趙子賢，李娟紅，蘇宏釗，曾鳳群，何健祥

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬新會(huì)醫(yī)院輸血科1、檢驗(yàn)科2、耳鼻喉科3，廣東 江門 529100)

兩種方法檢測(cè)丙型肝炎病毒抗體的一致性比較

趙子賢1，李娟紅2，蘇宏釗3，曾鳳群2，何健祥2

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬新會(huì)醫(yī)院輸血科1、檢驗(yàn)科2、耳鼻喉科3，廣東 江門 529100)

目的 用Kappa檢驗(yàn)分析兩種方法檢測(cè)丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)抗體的一致性，為安全輸血提供最佳的HCV抗體篩查方法。方法選取2015年2月至2016年6月在我院就治而有可能需輸血患者的丙型肝炎病毒抗體待檢標(biāo)本，用膠體金法HCV抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，將可疑結(jié)果和陽性結(jié)果標(biāo)本再用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)HCV抗體診斷試劑盒(ELISA)和化學(xué)發(fā)學(xué)測(cè)定法HCV抗體檢測(cè)試劑盒CLIA)分別進(jìn)行復(fù)檢。用SPSS17.0軟件分別對(duì)可疑和陽性結(jié)果、可疑結(jié)果、陽性結(jié)果進(jìn)行Kappa分析一致性程度，并用U檢驗(yàn)對(duì)Kappa系數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果膠體金法HCV抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)全部標(biāo)本共448例可疑陽性和陽性結(jié)果，其中112例為可疑結(jié)果，336例為陽性結(jié)果；用ELISA方法檢測(cè)448例初檢為可疑和陽性結(jié)果，結(jié)果為陰性、可疑和陽性的例數(shù)分別是54例(12%)、18例(4%)、376例(84%)，用CLIA方法檢測(cè)結(jié)果分別為42例(9.4%)、11例(2.5%)、395例(88.1%)；用ELISA方法檢測(cè)112例初檢為可疑陽性結(jié)果，結(jié)果為陰性、可疑和陽性的例數(shù)分別是11例(9.8%)、30例(26.8%)、71例(63.4%)，用CLIA方法檢測(cè)結(jié)果分別為13例(11.6%)、21例(18.7%)、78例(69.7%)；用ELISA方法檢測(cè)336例初檢為陽性結(jié)果，結(jié)果為陰性、可疑和陽性的例數(shù)分別是12例(3.6%)、28例(8.3%)、296例(88.1%)，用CLIA方法檢測(cè)結(jié)果分別為11例(3.3%)、19例(5.6%)、306例(91.1%)。兩種方法對(duì)可疑和陽性標(biāo)本、可疑標(biāo)本、陽性標(biāo)本的Kappa系數(shù)分別為Kappa=0.730(u=16.22，P＜0.01)、Kappa=0.497(u=6.81，P＜0.05)、Kappa=0.705(u=11.56，P＜0.01)。結(jié)論兩種方法對(duì)可疑和陽性標(biāo)本、陽性標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果有較好的一致性，而對(duì)可疑標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果一致性為中等，對(duì)可疑陽性結(jié)果應(yīng)用更為敏感和特異的試驗(yàn)驗(yàn)證。

丙型肝炎病毒抗體；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；化學(xué)發(fā)光測(cè)定法；Kappa檢驗(yàn)

在臨床上丙型肝炎病毒(HCV)感染是一種常見且傳染范圍比較廣的感染性疾病[1-2]。據(jù)調(diào)查顯示，約一半HCV感染患者可轉(zhuǎn)化為慢性肝炎，甚至可轉(zhuǎn)變?yōu)楦斡不蚋渭?xì)胞性肝癌[3]。我國(guó)的HCV感染途徑主要是經(jīng)輸血傳播，特別是反復(fù)輸入多個(gè)獻(xiàn)血員的血制品。隨著輸血醫(yī)學(xué)的發(fā)展，輸血所帶來的感染日益?zhèn)涫苤匾?，一方面是針?duì)患者的早期防治，另一方面是降低醫(yī)療糾紛的發(fā)生和防止醫(yī)護(hù)人員職業(yè)暴露[4]。目前HCV感染的檢測(cè)方法有膠體金法、ELISA、CLIA和核酸擴(kuò)增試驗(yàn)法等[5]，各種檢測(cè)方法因方法學(xué)原理不同和商家試劑的靈敏度和特異性不同，使產(chǎn)品說明書中提供的臨界值(cut-off)值存在差別[6]，導(dǎo)致同一份標(biāo)本可能得出不同的檢測(cè)結(jié)果。本文用Kappa檢驗(yàn)分析ELISA和CLIA兩種方法檢測(cè)HCV抗體結(jié)果的一致性，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集本院2015年2月至2016年6月輸血前、手術(shù)前需檢測(cè)HCV抗體患者共22 426例，其中男性11 824例(52.7%)，女性10 602例(47.3%)年齡8～92歲，平均(55±18.12)歲。分別用促凝管抽取靜脈血，離心獲取血清待檢。

