占衛(wèi)紅，吳啟航，趙隆麒，王心倩，孫 妍，余曉麗

(武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

結(jié)核分枝桿菌Rv2181T、B細胞表位預(yù)測及分析

占衛(wèi)紅，吳啟航，趙隆麒，王心倩，孫 妍，余曉麗

(武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

預(yù)測和分析結(jié)核分枝桿菌Rv2181抗原的T細胞表位和B淋巴抗原表位的分布狀況。首先從NCBI中得到蛋白的氨基酸序列，接著通過BLAST將人類蛋白和得到的序列進行同源性分析，使用SYFPEITHI對MTB中Rv2181蛋白的T淋巴細胞抗原表位，取得分在前2%的多肽作為優(yōu)勢抗原，然后用NETCTL、NetMHC和BIMAS等數(shù)據(jù)庫預(yù)測抗原CD8+T和CD4+T細胞表位，綜合結(jié)果篩選出優(yōu)勢肽段。利用Protean預(yù)測到的B細胞抗原表位，再根據(jù)IEDB、ABCpred、Bcepred等數(shù)據(jù)庫預(yù)測，排除α-螺旋、β-折疊內(nèi)不易形成表位的序列，將位于β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲處的表位確定為優(yōu)勢表位。通過預(yù)測、分析，篩選出Rv2181抗原CD4+T細胞表位中強結(jié)合表位120個，弱結(jié)合表位495個，綜合CD4、8+T的預(yù)測，最終篩選出1個優(yōu)勢表位肽段,確定7條優(yōu)勢的B細胞抗原表位區(qū)域。預(yù)測T、B細胞候選表位為結(jié)核病診斷和治療有重要價值。

結(jié)核分枝桿菌；Rv2181；T細胞；B細胞；表位分析

1 引言

一個世紀以來，結(jié)核病作為一種對人類的生命安全具有嚴重威脅的傳染病，越來越多的人開始關(guān)注它對人類造成的健康問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計,有860萬人感染,130萬人死于這種疾病[1]。近年來，通過研究人員的辛勤探索和不斷追尋，結(jié)核病的檢測手段和與它相關(guān)的抗結(jié)核藥物都在日新月異的變換著，但是加強對結(jié)核病診斷以及開發(fā)新的、有效的抗結(jié)核疫苗依舊是結(jié)核病研究的熱點。目前，卡介苗(BCG)是唯一一種較為廣泛用來預(yù)防結(jié)核病的疫苗，但是卡介苗只能預(yù)防幼兒肺外血源播散性結(jié)核[2],對成年人起到的的保護效力并不高[3]，甚至疫苗對部分成年人起不到保護作用,更加嚴峻的是，隨著多重耐藥的結(jié)核患者的出現(xiàn)，治好結(jié)核耐藥患者的失敗率在一般敏感性結(jié)核病高出80倍[4]。隨著生物化學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科的研究進步,發(fā)現(xiàn)有部分結(jié)核分枝桿菌的抗原可能在提高結(jié)核病診斷能力或研制新的疫苗方面具有重要作用[5]。有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌基因組的保守性相對較高,且其中的T/B細胞抗原表位序列具有更高的保守性,甚至可能在機體免疫識別過程中受益。這給我們研究和開發(fā)新的抗結(jié)核分枝桿菌疫苗帶來挑戰(zhàn),需要對相關(guān)現(xiàn)象進行更深入和系統(tǒng)的研究。

抗原表位是通過與抗體或者細胞表面的抗原受體結(jié)合而發(fā)揮免疫效應(yīng)。一個蛋白質(zhì)抗原的表位,不僅包含B細胞表位，輔助性、細胞毒性T細胞表位，還有自然殺傷細胞表位。這些與免疫識別密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)，同時也有不利于保護性免疫作用的結(jié)構(gòu)。因此篩選和鑒定蛋白抗原優(yōu)勢抗原表位對了解結(jié)核分枝桿菌的致病機制、改進免疫學(xué)診斷方法以及新型、安全的疫苗開發(fā)有重要價值[6]。

