朱德艷

（荊楚理工學院生物工程學院，湖北荊門448000）

大孔樹脂輔助從葛根中提取葛根素的工藝研究

朱德艷

（荊楚理工學院生物工程學院，湖北荊門448000）

以葛根為原料，采取大孔樹脂輔助提取葛根素。利用單因素試驗和正交試驗優(yōu)化工藝條件。試驗結果表明：選擇大孔樹脂D101型號，葛根與大孔樹脂質量比為1∶5，采用濃度為70%的乙醇洗脫，洗脫速度設置為3mL/min時，葛根素的提取率可達1.308%。

葛根素；大孔樹脂；提?。徽辉O計

葛根作為保健食品、功能食品已成當今世界主要發(fā)展方向，葛根素類食品已成為世界認可的保健營養(yǎng)品。以葛根為原料分離出來的淀粉和黃酮物質，可制成防治高血壓、高血脂、冠心病、糖尿病等功能的清熱解毒食品。

葛根素是葛根中的主要活性成分之一，屬于黃酮類化合物，化學名為8-β-D-葡萄吡喃糖-4'，7-二羥基異黃酮，分子式為C21H20O9，相對分子質量為416.38。高含量為白色針狀結晶粉末，低含量為棕色粉末。在水和有機溶劑中溶解度都不大，加熱可溶于水、甲醇、乙醇，但不溶于乙醇乙酯、氯仿、苯。葛根素在臨床及保健方面具有很高的利用價值，具有降低血壓，減慢心率，降低心肌耗氧量，提高學習記憶能力。在臨床上對面運動神經元有保護作用，并且可促進正常人和腫瘤病人的淋巴細胞轉化，對干擾素系統(tǒng)有明顯的刺激和誘生作用[1-3]。因此中國于1993年批準葛根素注射液作為新藥用于臨床治療心腦血管疾病[4]。因此，葛根素作為新型的天然功效因子，在食品工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、日用化工工業(yè)等方面具有重要的作用。

大孔吸附樹脂是一種具有多孔立體結構人工合成的聚合物吸附劑，是在離子交換劑和其它吸附劑應用基礎上發(fā)展起來的一類新型樹脂，主要依靠它和吸附的分子（吸附質）之間的范德華引力，進行物理吸附而達到分離純化目的[5]。用大孔樹脂輔助從葛根中提取葛根素可以充分利用大孔吸附樹脂物理吸附這一特點，既不改變葛根素的理化性質和結構，也可以高效地達到純化分離葛根素的目的。

本研究采用大孔樹脂輔助從葛根中提取葛根素，研究了5種不同型號的大孔樹脂、葛根與大孔樹脂的質量比以及洗脫液乙醇的濃度、洗脫速度對葛根素得率的影響，在進行單因素試驗的基礎上，設計正交試驗，對提取工藝進行優(yōu)化，探尋大孔樹脂輔助超聲波法從葛根中提取葛根素的最佳工藝條件。

1材料與方法

1.1材料

葛根：來自湖北省仙之靈有限公司，自然晾干，粉碎；葛根素標準品：購于中國藥品生物制品檢定所；HCl、氫氧化鈉：分析純，天津市福晨化學試劑廠；D101、AB-8、DM130、HPD100、HPD600大孔樹脂：分析純，鄭州勤實科技有限公司；乙醇：分析純。

1.2主要設備

電子天平：上海上天精密儀器有限公司；DH-600型電熱恒溫培養(yǎng)箱：北京科偉永興儀器有限公司；SHZ-DⅢ循環(huán)水式多用真空泵：上海予華儀器設備有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精密實驗設備有限公司；KQ-100KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；TU-1901雙光束紫外可見光分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；層析柱：上海亞榮生化儀器廠。

1.3方法

1.3.1葛根素標準曲線的繪制

準確稱取葛根素標準品4.04mg，加70%乙醇溶解并稀釋至50mL，搖勻。精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL分別置于10mL容量瓶中，各加70%乙醇2mL，再加蒸餾水定容至10mL，搖勻。以2mL 70%的乙醇加蒸餾水至10mL作空白對照，在250 nm波長處測定吸收度，得標準曲線[6-7]。

以葛根素質量濃度（mg/mL）為橫坐標（X）、吸光度為縱坐標（Y），繪制標準曲線[8]。得到回歸方程為Y= 1.089X-0.020 8，R2=0.995 7[9]。

1.3.2樣品中葛根素含量的測定

取適量的待測樣品，置于圓底燒瓶中，按照1∶3（g/ mL）加入70%乙醇，80℃水浴回流1 h后，過濾，濾渣重復上述操作1次，濾液合并，作為供樣品溶液待測。取待測樣品溶液1mL置于10mL容量瓶中，加2mL 70%的乙醇，用蒸餾水定容至10mL，250 nm波長處測定吸收度。參照1.3.1中繪制的標準曲線計算樣品液中葛根素的濃度C[10]。黃酮提取率計算公式如下：

