性，可用于替代育種計劃。以上研究表明，ISSR分子標記技術適于多種藥用植物資源的遺傳多樣性研究。

1.2 ISSR分子標記在種質資源鑒定與親緣關系研究中的應用

隨著生物技術的發(fā)展，DNA分子水平已發(fā)展到可以從遺傳背景判斷種質材料之間的差異，為種質資源的評價提供更加穩(wěn)定、可靠的參考依據(jù)，為進一步分子輔助育種奠定基礎。ISSR分子標記技術因其穩(wěn)定性和高效性等優(yōu)點，被應用到藥用植物種、屬等各個單元的親緣關系比較。利用ISSR分子標記技術研究確定藥用植物間的親緣性關系、繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹，有效闡明藥用植物物種自然種群、品種間遺傳結構的基因流動，揭示生物的遺傳背景差異、物種演化、系統(tǒng)發(fā)育和親緣關系。

ISSR分子標記技術不僅可用于不同產(chǎn)地藥用植物資源的劃分，同樣也可用于物種的鑒定與劃分，為育種工作奠定基礎［43］。任風鳴等［44］運用ISSR技術對來自36個不同產(chǎn)地的金錢草（Lysimachia christinae）種質資源進行遺傳多樣性進行分析，結果表明劃分的組群與地理分布沒有明顯相關性，這說明金錢草（L. christinae）種質資源具有較為豐富的遺傳多樣性。Lu 等［45］利用ISSR分子標記技術對不同產(chǎn)地的24種石斛（Dendrobium nobile）種質資源進行遺傳多樣性分析，結果表明這24種石斛（D. nobile）從生境上可分為六組，且遺傳多樣性豐富。陽翠等［46］采用ISSR分子標記技術，對產(chǎn)自寧夏、甘肅、青海、新疆和內蒙的22個苦豆子（Sophora alopecuroides）居群進行遺傳多樣性和親緣關系分析，結果表明22個苦豆子（S. alopecuroides）居群間具有較高的遺傳多樣性，且各居群間遺傳距離與地理距離沒有明顯關系，這為野生苦豆子資源的馴化和保護等提供科學依據(jù)。Safaei 等［47］利用ISSR分子標記技術對6個丹參種（Salvia）的39個植物樣本進行研究，結果表明ISSR分子標記技術能應用于形態(tài)學研究中的物種鑒定與劃分。以上研究表明，ISSR標記適于多種藥用植物種質資源的鑒定和親緣關系分析。

1.3 ISSR分子標記在中藥品質鑒定中的應用

中藥材品質鑒定是中藥質量控制研究的重要組成部分，長期以來我國中藥材處于品種難以鑒定和質量難以保證的不利局面，很大程度上限制了中藥安全的檢測及其向現(xiàn)代化、標準化和國際化的發(fā)展［48］。目前人們一直在尋找科學而有效的鑒定方法，隨著分子生物學技術的迅速發(fā)展，ISSR分子標記技術已經(jīng)在該領域取得了不斐的成績。因此，采取科學的方法對易混淆生藥品種及近緣種進行鑒定具有重要的現(xiàn)實意義。

ISSR分子標記技術因具有不會受到環(huán)境因素影響的優(yōu)勢，已被廣泛應用到藥用植物品質鑒定及道地性的研究，并取得良好效果，為中藥研究者提供1種中藥品質鑒定的評價標準。周曄等［49］運用ISSR技術鑒別中藥玉竹（Polygonatum odoratum）及其摻偽品小玉竹（P. humile），結果顯示通過顯微鑒定以及ISSR標記可以將玉竹（P.odoratum）及其主要摻偽品區(qū)分開。同時，運用ISSR分子標記技術能有效的區(qū)分中藥黃精（P. sibiricum）和卷葉黃精（P. cirrhifolium）［50］，保證了用藥的安全。潘清平等［51］也采用ISSR分子標記技術成功對玉竹的主要栽培品種、野生種及易混淆品黃精（P. sibiricum）進行了鑒定。Pongsrila 等［52］利用ISSR技術，進行蘭花品種的鑒定，成功區(qū)分了14個種的石斛屬植物，進一步證明了ISSR標記在鑒別不同種和不同產(chǎn)地石斛屬植物方面的適用性，為解決石斛道地性判斷這一難題提供了新的解決思路，同時為未來育種數(shù)據(jù)基因庫的構建奠定基礎。由此表明，ISSR分子標記技術可用于多種道地藥材的品質鑒定。

1.4 ISSR分子標記在遺傳圖譜構建中的應用

遺傳連鎖圖譜研究的目的是尋找足夠的多態(tài)分子標記，將所有基因定位到特定染色體的特定區(qū)域，最好是在染色體步查距離內。ISSR分子標記技術能夠揭示高度多態(tài)性且標記遍布于整個染色體上，是繪制遺傳連鎖圖的理想標記。ISSR不僅應用于種群遺傳結構上［53，54］，在遺傳圖譜構建［55，56］、目標性狀基因連鎖［57］等方面也有相關報道。