2 材料與方法

2.1 同源性分析比對

在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得MTB的Rv2181的蛋白序列(GeneID：888269、428aa) 。

在NCBI數(shù)據(jù)庫中用Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 將Rv2181的蛋白序列與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的蛋白序列進行同源比對分析。登入NCBI選擇protein Blast，然后選擇非重復(fù)蛋白序列Non-redundant protein sequences ( nr ) 數(shù)據(jù)庫，并提交Rv2181抗原序列，分析抗原序列與MTB復(fù)合群、非結(jié)核分枝桿菌以及其他細菌的同源性；然后選擇人類Human進行分析。

2.2 Rv2181抗原的CD4+T細胞表位預(yù)測

登錄NetMHCⅡpan 3.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCIIpan/),來預(yù)測MHCⅡ中的分子。選擇DRB1*0901、DRB1*1501、DRB1*0701、DRB1*1101、DRB1*0301、DRB1*0405、DPA1*0103-DPB1*0401、DPA1*0201-DPB1*0101、DQA1*0101-DQB1*0501和DQA1*0301-DQB1*0302作為HLAⅡ類分子的限定條件預(yù)測結(jié)果。根據(jù)表位多肽與HLA分子結(jié)合能力的強弱，分為較強結(jié)合(KD<50 nM)與較弱結(jié)合(KD<500 nM)[7]。

2.3 Rv2181抗原的CD8+T細胞表位預(yù)測

2.3.1 NetMHC表位預(yù)測

登錄NetMHC ⅡPAN 4.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/),該軟件可預(yù)測分析HLA-ABCE類別的MHC分子。由于多數(shù)HLA分子偏向于和九個氨基酸長度的多肽有強結(jié)合，所以選擇氨基酸長度為9個，并選擇可能性最大的HLA-A (A2)以及(A3)兩類HLA分子作為限定條件[8]。

2.3.2 SYFPEITHI表位預(yù)測

SYFPEITHI是一個主要組織相容性復(fù)合體的數(shù)據(jù)庫，可以進行針對MHC等位基因的產(chǎn)物的配體進行預(yù)測。進入網(wǎng)站,選擇HLA- A* 02:01、 A* 03:01兩類，多肽長度選為9個氨基酸，提交序列，記錄分析得分在前2%的多肽序列[9]。

2.3.3 BIMAS表位預(yù)測

進入BIMAS網(wǎng)站(http:// www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/),BIMAS是依據(jù)多肽分子與HLAⅠ類分子解離所用時間的一半進行排序，其分析結(jié)果是依據(jù)系數(shù)表推導(dǎo)的。選擇 HLA*0201及A3 兩類分子，多肽長度選為9個氨基酸[10]，接著輸入Rv2181的氨基酸序列并提交，進行預(yù)測分析。

2.3.4 NetCTL表位預(yù)測

登入NetCTL網(wǎng)站( http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/) ，從選擇類別中，選定A2和A3兩個超類型，Weight on C terminal cleavag值填寫為“0.15”，以及 Weight on TAP transport efficiency填寫為“0.05”，Threshold for epitope identification填寫為“0.75”，而后輸入Rv2181的氨基酸序列，進行預(yù)測。預(yù)測結(jié)果是以得分高低來分別顯示敏感度和特異度的高低。最后，對預(yù)測肽段的得分超過0.75的進行記錄分析[11]。

