呂明麗，周赟，周雷平，牛建梅

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國際和平婦幼保健院超聲科，上海 200030)

MCP-1在乳腺惡性腫瘤細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移中的作用

呂明麗，周赟，周雷平，牛建梅

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國際和平婦幼保健院超聲科，上海 200030)

目的 探討人單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)在乳腺惡性腫瘤細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移中的作用。方法構(gòu)建MCP-1過表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞和空載MCF-7細(xì)胞，分別標(biāo)記為MCP-1過表達(dá)MCF-7細(xì)胞(MCP-MCF-7)、空載MCF-7細(xì)胞(EV-MCF-7)。通過CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、單克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞凋亡檢測，觀察MCP-1過表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移及凋亡的影響。通過real-time PCR法檢測MCP-1可能的下游基因。結(jié)果成功構(gòu)建了MCP-1過表達(dá)MCF-7乳腺癌細(xì)胞株及對(duì)照細(xì)胞株。CCK8實(shí)驗(yàn)顯示培養(yǎng)第5天起MCP-MCF-7細(xì)胞株在450 nm處的吸光度明顯高于EV-MCF-7組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)提示MCP-MCF-7細(xì)胞株所形成的集落數(shù)量明顯多于EV-MCF-7細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且前者單個(gè)集落的體積亦大于后者。劃痕實(shí)驗(yàn)中12 h后MCP-MCF-7細(xì)胞的遷移能力開始增強(qiáng)，到48 h時(shí)劃痕更加愈合明顯。雖然轉(zhuǎn)染MCP-1后細(xì)胞有效凋亡百分比(0.57%)低于空載細(xì)胞(1.10%)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，即MCP-1對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞凋亡無影響。在對(duì)MCP-1下游可能基因的分析結(jié)果提示MCP-1可以上調(diào)p65、MMP2、STAT2基因表達(dá)，下調(diào)RASSF1基因表達(dá)。結(jié)論MCP-1具有直接促進(jìn)乳腺惡性腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力，且此種作用可能與p65、MMP2、STAT2、RASSF1有關(guān)。

人單核細(xì)胞趨化蛋白-1；乳腺腫瘤細(xì)胞；增殖；轉(zhuǎn)移

單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattratant protein-1，MCP-1)屬于C-C亞族(β亞族)成員，也稱為單核細(xì)胞趨化和激活因子，因此也縮寫為 CCL2。它主要作用是趨化血液中的巨噬細(xì)胞進(jìn)入局部組織中，并與腫瘤細(xì)胞相互作用形成一個(gè)獨(dú)特的富含各種生長因子和趨化因子的微環(huán)境。越來越多研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤局部組織中MCP-1表達(dá)水平的高低與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)，可作為患者預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)之一[1-4]。腫瘤局部微環(huán)境中的MCP-1與腫瘤局部血管生成密切相關(guān)[5]。此外研究還發(fā)現(xiàn)在腫瘤微環(huán)境細(xì)胞間隙的液體，胸腹水及血清中均檢測到MCP-1的存在[6-11]。

由此可見MCP-1在乳腺癌增殖浸潤及轉(zhuǎn)移中有著至關(guān)重要的作用，那么MCP-1作用機(jī)制有哪些呢？目前研究證明CCL2主要通過介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞同宿主細(xì)胞間對(duì)話，如趨化巨噬細(xì)胞進(jìn)入腫瘤局部，造成腫瘤局部微環(huán)境中單個(gè)核細(xì)胞免疫失衡，直接或間接釋放促血管生成因子，趨化和激活破骨細(xì)胞來促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。這些觀點(diǎn)得到了大多數(shù)學(xué)者的認(rèn)可，但是關(guān)于CCL2是否本身即具有直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性特征的研究結(jié)果卻存在很大爭議。目前有學(xué)者認(rèn)為MCP-1不具有直接促進(jìn)惡性腫瘤生長和存活的作用[12-13]，但可增加腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性和遷移能力[14]。

