劉良琴，龔小見，*，周欣，趙超，陳華國

（1.貴州師范大學(xué)貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護重點實驗室，貴州貴陽550001；2.貴州師范大學(xué)貴州省藥物質(zhì)量控制及評價技術(shù)工程實驗室，貴州貴陽550001；3.貴州師范大學(xué)天然藥物質(zhì)量控制研究中心，貴州貴陽550001）

響應(yīng)面法優(yōu)化靈芝紅茶的制作工藝

劉良琴1，2，3，龔小見1，2，3，*，周欣1，2，3，趙超1，2，3，陳華國1，2，3

（1.貴州師范大學(xué)貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護重點實驗室，貴州貴陽550001；2.貴州師范大學(xué)貴州省藥物質(zhì)量控制及評價技術(shù)工程實驗室，貴州貴陽550001；3.貴州師范大學(xué)天然藥物質(zhì)量控制研究中心，貴州貴陽550001）

為系統(tǒng)地探究靈芝紅茶的制作工藝，采用靈芝提取物和遵義頂級紅茶為主要原料，以感官評價為主要評價指標，以單因素試驗研究靈芝提取物用量、烘烤溫度、烘烤時間對靈芝紅茶得分的影響，采用響應(yīng)面分析法和Box-Behnken試驗優(yōu)化靈芝紅茶的最佳工藝參數(shù)，同時對靈芝紅茶中主要活性成分茶多酚和多糖的含量進行測定。結(jié)果顯示：靈芝提取物用量為0.93 g，烘烤溫度為79℃，烘烤時間為61min，以此工藝制備的靈芝紅茶在響應(yīng)面法中感官評價得分預(yù)測最大值為87.2，實測值為86.1。靈芝紅茶產(chǎn)品中茶多酚含量為136.0mg/g，多糖含量為36.39mg/g，水分含量為5.38%。靈芝紅茶產(chǎn)品外形優(yōu)美，色澤烏潤均勻，口感醇厚，具有靈芝甜香與紅茶的混合香味。

靈芝紅茶；工藝；Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化；茶多酚；多糖

靈芝[Ganoderma lucidum（Fr.）Karst]為擔子菌門（Basidiomycota）擔子菌綱（Basidiomyce-tes）多孔菌科（Polyporaceae）靈芝屬（Ganoderma）的一種藥用真菌[1]，又稱“靈芝草”、“仙草”、“瑞草”，也叫長生草、靈草、還魂草，在我國有悠久的藥用歷史。我國古人認為靈芝是一種超自然的神藥仙草，其實靈芝在自然界中廣泛存在?！侗静菥V目》中記載，靈芝“甘溫?zé)o毒，主治耳聾，利關(guān)節(jié)，保神，益精氣，堅筋骨，好顏色，療虛勞，治痔”。現(xiàn)代研究表明，靈芝具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗衰老、提高機體耐缺氧能力[2-3]等活性。因此，靈芝相關(guān)的產(chǎn)品越來越受到人們的青睞。

茶是我國的一種傳統(tǒng)飲品，具有低糖、低脂、低熱量和天然無污染的特點，有減肥、保護腸道、提神消疲、降血脂、防止血管硬化、利尿排毒、防輻射、抗衰老、抗腫瘤、抗菌[4-7]等功效。茶葉本身就是一種很好的天然保健飲料，一直深受世人的喜愛，具有深入開發(fā)的基礎(chǔ)。

靈芝紅茶是以赤芝[Ganoderma lucidum（Leyss.Fr.）Karst.]和紅茶為原料生產(chǎn)的一種具有保健功能的飲品，同時具有靈芝和紅茶的保健功效。但是目前市場上的靈芝紅茶的生產(chǎn)工藝比較粗放，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定。因此本研究運用單因素及響應(yīng)面設(shè)計的方法[8]，對靈芝紅茶的生產(chǎn)工藝進行系統(tǒng)的探究和優(yōu)化，以感官評價[9]作為考察指標最終確定靈芝紅茶的最佳制作工藝，并對靈芝紅茶中活性成分茶多酚和多糖的含量進行測定，以期為靈芝紅茶工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1材料

1.1試材

赤芝、紅茶：貴州高山黔靈原生態(tài)健康品有限公司；水：娃哈哈桶裝水；沒食子酸、無水葡萄糖（純度≥98%）：貴州迪大生物科技有限公司；福林酚：上海藍季科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2儀器

AL 204萬分之一分析天平、XS 105十萬分之一分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；101-2 AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；TD5M低速多管架自動平衡離心機：長沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司；SPECTRAmax PLUS 384光吸收酶標儀：美國分子儀器公司MolecularDevices。