2.4 Rv2181蛋白抗原的B細胞表位預(yù)測

將MTB的Rv2181的蛋白質(zhì)氨基酸序列單獨保存成*.fas格式，啟動Protean程序，以FASTA文件格式打開。我們采用Kyte-Doolittle的親水性方案、Karplus-Schulz的柔韌性方案、Emini的表面可及性方案和Jameson-Wolf的抗原指數(shù)方案綜合性預(yù)測，預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，排除α-螺旋、β-折疊內(nèi)不易形成表位的序列，將位于β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲處的表位確定為優(yōu)勢抗原表位。再根據(jù)IEDB、ABCpred、Bcepred等軟件綜合分析，確定最佳抗原表位候選區(qū)域。

3 結(jié)果

3.1 Rv2181抗原同源性比對結(jié)果

Rv2181抗原與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群蛋白的同源性都達到100%；與非結(jié)核分枝桿菌蛋白同源性比對的一致性為71%-82%，其平均值為76.5%。Rv2181抗原與結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌相比較，Rv2181的抗原與前者的同源性較高。從表1中看出Rv2181抗原序列與人類蛋白同源性僅有31%。通過以上結(jié)果可以得出Rv2181抗原與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的同源性相當高，然而與人類蛋白的同源性很低，所以認為Rv2181抗原可能有作為免疫性結(jié)核病疫苗的能力，因此繼續(xù)對其進行預(yù)測分析很有必要。

表1 抗原Rv2181與人類蛋白同源性的比較結(jié)果

蛋白最高評分期望值同源性Rv218132．73．031%

3.2 Rv2181抗原T細胞表位結(jié)合預(yù)測結(jié)果

3.2.1 Rv2181抗原表位預(yù)測結(jié)果

使用NetMHCⅡpan 3.1 server對抗原CD4+T細胞表位進行預(yù)測分析，選擇DRB1*0901、DRB1*1501、DRB1*0701、DRB1*1101、DRB1*0301、DRB1*0405、DPA1*0103-DPB1*0401、DPA1*0201-DPB1*0101、DQA1*0101-DQB1*0501、DQA1*0301-DQB1*0302作為限定條件，預(yù)測結(jié)果見表2。從預(yù)測結(jié)果可以知道不同HLA分子結(jié)合數(shù)目大相徑庭，就拿Rv2181抗原與DRB1*1101強結(jié)合的數(shù)目明顯較多，與DQA1*0301-DQB1*0302結(jié)合的數(shù)目最少。與不同HLAⅡ分子強弱結(jié)合的數(shù)目可見表2。

表2 NetMHCⅡ?qū)v2181抗原的CD4+T細胞表位分布的預(yù)測結(jié)果

HLAⅡ分子強結(jié)合肽段數(shù)弱結(jié)合肽段數(shù)DRB1?09011369DRB1?15011762DRB1?0701553DRB1?11011830DRB1?03011438DRB1?0405531DPA1?0103?DPB1?04011750DPA1?0201?DPB1?0101、1532DQA1?0101?DQB1?05011659DQA1?0301?DQB1?0302071

3.2.2 Rv2181CD8+T表位預(yù)測結(jié)果

選擇HLA-0201和HLA-0301作為限定條件，對Rv2181抗原使用NETCTL、SYFPEITH、NetMHC和BIMAS這4種不同在線預(yù)測軟件進行預(yù)測。綜合結(jié)果，得出Rv2181抗原預(yù)測出4條抗原表位多肽，結(jié)果見表3。

表3 Rv2181抗原CD8+T細胞表位的綜合分析

起始位置序列NETCTLSYFPEITHINetMHCBIMS親和值得分得分親和值得分得分20CLLWLLAGV0．25501．14243016．65強結(jié)合591．888112LLIASTAIV0．45401．23332821．81強結(jié)合48．478265NIAGALARL1．0880．8102281081．20弱結(jié)合6．75617VLWCLLWLL1．34001．3579274．85強結(jié)合5199．555