1.2 儀器與試劑 ①儀器：由瑞士 Tecan Schweiz AG公司生產(chǎn)的全自動(dòng)酶免分析儀(Freedom EVOLyze)，由北京科美生物有限公司生產(chǎn)的科美東雅化學(xué)發(fā)光分析儀(CHEMCLI600)；②試劑：由英科新創(chuàng)科技有限公司生產(chǎn)的丙型肝炎病毒抗體檢測(cè)試劑盒(膠體金法)，由珠海麗珠試劑股份有限公司生產(chǎn)的丙型肝炎病毒抗體診斷試劑盒(ELISA法)，由北京科美生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)丙型肝炎病毒抗體檢測(cè)試劑盒(CLIA法)。

1.3 方法 把全部標(biāo)本先用膠體金法進(jìn)行初檢，將初檢結(jié)果中的可疑結(jié)果、陽性結(jié)果平行利用ELISA法和CLIA法進(jìn)行復(fù)檢。結(jié)果的判斷：①ELISA法：臨界值(cut-off)=陰性對(duì)照平均A值+0.12，樣品A值cut-off值為HCV抗體陽性，樣品A值＜臨界值為HCV抗體陰性。②CLIA法：臨界值(cut-off)=2.1×陰性對(duì)照發(fā)光值(RLU)的平均值，待測(cè)樣本的RLU值≥cut-off值為有反應(yīng)性，待測(cè)樣本的RLU值＜臨界值為無反應(yīng)性。實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格按試劑說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS17.0軟件包對(duì)復(fù)檢結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用Kappa檢驗(yàn)分析兩種方法檢測(cè)丙型肝炎病毒抗體的一致性，用U檢驗(yàn)對(duì)Kappa值進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)，以P=0.05為檢驗(yàn)水平。0.2＜Kappa≤0.4，一致性水平為一般；0.4＜Kappa≤0.6，一致性水平為中等；0.6＜Kappa≤0.8，一致性水平為好。

2 結(jié) 果

2.1 膠體金法初檢 2015年2月至2016年6月輸血前、手術(shù)前需檢測(cè)HCV抗體患者共22 426例，用膠體金法HCV抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行初檢，共448例可疑和陽性結(jié)果，其中112例為可疑結(jié)果，336例為陽性結(jié)果，其余為陰性結(jié)果，陽性率為1.50%。

2.2 兩種方法平行測(cè)試初檢HCV抗體為可疑陽性和陽性結(jié)果的一致性 膠體金法HCV抗體檢測(cè)初檢的可疑結(jié)果和陽性結(jié)果共448例，分別用ELISA和CLIA兩種方法平行測(cè)試復(fù)檢，ELISA法結(jié)果為陰性、可疑和陽性的例數(shù)分別為54例(12%)、18例(4%)、376例(84%)，CLIA法結(jié)果分別為42例(9.4%)、11例(2.5%)、395例(88.1%)，兩種方法針對(duì)可疑陽性和陽性結(jié)果的Kappa系數(shù)為0.730，經(jīng)U檢驗(yàn)，P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，認(rèn)為兩者一致性強(qiáng)度為好，見表1。

表1 兩種方法平行測(cè)試HCV抗體可疑陽性和陽性結(jié)果的測(cè)試結(jié)果(n=448，例)

2.3 兩種方法平行測(cè)試初檢HCV抗體為可疑陽性結(jié)果的一致性 膠體金法HCV抗體檢測(cè)初檢的可疑陽性結(jié)果共112例，分別用ELISA和CLIA兩種方法平行測(cè)試復(fù)檢，ELISA法結(jié)果為陰性、可疑和陽性的例數(shù)分別是11例(9.8%)、30例(26.8%)、71例(63.4%)，用CLIA法檢測(cè)結(jié)果分別為13例(11.6%)、21例(18.7%)、78例(69.7%)。兩種方法針對(duì)可疑陽性結(jié)果的Kappa系數(shù)為0.497，經(jīng)U檢驗(yàn)，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，認(rèn)為兩者一致性強(qiáng)度為中等，見表2。