2方法

2.1靈芝提取物的制備工藝流程

2.3茶葉復(fù)火

據(jù)以往實踐經(jīng)驗，在靈芝紅茶配制前，先將8 g茶坯在100℃溫度烘烤1 h，將茶坯含水量控制在3%以下，這樣茶條才能把靈芝提取物溶液充分吸附在茶條內(nèi)外，盡可能保持原茶葉耐沖泡的特點。

2.4試驗設(shè)計

以靈芝提取物、紅茶為主要原料，通過單因素實驗初步確定靈芝紅茶生產(chǎn)工藝優(yōu)化范圍，然后采用Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化法，以感官評價為考察指標確定靈芝紅茶最佳的制作工藝。

2.5評定方法

2.5.1感官評價方法

取茶葉按照1∶60（質(zhì)量比）的比例加水沖泡。選取感官評價員10名，根據(jù)感官評價表對靈芝紅茶產(chǎn)品進行評分，感官評定指標及評定方法見表1。

表1 感官評價表Table1 Organoleptic evaluation

2.5.2理化成分的測定

茶多酚的含量測定：精密稱取靈芝紅茶樣品0.2 g，加入50%的乙醇5.0mL，超聲提取30min，離心取上清液。重復(fù)提取兩次，合并提取液并定容到10mL。以Folin-Ciocalteu法[10]測定茶多酚含量，以沒食子酸為標準，計算茶多酚含量。

總多糖的含量測定：精密稱取靈芝紅茶樣品0.5 g，加入5.0mL水，在80℃下超聲提取40min，離心取上清液。重復(fù)提取兩次，合并提取液，加入無水乙醇使乙醇的體積分數(shù)達到80%，于4℃下醇沉24 h后，離心，傾去上清液。沉淀加水溶解轉(zhuǎn)移到10mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻。以苯酚-硫酸法[11]測定多糖含量，以葡萄糖為標準，計算總多糖含量。

2.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

文中數(shù)據(jù)處理采用Design-Expert8.0.6和Office 2013軟件。

3結(jié)果與分析

3.1靈芝紅茶制作工藝的單因素試驗

3.1.1靈芝提取物用量考察

靈芝提取物用量明顯影響靈芝紅茶的風(fēng)味，用量過多導(dǎo)致靈芝紅茶后苦味過重，適口性較差。因此，以單因素試驗對靈芝提取物用量進行考察，并對其進行感官評定。固定烘烤溫度100℃、烘烤時間60min的條件下，考察靈芝提取物用量分別為0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 g。如表2所示，隨著靈芝提取物用量的增加，得分逐漸提高；當靈芝提取物用量超過1.00 g時，得分開始降低。因此，最佳靈芝提取物用量為1.00 g。

表2 靈芝提取物用量的確定Table2 Determ ination of contentof Ganoderma lucidum extract

3.1.2烘烤溫度的考察

烘烤溫度的高低會影響茶葉的口感以及外形的勻整度，進而影響茶汁的澄清度和葉底的觀感。因此，以單因素試驗對烘烤溫度進行考察，固定靈芝提取物用量1.00 g、烘烤時間60min的條件下，考察烘烤溫度分別為50、60、70、80、90、100℃，結(jié)果如表3所示。

表3 烘烤溫度的確定Table3 Determ ination of baking tem perature

由表3可知，隨著烘烤溫度的上升，得分逐漸提高；當烘烤溫度超80℃時，得分趨于平緩。因此，最佳烘烤溫度為80℃。

3.1.3烘烤時間考察

烘烤時間的長短直接決定靈芝紅茶香味以及含水量的高低等。因此，以單因素實驗對烘烤時間進行考察，固定靈芝提取物用量1.00 g、烘烤溫度80℃的條件下，考察烘烤時間分別為30、40、50、60、70、80min，結(jié)果如表4所示。

由表4可知，隨著烘烤時間的增加，得分逐漸提高；當烘烤時間超60min時，得分趨于平緩。因此，最佳烘烤時間為60min。

表4 烘烤時間的確定Table4 Determ ination of baking tim e

3.2響應(yīng)面試驗設(shè)計優(yōu)化分析

3.2.1回歸方程的建立及方差分析

根據(jù)單因素試驗的考察結(jié)果，發(fā)現(xiàn)靈芝提取物用量、烘烤溫度和烘烤時間都會對靈芝紅茶品質(zhì)產(chǎn)生重要影響，并且確定了大致的優(yōu)化范圍。因此以感官評價為因變量，選取靈芝提取物用量（A）、烘烤時間（B）和烘烤溫度（C）3個因素為自變量，設(shè)計了三因素三水平二次回歸方程來擬合因素和指標（響應(yīng)值）之間的函數(shù)關(guān)系，采用Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化的方法尋求最優(yōu)的制作工藝。試驗設(shè)計與結(jié)果分析如表5、表6、表7所示。