注：親和值越低表明結(jié)合能力越強，得分越高表示結(jié)合能力越強。

3.2.3 Rv2181 CD8+T和CD4+T表位綜合預(yù)測結(jié)果

通過在線預(yù)測工具的結(jié)果，得出Rv2181抗原的CD4+T與CD8+T的肽段。最后根據(jù)CD4+T細胞表位的肽段包含CD8+T細胞表位的肽段的原則，預(yù)選出Rv2181有1條優(yōu)勢表位肽段，結(jié)果見表4。

3.3 Rv2181抗原的B細胞表位預(yù)測和分析結(jié)果

3.3.1 單參數(shù)方案預(yù)測的抗原表位

Protean軟件預(yù)測的抗原表位見表5。

表4 Rv2181抗原的CD4+T和CD8+T細胞表位綜合分析

蛋白位置序列CD4+T表位肽段CD8+T表位肽段14～28GRRVLWCLLWLLAGVVLWCLLWLL

3.3.2 B細胞優(yōu)勢抗原表位的確定

綜合DNAStare中的Protean和蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)分析初步得到B細胞抗原表位，根據(jù)IEDB、

表5 單參數(shù)方案預(yù)測的抗原表位

預(yù)測方法預(yù)測表位Hydrophilicity(Kyte?Doolittle)1～17、38～66、126～143、181～192、213～220、239～257、261～268、275～284、303～308、327～334、346～353、370～390、409～427Flexibility(Karplus?Schulz)8～15、59～68、128～133、158～163、182～190、201～204、214～218、252～255、261～266、276～279、305～309、373～380、411～425Accessibility(Emini)13～16、41～45、60～63、81～84、183～191、214～219、239～256、261～267、277～283、306～309、346～353、373～380、409～427AntigenicIndex(Jameson?Wolf)4～18、41～50、57～69、127～134、138～144、159～164、180～192、213～221、239～247、251～258、263～268、276～283、302～310、326～333、346～353、373～380、410～427

Bcepred等軟件綜合預(yù)測后得到的結(jié)果，排除α-螺旋、b-折疊內(nèi)不易形成表位的序列，將位于-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲處的表位確定為優(yōu)勢抗原表位，最終確定的最佳抗原表位候選區(qū)域有7條，結(jié)果見表6。

表6 B細胞優(yōu)勢抗原表位

表位氨基酸序列4～12WRAPEVGSR41～46TPYRID57～62WLDGRP183～189RRTPWPR251～257HTDRIGA373～379PQHRETT409～428RMTPQRSLTRGLTPAPTAS

4 討論

在近些年的研究中，許多特異性結(jié)核抗原被研究人員發(fā)現(xiàn)，這結(jié)果為結(jié)核疫苗的研制提供了一些研究基礎(chǔ)[12]。許多新的疫苗也在動物實驗中取得較好的實驗結(jié)果，但是仍然存在許多能被T細胞所識別的結(jié)核菌的蛋白抗原有待發(fā)現(xiàn)。傳統(tǒng)疫苗是將病原體滅活或減毒而制成的，存在生物危害性和遺傳變異致使原疫苗效力喪失等問題。表位疫苗(Epitope vaccine)是用抗原表位制備的疫苗，包括合成肽疫苗、重組表位疫苗及表位核酸疫苗是目前有關(guān)傳染性疾病和惡性腫瘤疫苗的研制方向。 由于表位僅是蛋白抗原的一部分，其分子量較小，免疫原性較弱，不能刺激機體產(chǎn)生較強的免疫應(yīng)答，因此為增強其免疫原性，可將表位與載體蛋白如牛血清白蛋白或破傷風類毒素等相偶聯(lián)，其所產(chǎn)生的保護力可與大分子相比。另外也可將多種T、B細胞表位的氨基酸連接于分支狀的多聚賴氨酸骨架上形成一種具有獨特三維空間結(jié)構(gòu)的大分子多抗原肽疫苗，因包含多種特異性的表位，而具有更有力的保護[13]。目前基因疫苗可作為預(yù)防和治療性疫苗，而研究中發(fā)現(xiàn)常規(guī)疫苗肌注后誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答較弱，因此找到新的基因疫苗設(shè)計方案已成為研究的熱點之一[14-15]。徐煥賓等將鴨乙肝病毒Pre-s中的P127-138B細胞表位基因克隆到含多肽表達盒的載體中，體外轉(zhuǎn)染肌肉細胞，并經(jīng)動物試驗證實重組的載體可在體外瞬時高效表達，并保持原有的免疫活性，結(jié)果提示以B細胞表位為基礎(chǔ)的基因疫苗可以誘導(dǎo)特異性體液免疫應(yīng)答，同時顯示出顯著的MHC限制性[16]。雖然表位疫苗具有許多優(yōu)點，并且其研究也取得了重大的進展，但仍存在一些問題。比如將多肽單獨應(yīng)用的免疫原性較低，如何誘導(dǎo)出最佳的免疫應(yīng)答是我們需要去解決的難點之一，此問題或許可以通過構(gòu)建包含多種限制性表位的疫苗來解決[17]。在未來的研究中，我們應(yīng)當加大對結(jié)核表位的研究，研制出具有效價、便捷的疫苗。