表2 兩種方法平行測(cè)試HCV抗體可疑陽性的測(cè)試結(jié)果(n=112，例)

2.4 兩種方法平行測(cè)試初檢HCV抗體為陽性結(jié)果的一致性 膠體金法HCV抗體檢測(cè)初檢的陽性結(jié)果共336例，分別用ELISA和CLIA兩種方法平行測(cè)試復(fù)檢，ELISA法結(jié)果為陰性、可疑和陽性分別為12例(3.6%)、28例(8.3%)、296例(88.1%)，用CLIA法檢測(cè)結(jié)果分別為11例(3.3%)、19例(5.6%)、306例(91.1%)。兩種方法針對(duì)陽性結(jié)果的Kappa系數(shù)為0.705，經(jīng)U檢驗(yàn)，P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，認(rèn)為兩者一致性強(qiáng)度為好，見表3。

表3 兩種方法平行測(cè)試HCV抗體陽性的測(cè)試結(jié)果（n=336，例）

3 討 論

由HCV感染引起的丙型肝炎是我國(guó)比較常見的傳染病之一，它主要通過輸血傳播并且對(duì)人類健康造成極大危害。目前絕大多數(shù)醫(yī)院開展了HCV檢測(cè)，只要用于輸血前、術(shù)前、懷孕前檢查等[7]。調(diào)查研究顯示，我國(guó)每年新發(fā)現(xiàn)的丙型肝炎患者大約35 000例，并且北方發(fā)現(xiàn)的病例要比南方高，抗HCV陽性率伴隨著年齡的增大而上升，男女之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[8]?；颊吒腥綡VC后，臨床癥狀不明顯，易發(fā)展為慢性而導(dǎo)致成為肝硬化或肝癌[9]。部分HCV攜帶患者因沒有早期診治，在不知情下獻(xiàn)血或手術(shù)等方式傳播，因此需對(duì)HCV感染患者進(jìn)行早期診斷[10]。膠體金法檢測(cè)HCV抗體，操作簡(jiǎn)便，省時(shí)，無需用特殊儀器，費(fèi)用相對(duì)低，而且有較高的靈敏度和特異性，可用于緊急情況下的初篩[11]。對(duì)于免疫系統(tǒng)正常的患者用ELISA法檢測(cè)HCV抗體，其檢出率可達(dá)99.0%，缺點(diǎn)是任何的污染均容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。用人工合成多肽抗原或用基因工程制造的多肽作為固相的ELISA診斷試劑盒，利用間接法原理檢測(cè)，使不同制造商的測(cè)定結(jié)果存在較大的差異[12-13]。由于HCV基因序列容易變異而使其所編碼的氨基酸序列有顯著改變，國(guó)內(nèi)許多患者感染的HCV有多種基因型而且存在一定比例的混合感染，導(dǎo)致HCV的早期診斷效果并不理想。CLIA法具有無放射污染、標(biāo)記物的來源多樣并且有效期長(zhǎng)、檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)方便等優(yōu)點(diǎn)，目前使用較多。其檢測(cè)效果與酶標(biāo)記物的質(zhì)量好壞相關(guān)，也跟純度好、親和力高、活性強(qiáng)的酶和抗原或抗體密切相關(guān)[14-15]。增強(qiáng)劑可以提高發(fā)光信號(hào)使發(fā)光時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，這樣對(duì)提高檢測(cè)的靈敏度有極大的幫助。有文獻(xiàn)表明，與常規(guī)的ELISA法相比，CLIA法的靈敏度提高了3～5個(gè)數(shù)量級(jí)[14]。

