沈　玨，鄭舒丹，劉　濤，李　韡，付　雁

(天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072)

大多數(shù)有機(jī)化合物晶體形成過程中存在多晶型現(xiàn)象，即其固體狀態(tài)存在2種或2種以上的不同分子排列方式，從而形成多種不同形態(tài)和功能的晶體?，F(xiàn)有原料藥半數(shù)以上的品種存在著多晶型現(xiàn)象。不同的藥物晶型之間存在明顯不同的物化性質(zhì)，如溶解度，穩(wěn)定性，生物利用度等[1-3]。因此，研究影響有機(jī)晶體多晶型調(diào)控的規(guī)律對于醫(yī)藥、燃料和農(nóng)藥等行業(yè)具有重要意義。

傳統(tǒng)調(diào)節(jié)藥物結(jié)晶過程的因素主要包括：溶劑、過飽和度、溫度、pH值、降溫速率等。近來，利用添加劑調(diào)節(jié)有機(jī)分子結(jié)晶過程的報(bào)道不斷涌現(xiàn)。例如，Deoliveira等[4]發(fā)現(xiàn)不同構(gòu)象的生物大分子多肽對碳酸鈣晶體生長產(chǎn)生了顯著的影響，由于多肽與晶體特定表面具有識(shí)別作用而導(dǎo)致不同晶型的生成。He等[5]在4-甲基-2-硝基乙酰苯胺的結(jié)晶過程中加入了2種同構(gòu)類似物作為添加劑，導(dǎo)致了不同多晶型的產(chǎn)生。Wei等[6]在L-谷氨酸結(jié)晶過程中加入了多種氨基酸作為添加劑，研究發(fā)現(xiàn)L-色氨酸和L-組氨酸能夠促進(jìn)α-晶型的生成、抑制其它晶型的產(chǎn)生。

茶堿(theophylline，簡稱TP)是一種治療哮喘的支氣管擴(kuò)張劑，具有放松支氣管的平滑肌，松弛興奮中樞神經(jīng)，加強(qiáng)心肌收縮，擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈等作用，分子結(jié)構(gòu)如圖1a)所示。目前已報(bào)道的茶堿有4種無水晶型(I，II，III，IV)和1種水合晶型(M)。IV晶型是被認(rèn)為最穩(wěn)定的晶型，可以用過量的茶堿在甲醇中漿化得到[7]。

寡聚核苷酸是由低于20個(gè)堿基組成的短鏈DNA生物大分子，其堿基包括：腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)。堿基上富含的N、O可以作為氫鍵的供體或者受體，DNA的堿基與堿基之間可以通過特定的氫鍵互補(bǔ)配對[8-9]。圖1b)所示為腺嘌呤核苷的分子結(jié)構(gòu)，與茶堿結(jié)構(gòu)具有相似性。前期文獻(xiàn)已表明，不同堿基組成的寡聚核苷酸能顯著調(diào)節(jié)鈀亞納米團(tuán)簇的聚集形態(tài)與催化特性[10]、銀納米粒子不同晶面的生長速率[11]，因此，本研究分別選取腺嘌呤、胸腺嘧啶核苷組成的寡聚核苷酸為添加劑，研究了該添加劑對茶堿多晶型的影響作用。

圖1　茶堿、腺嘌呤核苷和胸腺嘧啶核苷分子結(jié)構(gòu)Fig.1　Molecular structure of theophylline, adenosine and thymidine

1　實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

茶堿(TP)，天津希恩思生化科技有限公司提供，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98%，其PXRD出峰位置為7.2°、12.7°和14.9°，與文獻(xiàn)對比鑒定為II晶型?；瘜W(xué)純乙醇(Ethanol)購自天津江天化工有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為實(shí)驗(yàn)室自制三蒸水。寡聚核苷酸序列d(A10)、d(A20)、d(T20)為大連寶生物(Takara)公司合成，相對分子質(zhì)量分別為3070.1、6202.2、6022.0。經(jīng)液相色譜分析，寡聚核苷酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于99%。

1.2　結(jié)晶實(shí)驗(yàn)與表征

寡聚核苷酸溶液預(yù)處理：室溫下將樣品溶解于三蒸水中，經(jīng)過95 ℃退火后用紫外光譜測定吸光度標(biāo)定溶液中寡聚核苷酸的濃度，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