表5 響應(yīng)面分析因子及水平表Table5 Factor and level in response surfaceanalysis

表6 響應(yīng)面分析方案及試驗結(jié)果Table6 Experimental resultsof response surfaceanalysis

續(xù)表6響應(yīng)面分析方案及試驗結(jié)果Continue table6 Experim ental resultsof response surfaceanalysis

表7 試驗結(jié)果方差分析Table7 Statisticalanalysisof three factorswith three levels

試驗結(jié)果釆用Design-Expert8.0.6軟件的ANOVA程序，進行二次回歸分析，得到靈芝紅茶感官評價（R1）與影響因素自變量靈芝提取物用量（A）、烘烤時間（B）和烘烤溫度（C）的二次多項回歸方程為：R1=+ 86.87-1.48A+1.47B-1.39C-4.20AB+2.96AC+4.85BC-3.79A2-12.25B2-9.77C2。

由表7可得，模型P值0.000 1＜0.05（顯著），失擬項P值0.056 5＞0.05（不顯著），R2=0.992 7，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.983 3，表明模型在研究的整個回歸區(qū)域內(nèi)模型擬合較好且自變量與響應(yīng)值線性關(guān)系顯著。由回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果可得知：靈芝提取物用量、烘烤時間、烘烤溫度的二次項及交互項的P值均小于0.01，說明對靈芝紅茶感官評價得分的影響極顯著。影響靈芝紅茶感官評價的主次因素排列順序為靈芝提取物用量＞烘烤時間＞烘烤溫度。

3.2.2響應(yīng)面分析及優(yōu)化

通過design-expert8.0.6軟件進行二次多元擬合得出響應(yīng)面3D圖及對應(yīng)的等高線分析圖，在固定其他因素水平值的情況下觀察各因素間的交互作用對靈芝紅茶得分的影響，所得響應(yīng)面如圖1、圖2、圖3所示。圖1（B），2（B），3（B）中等高線都為橢圓形，說明3個因素間都有較強的交互作用。

圖1 靈芝提取物用量及烘烤時間交互的響應(yīng)面（A）及等高線（B）Fig.1 Responsesurfaceand contoursof interaction between the contentof Ganoderma lucidum extractand Baking tim e

3.2.3驗證試驗

圖2 靈芝提取物用量及烘烤溫度交互的響應(yīng)面（A）及等高線（B）Fig.2 Response surfaceand contoursof interaction between the contentof Ganoderma lucidum extractand baking temperature

圖3 烘烤時間及烘烤溫度交互的響應(yīng)面（A）及等高線（B）Fig.3 Response surfaceand contoursof interaction between baking timeand baking temperature

通過試驗?zāi)Ｐ头治觯玫筋A(yù)測最優(yōu)工藝條件為靈芝提取物用量為0.93 g，烘烤溫度為79.08℃，烘烤時間為60.90min。將最優(yōu)工藝條件調(diào)整為靈芝提取物用量為0.93 g，烘烤溫度為79℃，烘烤時間為61min。取紅茶8 g，按照上述工藝條件，重復(fù)3次試驗，靈芝紅茶感官評價得分為86.1，靈芝紅茶感官評價預(yù)測分數(shù)為87.2，實測值與模擬預(yù)測值的差值為1.26%，且變異系數(shù)為1.65%，由此驗證了模型的合理性和可靠性。

4結(jié)論

利用實驗設(shè)計軟件Design-Expert8.0.6，以單因素結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化的方法，以感官評價為主要評價標準，通過二次回歸設(shè)計得到了靈芝紅茶最佳的制作工藝條件為靈芝提取物用量為0.93 g，烘烤時間為61min，烘烤溫度為79℃。以此工藝制備的靈芝紅茶在響應(yīng)面法中感官評價得分預(yù)測值為87.2，實測值為86.1。產(chǎn)品外形優(yōu)美，色澤烏潤均勻，靈芝提取物與紅茶混合均勻，苦味適中，口感較好，具有靈芝甜香與紅茶的混合香味。此工藝下制備的靈芝紅茶中總多酚含量為136.0mg/g，總多糖含量為36.39mg/g，水分含量為5.38%；市售的靈芝紅茶中總多酚含量為124.8mg/g，總多糖含量為25.37mg/g，水分含量為8.39%。優(yōu)化后的靈芝紅茶中多糖含量高于市售的靈芝紅茶，說明經(jīng)過優(yōu)化后靈芝紅茶的產(chǎn)品質(zhì)量有所提升。靈芝紅茶制作工藝的研究，對用靈芝紅茶工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定依據(jù)。