式中：V為葛根素提取液的體積，mL；M為葛根樣品質量，g。

1.3.3大孔樹脂的預處理

分別稱取大孔樹脂D101、AB-8、DM130、HPD100、HPD600各25 g，用1mol/L的NaOH洗滌2 h，過濾后清洗至濾液呈中性，再用1mol/L的HCl洗滌2 h，過濾，清洗至濾液呈中性，純凈水浸泡備用。

1.3.4葛根素的提取工藝

取新鮮葛根，切碎，在電熱恒溫培養(yǎng)箱中60℃烘干。干燥后的葛根冷卻至室溫后，用粉碎機磨成粉末，并置于密閉玻璃瓶中，低溫避光保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取干燥的葛根粉末5.0g于錐形瓶中，加入20mL 70%的乙醇，在頻率16 kHz下超聲提取40min，靜置10min后過濾，收集上清液，加入預處理好的大孔樹脂浸泡12 h后裝柱，用乙醇作為洗脫劑，考察大孔樹脂的型號、葛根與樹脂質量比、洗脫劑濃度與洗脫速度對葛根素提取率的影響。

1.3.5單因素試驗

大孔樹脂型號的確定：稱取大孔樹脂D101、AB-8、DM130、HPD100、HPD600各25 g，采用濃度為70%的乙醇，3mL/min進行洗脫，收集合并洗脫液，250 nm處測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算葛根素的提取率。

葛根與樹脂質量比的確定：選擇葛根和大孔樹脂（D101）質量比分別為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6，用濃度為70%的乙醇作為洗脫劑，洗脫流速3mL/min，收集合并洗脫液，用雙光束紫外可見分光光度計在250 nm處測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算葛根素的提取率。

乙醇濃度的確定：稱取預處理好的D101大孔樹脂25 g加入上清液，浸泡12 h后裝柱，選擇濃度為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇作為洗脫液，洗脫流速3mL/min，收集合并洗脫液，用雙光束紫外可見分光光度計在250 nm處測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算葛根素的提取率。

洗脫速度的確定：稱取預處理好的D101大孔樹脂25 g加入上清液，浸泡12 h后裝柱，以濃度為70%的乙醇作為洗脫液，選擇速度為1、2、3、4mL/min進行洗脫，收集合并洗脫液，用雙光束紫外可見分光光度計在250 nm處測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算葛根素的提取率。

1.3.6正交試驗

為探尋大孔樹脂輔助從葛根中提取葛根素的最佳條件，在單因素試驗的基礎上，選擇大孔樹脂的型號、葛根與樹脂質量比、洗脫劑濃度與洗脫速度作為4個考察因素，以葛根素的提取率為指標，設計L9（34）正交試驗來優(yōu)化大孔樹脂輔助從葛根中提取葛根素的條件，因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table1 Factorsand levelsin orthogonalarray design

2結果與分析

2.1單基因試驗

2.1.1樹脂的型號對葛根素提取率的影響

葛根超聲波浸提40min后，過濾后取上清液，加入大孔樹脂D101、AB-8、DM130、HPD100、HPD600各25 g，浸泡12 h后裝柱，用濃度為70%的乙醇作為洗脫劑，洗脫流速3mL/min，收集合并洗脫液，用雙光束紫外可見分光光度計在250 nm處測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算葛根素的提取率。提取率如下柱形圖2。

圖1 5種型號的樹脂對葛根素提取率的影響Fig.1 Theeffectsof 5 typesof resin on puerarin

由圖1可看出，5種大孔樹脂在相同條件下對葛根素的吸附能力有較大的差異，其中使用D101大孔樹脂使得葛根素提取率明顯高于其他4種，因此初步選定D101樹脂輔助提取葛根素。

2.1.2大孔樹脂的量對葛根素提取率的影響

選用D101型號的大孔樹脂，葛根和大孔樹脂質量比分別為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6的條件下輔助提取葛根素，提取率如圖2。

由圖2可看出，當大孔樹脂的量不斷增加時，葛根素提取率也在增加，但隨著大孔樹脂的量繼續(xù)增加時，葛根素提取率增加的幅度不大，為了節(jié)約成本，故確定選用5倍質量的大孔樹脂來吸附提取葛根素。

2.1.3乙醇濃度對葛根素提取率的影響

稱取預處理好的D101大孔樹脂25 g加入上清液，浸泡12 h后裝柱，洗脫液乙醇的濃度設置為40%、50%、60%、70%、80%，洗脫速度為3mL/min，輔助提取葛根素，提取率如圖3。