結(jié)晶過程：在結(jié)晶器中定量加入的寡聚核苷酸水溶液，搖動(dòng)混勻，50 ℃保溫20 min，以0.5 ℃·min-1的降溫速率降溫到4 ℃結(jié)晶。采用真空抽濾收集晶體，真空常溫干燥12 h后進(jìn)一步表征。

采用圓二色光譜(CD，Jasco J-810)檢測溶液中寡聚核苷酸與茶堿分子之間的相互作用。晶體樣品分別用偏光顯微鏡(XY-P系列)、粉末X-射線衍射(PXRD，Rigaku D/max 2500)、傅里葉變換紅外光譜(FT-IR，Thermo Nicolet IZ10)和拉曼光譜(Raman，RENISHAW)進(jìn)行表征。

1.3　分子模擬

茶堿晶體結(jié)構(gòu)是從劍橋晶體數(shù)據(jù)庫(Cambridge Crystal Database)中得到。在Material Studio 軟件中建立晶體多晶型模型，采用Morphology 模塊，分別用BFDH模型和AE模型進(jìn)行晶習(xí)預(yù)測，得到重要生長晶面。

將寡聚核苷酸作為吸附質(zhì)，用Adsorption Locater模塊吸附到晶面分子層上，設(shè)定力場為cvff[12]，精度設(shè)為fine。從生成的20個(gè)構(gòu)型中選取較為合理的3個(gè)，然后用Forcite模塊的幾何優(yōu)化得到能量最低的狀態(tài)。茶堿晶面與添加劑之間的相互作用能計(jì)算式為：

Einteraction=Etotal-Ecrystal-Eadditive

(1)

式(1) 中，Einteraction即晶體與添加劑之間相互作用能，Etotal是晶體與添加劑結(jié)合并優(yōu)化后得到的總能量，Ecrystal是晶體單獨(dú)存在時(shí)的能量，Eadditive是添加劑單獨(dú)存在的能量。當(dāng)相互作用能為負(fù)值時(shí)，說明兩者傾向于結(jié)合，絕對值越大，結(jié)合越穩(wěn)定；當(dāng)相互作用能為正值時(shí)，說明兩者傾向于排斥，絕對值越大，斥力越大。

寡聚核苷酸分子結(jié)構(gòu)是從蛋白數(shù)據(jù)庫(PDB)中，選取DNA序列(Model PDB ID：4HW1)得到。由于計(jì)算集群運(yùn)算能力的局限，選取連續(xù)的3個(gè)堿基片段AAA進(jìn)行分子模擬計(jì)算。首先用Dmol3模塊進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，交換相關(guān)能量函數(shù)選用GGA-Pw91，DNP基組，使用水溶劑環(huán)境，自旋限制，集合優(yōu)化中所有原子都處于松弛狀態(tài)。收斂判別準(zhǔn)則為：能量E=0.26255 kJ/mol，梯度Grad=5.251 kJ/mol/?-1，笛卡爾坐標(biāo)Coord=1.0×10-4?(1 ?=0.1 nm)。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1　茶堿對寡聚核苷酸分子構(gòu)象的影響

溶液中寡聚核苷酸分子通過自組裝會(huì)形成特定的構(gòu)象，實(shí)驗(yàn)中采用圓二色光譜表征了溶液中茶堿對寡聚核苷酸分子構(gòu)象的影響。圖2所示為茶堿-A20混合溶液在室溫下的圓二色譜法圖，其中A20的濃度為20 μmol/L。

圖2　茶堿- A20溶液的圓二色譜法圖(25 ℃)，A20濃度：20 μmol/L，茶堿濃度：0～4 mmol/L (TB/base為茶堿與堿基的比值)Fig.2　CD spectra of the TP-A20 solutions(25 ℃), the concentration of A20 is 20 μmol/L, the concentration of TP is 0～ 4 mmol/L (TB/base is the radio of theophylline and base)