本文通過研究發(fā)現(xiàn)利用多種方法對(duì)HCV抗體待檢標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)不同的結(jié)果，特別是處于陽性臨界值的標(biāo)本。用ELISA法和CLIA法對(duì)金標(biāo)法初檢448例可疑陽性和陽性結(jié)果、336例陽性結(jié)果進(jìn)行平行檢測(cè)，用Kappa檢驗(yàn)分析其結(jié)果的一致性顯示好；然而兩種方法對(duì)金標(biāo)法初檢112例HCV抗體可疑陽性結(jié)果時(shí)，Kappa檢驗(yàn)分析其結(jié)果的一致性顯示中等。原因可能是生產(chǎn)檢測(cè)HCV抗體試劑盒的商家使用不同的HCV基因重組抗原或抗原各區(qū)段、比例不相同，使不同商家的試劑靈敏性和特異性存在差異，抗HCV抗體的檢測(cè)結(jié)果也不盡相同[16-17]。另外抗HCV抗體存在假陽性的情況，如ELISA和CLIA試劑所用抗原是基因工程制備的蛋白，來自載體大腸桿菌的一些序列或與血清中的大腸桿菌因子發(fā)生反應(yīng)從而產(chǎn)生假陽性；或因受檢者血清中的IgG濃度過高，其吸附在板孔的能力過于強(qiáng)大，降低本底較困難，從而產(chǎn)生假陽性；或因受檢者本身存在結(jié)締組織病，如多發(fā)性骨髓瘤等，血清中的異常IgG濃度過高或系統(tǒng)性紅斑狼瘡血清中的風(fēng)濕小體濃度過高，致使出現(xiàn)假陽性[18]。因此，只用一種試劑判斷HCV陽性需小心，HCV篩查可疑或陽性仍需通過更為特異的試驗(yàn)確認(rèn)。目前HCV的確證試驗(yàn)多用HCV-RNA和重組免疫印跡法(RIBA)。HCV-RNA法檢測(cè)步驟繁瑣，容易有交叉污染導(dǎo)致假陽性，另外試劑和儀器偏貴；RIBA法有很高的特異性，但試劑價(jià)格同樣貴，兩者均難以在臨床上推廣。已有研究對(duì)臨床上診斷HCV感染的不同復(fù)檢核審模式進(jìn)行了探討[19-20]。

綜上所述，兩種方法檢測(cè)初檢(金標(biāo)法)為可疑陽性和陽性標(biāo)本、陽性標(biāo)本有較好的一致性，但只針對(duì)可疑陽性標(biāo)本時(shí)，一致性為中等。為了保證用血安全，減小醫(yī)療糾紛和待檢者的心理負(fù)擔(dān)，在工作中遇到HCV檢測(cè)可疑結(jié)果時(shí)，要選用其他特異性更高的方法進(jìn)行驗(yàn)證。

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Comparison of the concordance of two methods for the detection of anti-HCV.

ZHAO Zi-xian1,LI Juan-hong2,SU Hong-zhao3,ZENG Feng-qun2,HE Jian-xiang2.Department of Blood Transfusion1,Department of Laboratory2, Department of ENT3,Xinhui Hospital Affiliated to Southern Medical University,Jiangmen 529100,Guangdong,CHINA

Objective To evaluate the concordance of the two methods for detection of antibodies to hepatitis C virus(anti-HCV),and to provide the best HCV antibody screening method for safe blood transfusion.MethodsAll the anti-HCV inspected samples which were collected from the patients,who admitted to our hospital for treatment and underwent blood transfusion from February 2015 to June 2016,were detected by HCV antibody detection kit with colloidal gold method.The suspicious and positive samples were re-inspected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)and chemiluminescent immunoassay(CLIA).Kappa consistency analysis of the re-inspected results of suspicious and positive specimens was carried out with SPSS17.0 software,and the Kappa coefficient was statistically analyzed byUtest.ResultsA total of 448 suspicious and positive samples were detected by HCV antibody detection kit with colloidal gold method among all the samples,which included 112 suspicious and 336 positive specimens.The negative, suspicious,positive specimens re-inspected out by ELISA in 448 samples were 54(12%),18(4%),376(84%),respectively;The negative,suspicious,positive specimens re-inspected out by CLIA in 448 samples were 42(9.4%),11 (2.5%),395(88.1%),respectively.The 112 suspicious samples re-inspected by ELISA showed negative,suspicious, positive specimens were 11(9.8%),30(26.8%),71(63.4%),respectively;The re-inspected results by CLIA showed that negative,suspicious,positive specimens were 13(11.6%),21(18.7%),78(69.7%),respectively.The 336 positive samples re-inspected by ELISA showed negative,suspicious,positive specimens were 12(3.6%),28(8.3%),296 (88.1%),respectively.The re-inspected results by CLIA were 11(3.3%)negative,19(5.6%)suspicious,306(91.1%) positive,respectively.Kappa coefficient of suspicious-positive specimens,suspicious specimens and positive specimens by the two assays of anti-HCV were 0.730(u=16.22,P＜0.01),0.497(u=6.81,P＜0.05),0.705(u=11.56,P＜0.01), respectively.ConclusionThere is a good consistency of suspicious-positive and positive specimens by the two assays of anti-HCV.The consistency of the two assays for suspicious specimens was medium,and other more sensitive and specific methods should be used in the suspicious specimens.

Antibodies to hepatitis C virus(anti-HCV);Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA);Chemiluminescence immunoassay(CLIA);Kappa test

R512.6+3

A

1003—6350（2017）06—0928—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.06.023

2016-08-27)

趙子賢。E-mail：224047632@qq.com