圖3 乙醇濃度對葛根素提取率的影響Fig.3 Theeffectsof ethanolconcentration on puerarin

根據(jù)圖3可知，乙醇濃度為40%～70%時，隨著濃度不斷的增加，葛根素的提取率也在不斷提高，而乙醇濃度高于70%時，隨著濃度的增加，葛根細胞中的脂溶性物質也會漸漸增加溶出量，非提取物的溶出，干擾因素增加，提取率反而下降，故乙醇濃度為70%時提取率最高。

2.1.4洗脫速度對葛根素提取率的影響

稱取預處理好的D101大孔樹脂25 g加入上清液，浸泡12 h后裝柱，洗脫液乙醇的濃度為70%，洗脫速度設置為1、2、3、4mL/min，輔助提取葛根素，提取率如圖4。

圖4 洗脫速度對葛根素提取率的影響Fig.4 Theeffectsofelution speed on puerarin

根據(jù)圖4可知，洗脫速度越低，葛根素的提取率越高；隨著洗脫速度的加快，提取率降低。但是如果洗脫速度低，洗脫的時間就會延長，從而增加生產的成本，因此要選擇合適的洗脫速度也是一個重要的關鍵點。

2.2正交試驗優(yōu)化葛根素的提取條件

通過對單因素試驗結果的分析，為了得到大孔樹脂輔助從葛根中提取葛根素的最佳工藝，故考察各個因素水平及他們之間的相互作用，設計L9（34）進行四因素三水平的正交試驗，結果見表2。

由表2可看出，由于極差RD＞RC＞RA＞RB，所以影響葛根素提取率的4個因素中依照強弱順序依次是：D＞C＞A＞B，即洗脫速度＞乙醇濃度＞大孔樹脂型號＞葛根與大孔樹脂質量比，其中洗脫速度對葛根素的提取率影響最大提取葛根素的最優(yōu)組合為A3B2C1D3，即：采用D101型號的大孔樹脂，葛根與大孔樹脂質量比為1∶5，采用濃度為70%的乙醇洗脫，洗脫速度設置為3mL/min。在最佳條件下進行驗證試驗，葛根素的提取率為1.308%。本試驗中使用SPSS軟件對所得的結果進行方差分析，見表3。

表2 L9（34）正交試驗結果分析Table2 Orthogonalarray design and corresponding experimental results

表3 正交試驗方差分析Table3 Varianceanalysisof orthogonalexperiment

結果顯示因素A、B、C和D都對葛根素提取率有顯著的影響，4個因素對葛根素提取的影響主次順序為D＞C＞A＞B，與直觀分析中極差大小順序一致。

3結論

大孔樹脂輔助提取葛根素的工藝最佳參數(shù)為大孔樹脂型號為D101、葛根與大孔樹脂的質量比為1∶5，洗脫液乙醇濃度為70%、洗脫速度為3mL/min，在此條件下，其葛根素的提取率為可達到1.308%。影響葛根素提取效果的主次順序是洗脫速度＞乙醇濃度＞大孔樹脂型號＞葛根與大孔樹脂質量比。

隨著新科學技術的不斷崛起，對葛根素分離純化的工藝也越來越多，并且產率也逐漸有所提高。但是目前的很多提取方法仍有很多不足的地方，例如，提取率低，提取的葛根素純度不高，資源的浪費等。大孔樹脂廣泛用于中藥成分的分離純化，在使用過程中可以充分利用其物理吸附這一特點，不改變中藥成分的理化性質和結構，可以達到高效地純化生物活性物質的分離的目的[11]。大孔樹脂的吸附作用還可以結合傳統(tǒng)中醫(yī)理論和現(xiàn)代化的提取、分離純化、制劑工藝學[12-13]，改進生物活性物質的生物利用度，從而增強其療效。大孔樹脂輔助提取葛根素，設備要求低，操作簡單，可為大規(guī)模工業(yè)生產提供依據(jù)。

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Study on the Technology of Extracting Puerarin from Pueraria radix by M acroreticular Resin

ZHUDe-yan
（CollegeofBioengineering，Jingchu University of Technology，Jingmen 448000，Hubei，China）

Theextractof the Pueraria radix wereused as the rawmaterial to purify puerarinwithmacroreticular resin，based on single factor and orthogonal experiments，extraction purification condition was optimized.The resultsshowed that theoptimum condition aremacroreticular resin D101，Radix Pueraria tomacroreticular resin 1∶5，ethanol concentration 70%，elution speed 3mL/min.Under the optimized conditions，the extraction yield ofpuerarin isup to1.308%.

puerarin；macroreticular resin；extraction；orthogonal test

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.016

2016-06-17

荊楚理工學院湖北省新農村發(fā)展研究院項目（Z201404）

朱德艷（1977—），女（漢），副教授，碩士，研究方向：生物制藥技術。