從圖2中可以看到，隨著茶堿濃度的增加，A20在220 nm處的特征正峰明顯下降，且出現(xiàn)了明顯的紅移，說明A20的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化；當(dāng)茶堿與堿基比大于2時(shí)，在265～270 nm之間出現(xiàn)新的負(fù)峰，說明茶堿與A20之間存在較強(qiáng)的相互作用。寡聚核苷酸A10與A20相比，其組成的堿基都是腺嘌呤只是個(gè)數(shù)減少為10個(gè)，茶堿-d(A10)溶液的圓二色譜法圖與圖2類似，表明茶堿與A10之間也存在一定的相互作用。而寡聚核苷酸d(T20)的堿基組成為胸腺嘧啶，茶堿-d(T20)溶液的圓二色譜法圖的特征峰強(qiáng)度隨著茶堿濃度的增加而下降，但沒有新的特征峰形成，說明茶堿與T20之間的作用力相對較弱。

2.2　寡聚核苷酸對茶堿晶型的影響

圖3和圖4分別是不同寡聚核苷酸添加劑作用下、降溫速率為0.5 ℃·min-1時(shí)得到的茶堿晶體的偏光照片和PXRD譜圖。

圖3　茶堿晶體的偏光照片 (放大50倍)Fig.3　Photomicrographs of theophylline crystals

圖4　不同添加劑作用下的茶堿晶體XRD譜圖Fig.4　XRD patterns of theophylline in the presence of different additives

由圖3可知，沒有添加劑存在時(shí)，結(jié)晶樣品的形貌特征是針狀，晶型包括II晶型和M晶型。在存在d(T20)濃度為1 mg/L時(shí)，獲得的結(jié)晶樣品為細(xì)小的針狀，晶型則與無添加劑的情況相近，也包括II晶型和M晶型。當(dāng)分別添加濃度為2 mg/L的d(A10)和濃度為2 mg/L的d(A20)時(shí)，結(jié)晶樣品呈現(xiàn)棒狀、晶型只有M晶型，這表明添加d(A10)或d(A20)能顯著影響茶堿結(jié)晶過程的分子間作用力?？紤]到寡聚核苷酸d(A10)、d(A20)相對分子質(zhì)量較大，為了揭示其對茶堿結(jié)晶過程的影響，我們采用分子模擬的方法研究了茶堿多晶型不同晶面與3個(gè)腺嘌呤堿基組成的核苷酸片段(AAA)的相互作用。

2.3　寡聚核苷酸與茶堿不同晶面的相互作用

分別采用BFDH方法和AE方法預(yù)測了茶堿的晶習(xí)，與實(shí)驗(yàn)觀測的晶習(xí)對比說明用AE方法預(yù)測得到的茶堿晶習(xí)實(shí)驗(yàn)觀測形貌基本一致，根據(jù)AE方法預(yù)測的晶習(xí)確定了茶堿多晶型的重要生長晶面，如表1所示。進(jìn)一步采用分子模擬的方法計(jì)算了上述重要晶面與腺嘌呤核苷酸片段AAA的相互作用能。

表1　茶堿多晶型的重要晶面

圖5所示為分子模擬計(jì)算的AAA片段與茶堿多晶型的重要生長晶面之間的相互作用能。

圖5　茶堿重要晶面與AAA片段之間的相互作用能Fig.5　The interaction energies between AAA segment and important faces of theophylline polymorphs

由圖5可知，AAA片段與茶堿I晶型、II晶型和IV晶型表面平均相互作用能分別為-282.8、-287.5和-274.5 kJ·mol-1；而與M晶型表面平均相互作用能為-376.2 kJ·mol-1。這說明AAA在M晶型表面吸附能力最強(qiáng)，因此，在茶堿結(jié)晶過程中AAA會(huì)優(yōu)先促進(jìn)M晶型的生長。

3　結(jié)論

1)采用以腺嘌呤核苷組成的寡聚核苷酸d(A10)、d(A20)為添加劑，能夠顯著影響乙醇-水體系降溫結(jié)晶過程中茶堿多晶型的形成，促進(jìn)M晶型生成；而胸腺嘧啶核苷組成的寡聚核苷酸d(T10)則基本不影響茶堿多晶型的形成。

2)分子模擬研究揭示了腺嘌呤堿基組成的核苷酸片段與茶堿M晶型重要晶面之間的相互作用能最強(qiáng)，正是這種強(qiáng)相互作用促進(jìn)了茶堿結(jié)晶過程中M晶型的生長。

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