筆者對MTB的Rv2181蛋白抗原中T、B細胞表位預(yù)測分析是通過生物信息學(xué)的方法進行預(yù)測。首先得到Rv2181蛋白的氨基酸序列，接著通過對人類蛋白和Rv2181蛋白序列進行同源性分析，使用SYFPEITHI、NETCTL、NetMHC和BIMAS等數(shù)據(jù)庫預(yù)測抗原T細胞中CD8和CD4T的表位，綜合結(jié)果篩選出一條優(yōu)勢肽段GRRVLWCLLWLLAGV。利用Protean預(yù)測到的B細胞抗原表位，再根據(jù)IEDB、ABCpred、Bcepred等數(shù)據(jù)庫預(yù)測，排除α-螺旋、β-折疊內(nèi)不易形成表位的序列，將位于β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲處的表位確定為優(yōu)勢表位[17]。通過預(yù)測分析來篩選出7條優(yōu)勢的B細胞抗原表位區(qū)域，Rv2181蛋白可作為新的結(jié)核病診斷試劑和疫苗研發(fā)的候選靶蛋白。

[1] Ralph A P, Waramori G, Pontororing G J, et al. L-arginine and Vitamin D Adjunctive Therapies in Pulmonary Tuberculosis: A Randomised, Double-Blind, Placebo-Controlled Trial[J]. Plos One, 2013, 8(8):e70032.

[2] Trunz B B, Fine P, Dye C. Effect of BCG vaccination on childhood tuberculous meningitis and miliary tuberculosis worldwide: a meta-analysis and assessment of cost-effectiveness.[J]. Lancet, 2006, 367(9517):1173-1180.

[3] Black G F, Weir R E, Floyd S, et al. BCG-induced increase in interferon-gamma response to mycobacterial antigens and efficacy of BCG vaccination in Malawi and the UK: two randomised controlled studies[J]. Lancet(London,England),2002, 359(9315):1393.

[4] 沈洪波, 王洪海. 治療性結(jié)核病疫苗研究進展[J]. 微生物與感染, 2010, 05(2):111-116.

[5] 劉海燦. 結(jié)核分枝桿菌八種蛋白抗原中人T/B細胞抗原表位多態(tài)性研究[D].北京：中國疾病預(yù)防控制中心, 2014.

[6] 趙亞靜, 白雪娟, 梁艷,等. 結(jié)核分枝桿菌Rv3407蛋白抗原表位的預(yù)測[J]. 中國病原生物學(xué)雜志, 2014(6):486-488.

[7] 仇艷, 蔣毅, 劉海燦,等. 結(jié)核分枝桿菌抗原PE35和PPE68基因多態(tài)性的初步研究[J]. 疾病監(jiān)測, 2015, 30(7):539-545.