[1]李燕,趙燕宜,于海平,等.中華人民共和國藥典[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:188-189

[2]王杰,伍萬榮,何云霞,等.靈芝的醫(yī)療及保健作用(綜述)[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1996,23(2):227-229

[3]Isabel C F R Ferreira,Sandrina A Heleno,Filipa S Reis,et al. Chemical features of Ganoderma polysaccharideswith antioxidant, antitumor and antimicrobial activities[J].Phytochemistry,2015, 114:38-55

[4]刁飛燕.普洱茶與其它茶葉保健功效的比較及與儲存時間的相關(guān)性研究[D].濟南:山東大學(xué),2008

[5]梁勇,邵宛芳,黃業(yè)偉,等.云南綠茶抗疲勞作用研究[J].食品工業(yè)科技,2011,32(1):271-276

[6]李怡彬,陳君琛,沈恒勝,等.靈芝白茶功能飲料研制及其抗氧化活性評價[J].食品科學(xué),2012,33(2):89-93

[7]廖惠珍,朱萍萍,謝炳林.綠茶對胃癌癌前高危因素及癌細胞增殖的干預(yù)作用研究[J].中國公共衛(wèi)生學(xué)報,1997,16(1):1-3

[8]靳靖,魏春燕,吳聰,等.代可可脂花生夾心糖制作工藝優(yōu)化[J].食品科學(xué),2012,33(8):334-338

[9]魏明香,張穎彬,唐德松,等.不同產(chǎn)區(qū)大宗綠茶感官品質(zhì)分析比較研究[J].茶葉科學(xué),2014,34(1):55-62

[10]劉麗香,Tanguy Laura,梁興飛,等.Folin-Ciocalteu比色法測定苦丁茶中多酚含量[J].茶葉科學(xué),2008,28(2):101-106

[11]張志軍,劉建華,李淑芳,等.靈芝多糖含量的苯酚硫酸法檢測研究[J].食品工業(yè)科技,2006,27(2):193-195

Response Surface M ethodology App lied in the Optim ization of Ganoderma lucidum Black Tea M anufacture

LIU Liang-qin1，2，3，GONGXiao-jian1，2，3，*，ZHOUXin1，2，3，ZHAOChao1，2，3，CHENHua-guo1，2，3
（1.Key Laboratory for Information System ofMountainousAreasand Protection of EcologicalEnvironment，Guizhou NormalUniversity，Guiyang550001，Guizhou，China；2.Guizhou Engineering Laboratory forQuality Control&Evaluation TechnologyofMedicine，Guizhou NormalUniversity，Guiyang550001，Guizhou，China；3.TheResearch Center forQuality ControlofNaturalMedicine，Guizhou NormalUniversity，Guiyang550001，Guizhou，China）

To systematically optimize themanufacture of Ganoderma lucidum black tea，Ganoderma lucidum and top black teaof Zunyiwasused as the rawmaterial.By settingsensory evaluation as the criteria，the formula was preliminarily determined by using the single factor testand thenwas further optimized by Box-Behnken design and response surfacemethodology，and determinated the contentof themain active ingredient in Ganoderma lucidum black tea products.The optimized conditionsas follow：The contentof Ganoderma lucidum extract was 0.93 g，baking temperature 79℃，bake for 61min.The sensory score of Ganoderma lucidum black tea made by using this optimal formula was 86.1，approximating to the predicted value of 87.2.Content of tea polyphenol and polysaccharide in Ganoderma lucidum black tea was 136.0 mg/g，36.39 mg/g respectively，moisture contentof5.38%.This productshowed appearance exquisite，colour lustre，tastemellow，sweetness with Ganoderma lucidum mixedwith black teaaroma.

Ganoderma lucidum black tea；manufacture；Box-Behnken design and response surface；tea polyphenols；polysaccharides

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.022

2016-11-22

貴州省貴州師范大學(xué)研究生創(chuàng)新基金項目（研創(chuàng)2015021號）；貴州省中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)研究開發(fā)專項項目（黔科合中藥字[2013]5001號）；貴州省高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)項目（黔科合人才（2015）4033號）

劉良琴（1991—），女（漢），碩士研究生，研究方向：藥用植物開發(fā)與利用。

*通信作者：龔小見，副教授，碩士生導(dǎo)師。