利用ISSR分子技術繪制藥用植物種質資源的DNA指紋圖譜，同時與其品質進行相關性分析，這可以為進一步的分子輔助育種與藥性成分分析奠定基礎。戰(zhàn)晴晴等［57］采用ISSR的方法構建了北柴胡（Bupleurum chinese）的遺傳圖譜，從30條引物中篩選出了28條ISSR引物，共擴增出154條多態(tài)性條帶，每條引物能擴增出2-8條多態(tài)性條帶，初步構建出了北柴胡（B. chinese）的遺傳圖譜，該圖譜為北柴胡性狀基因定位以及分子標記輔助選擇育種等研究奠定了基礎。楊紅兵等［58］采用ISSR分子標記技術對湖北恩施產(chǎn)的厚樸（Magnolia officinalis）進行了遺傳圖譜的構建。Feng 等［59］以金釵石斛（D.nobile）和細莖石斛（D.moniliforme）為親本得到F1代群體的90個單株，利用RAPD和ISSR分子標記進行基因連鎖分析，構建雙親遺傳圖譜。石斛遺傳圖譜的構建與研究為石斛藥用和園藝性狀基因的定位和分子標記輔助選擇育種計劃提供重要依據(jù)。以上說明利用ISSR標記進行遺傳圖譜的構建可行且有效的。

2 存在問題及應用前景

我國藥用植物種質資源非常豐富，但藥用植物在開發(fā)利用過程中存在種類和數(shù)量不清、種質資源難保存、野生資源遭受嚴重破壞、人工栽培品種品質退化等問題，嚴重制約了產(chǎn)業(yè)發(fā)展。對藥用植物資源研究的最終目的在于優(yōu)良品種的選育，生產(chǎn)優(yōu)質中藥材，而育種上的突破性的發(fā)展主要依靠DNA分子水平研究的進展。目前ISSR分子標記在藥用植物研究上存在著一定的局限性，一方面作為DNA分子標記技術與藥用植物其他方面研究的結合還未展開；另一方面此分子技術對實驗人員的技術要求比較高，而且在后期實驗數(shù)據(jù)的軟件分析中缺乏統(tǒng)一標準，因此ISSR分子標記技術在生產(chǎn)廣泛推廣應用上受到限制。

ISSR分子標記在生物學上最常見的應用是分析和評估種群間的親緣關系及其遺傳多樣性，因其引物的通用性ISSR技術可適用于世界上任何物種。由于且擴增譜帶多為顯性、呈Mendel式遺傳［60］，無法區(qū)分純合子和雜合子，故其在種質材料的基因型判斷，解決交配系統(tǒng)、計算雜合度和父系分析問題上存在明顯不足［61］。但與傳統(tǒng)的形態(tài)學及細胞學標記方法相比，ISSR分子標記不僅可以直接從基因水平檢測藥用植物分子結構上的變異、反映研究材料本質上的差異、鑒定瀕危藥用植物，還可以在親緣關系研究、瀕危物種的保護、品種鑒定、資源評價等方面為藥用植物研究進行了完善和補充，為藥用植物提供了新的研究思路［62-66］。雖然中國擁有世界上豐富的藥用植物種質資源和長久的栽培史，但有關中藥種質資源基因水平的研究尚且不足。隨著分子雜交育種技術的不斷改良，新品種的出現(xiàn)，目前某個單獨的標記技術已不足以滿足所有物種的鑒定與分析，多種分子標記技術的組合應用可以明顯用于提高物種的鑒別能力，研究工作者應該針對不同目的、不同物種、不同要求而有所選擇。為了更好地研究我國中藥資源的遺傳多樣性和藥材道地性，保護有限的中藥資源，并對其進行合理的開發(fā)利用，中藥研究者應積極借鑒ISSR分子標記在其他作物成功應用的經(jīng)驗，并根據(jù)不同的研究目的與對象將其與其它多種分子標記技術相結合，全面的、科學的對野生中藥資源的遺傳多樣性和遺傳結構進行研究［67］，從而加快藥用植物資源的分子水平研究的步伐，促進藥用植物種質資源發(fā)揮更大的作用。

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（責任編輯 狄艷紅）

Application and Research Progress of Inter-simple Sequence Repeat（ISSR）Marker in Medicinal Plants

REN Meng-yun1，2CHEN Yan-jun2ZHANG Dun2DU Le-shan1LIU Fang1GUAN Xiao1ZHANG Yin-dong2
（1. Chinese Research Academy of Environmental Sciences，Beijing 100012；2. College of Agronomy，Hainan University，Haikou 570228）

Inter-simple sequence repeat（ISSR）has been known as a novel molecular maker technology based on simple sequence repeat（SSR）. At present，the research and development of medicinal plants are facing the problems such as unclear drug substance，uncontrollable quality and exhausted resources. DNA molecular marker technology，especially ISSR，has provided a new solution for the above problems. Comparing the merits and demerits of several commonly used molecular markers，finally，we mainly introduced the principles and characteristics of DNA molecular marker ISSR applied in current research of the medicinal plants，and summarized the new advances on ISSR molecular technology and its application prospective in the genetic diversity and structure of medicinal plants，identification of germplasm resources，quality identification of traditional Chinese medicine，and genetic map，aiming at providing better reference for the development and utilization of medicinal plants.

ISSR；molecular makers；medicinal plant；quality identification；genetic map

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.008

2016-11-02

環(huán)境保護部生物多樣性保護專項（2096001006）

任夢云，女，博士，研究方向：遺傳資源分子生物學；E-mail：renmengyun@163.com

關瀟，女，博士，副研究員，研究方向：遺傳資源與生物安全；E-mail：cynthia815@126.com張銀東，男，教授，博士生導師，研究方向：分子生物學；E-mail：23300558@163.com