[8] 朱為剛, 鮑自謙, 藍欲曉,等. 中國南方漢族人群HLA-A、B、DRB1基因的序列分析和單體型分布[J]. 中國輸血雜志, 2009, 22(11):893-897.

[9] 吳祖建, 高芳鑾, 沈建國. 生物信息學(xué)分析實踐[M]. 北京：科學(xué)出版社, 2010.

[10] Mommaas B, Kamp J, Drijfhout J W, et al. Identification of a novel HLA-B60-restricted T cell epitope of the minor histocompatibility antigen HA-1 locus.[J]. Journal of Immunology, 2002, 169(169):3131-3136.

[11] Kesmir C, Nussbaum A K, Schild H, et al. Prediction of proteasome cleavage motifs by neural networks.[J]. Protein Engineering, 2002, 15(4):287-296.

[12] 葉娟, 張舒林, 劉文第. 結(jié)核分枝桿菌RD12區(qū)T細胞表位分布情況預(yù)測及分析[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2014, 34(1):7-12.

[13] Joshi M B, Gam A A, Boykins R A, et al.Immunogenicity of Well-Characterized Synthetic Plasmodium falciparum Multiple Antigen Peptide Conjugates[J]. Infection & Immunity, 2001, 69(8):4884.

[14] Autran B, Costagliola D, Murphy R, et al.Evaluating therapeutic vaccines in patients infected with HIV.[J]. Expert Review of Vaccines, 2004, 3(4 Suppl):S169.

[15] Lima K M, Jm D S S, Silva C. Vaccine adjuvant: It makes the difference[J]. Vaccine, 2004, 22(19):2374-2379.

[16] 李海俠, 毛旭虎. 蛋白質(zhì)抗原表位研究進展[J]. 微生物學(xué)免疫學(xué)進展, 2007, 35(1):54-58.

[17] Li W M, Dragowska W H, Bally M B, et al. Effective induction of CD8+ T-cell response using CpG oligodeoxynucleotides and HER-2/neu-derived peptide co-encapsulated in liposomes.[J]. Vaccine, 2003, 21(21):3319-3329.

Prediction and analysis of T，B cell epitopes’ s distribution of theMycobacteriumtuberculosisRv2181

ZHANWei-hong,WUQi-hang,ZHAOLong-qi,WANGXin-qian,SUNYan,YUXiao-li

(School of Biology and Pharmaceutical Engineering,Wuhan Polytecnic University,Wuhan 430023,China)

To forecast and analyse the distribution of CD4+T cell CD8+T cell and B epitope encoded by the Rv2181 ofMycobacteriumtuberculosis.First obtain the protein amino acid sequence from NCBI detabase,and then analyse its homology with human proteins sequence and homology.Using SYFPEITHI to analyse T cell antigen epitope, choosing the points in the top 2% as advantage epitope.Then using NETCTL, NetMHC and BIMAS database to predict CD8+T CD4+T cell epitope, to screen out advantage peptides from prediction results.Protean are used to get the predicted B cell antigen epitope, and according to IEDB, ABCpred, Bcepred detabases, eliminate the sequences which have alpha helix, beta - fold,but choose the sequences in beta angle, the table level random curl as advantage epitope.By predicting, there are 120 strong and 495 candidates epitope in CD4+T cell.In the end, select one dominant epitope,and determine 7 B cell advantages antigen epitope area.The prediction of T ,B cells in the diagnosis and treatment of tuberculosis is of improtant value.

Mycobacteriumtuberculosis; Rv2181; T cells; B cells; epitope analysis

2017-01-26.

占衛(wèi)紅(1992-)，女，碩士研究生，E-mail: 3051361453@qq.com.

余曉麗(1963-)，女，教授，E-mail:yxll268@126.com.

2095-7386(2017)01-0039-05

10.3969/j.issn.2095-7386.2017.01.008

Q 93

A