因此本研究將采用慢病毒載體將MCP-1基因?qū)隡CP-1低表達(dá)且低度惡性的MCF-7乳腺癌細(xì)胞，從細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察MCP-1對(duì)乳腺惡性腫瘤細(xì)胞是否具有直接促進(jìn)作用，并對(duì)MCP-1可能的下游基因做初步的研究。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫，慢病毒質(zhì)粒pCDH及相應(yīng)的輔助質(zhì)粒由上海復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。人胚腎T細(xì)胞(HEK-293T)由本實(shí)驗(yàn)室凍存。

1.2 方法

1.2.1 含MCP-1慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 于正常人基因組中克隆MCP-1基因片段，將其與慢病毒載體pCDH連接轉(zhuǎn)化。將構(gòu)建好的慢病毒載體在PUBMED網(wǎng)站經(jīng)BLAST比對(duì)，選用顯示完全正確、無突變堿基的構(gòu)建治療進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將含有MCP-1片段的慢病毒質(zhì)粒pCDH、包裝質(zhì)粒和衣殼質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，并收集病毒血清，之后感染MCF-7細(xì)胞。一般未經(jīng)濃縮的病毒顆粒感染Hela細(xì)胞兩次后病毒的感染效率可達(dá)60%左右。在無菌條件下經(jīng)流式細(xì)胞儀篩選后可獲得95%陽性細(xì)胞?？赏ㄟ^觀察細(xì)胞自帶的綠色熒光(pCDH中含有GFP綠色熒光蛋白)來評(píng)估感染效率和陽性細(xì)胞百分比。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和增殖實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞培養(yǎng)液為含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液。將原始乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)、EV-含空載質(zhì)粒乳腺癌細(xì)胞(MCF)、含有MCP-1過表達(dá)質(zhì)粒的乳腺癌細(xì)胞(MCP-MCF-7)置入37℃、含體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0.25%胰蛋白酶消化上述三種細(xì)胞，細(xì)胞懸液為含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液。將細(xì)胞接種于96孔板中，每孔體積為100 μL，含細(xì)胞數(shù)位每孔1×103個(gè)，之后置入CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于接種后第0天、1天、3天、5天、7天于每孔中加入20 μL CCK8，37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育2 h，置于波長為490 nm處讀取光密度(D)值，并軸繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.3 單克隆形成實(shí)驗(yàn) 0.25%胰蛋白酶消化MCF-7、EV-MCF、MCP-MCF-7細(xì)胞后將細(xì)胞接種在12孔板中，每孔含1 500個(gè)細(xì)胞，各3個(gè)復(fù)孔，之后放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第7天時(shí)取出細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)液，并用1×PBS洗滌3次。以0.1%的結(jié)晶紫和10%甲醇于室溫染色20 min，流水緩慢洗去染色液，空氣中干燥后拍照。之后，33%醋酸500 μL/孔洗脫結(jié)晶紫，酶標(biāo)儀洗脫液于檢測波長為560 nm處的D值，來評(píng)估細(xì)胞克隆數(shù)。

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測 0.25%胰蛋白酶消化MCF-7、EV-MCF、MCP-MC-7細(xì)胞，細(xì)胞接種于6孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)位2×105個(gè)，CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2 d后，采用細(xì)胞凋亡檢測試劑盒AnnexinⅤ-磷脂酰絲氨酸(PE)/7-AAD(7-amino-actinomycin D)試劑盒檢測細(xì)胞凋亡。收集細(xì)胞培養(yǎng)液至離心管中，以胰酶消化細(xì)胞之后加入前面收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打下所有的貼壁細(xì)胞，并將其輕輕吹散后再次收集至離心管內(nèi)。1 000×g離心3～5 min，吸除上清液，加入1 mL 4℃預(yù)冷的PBS，重懸后再次離心沉淀細(xì)胞，吸除上清液。去離子水按1︰4的比例稀釋鏈接緩沖液，以250 μL鏈接緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)濃度為1×106/mL。取100 μL細(xì)胞懸液置于5 mL流式管中，加入5 μL AnnexinⅤ-PE和10 μL 7-AAD溶液，混勻后于室溫避光孵育15 min，加入PBS 400 μL，應(yīng)用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)細(xì)胞凋亡數(shù)量。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 胰蛋白酶消化MDA-MB -231-NC、MDA-MB-231-2396細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于12孔板中，CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d形成單層細(xì)胞。在單層培養(yǎng)細(xì)胞上，用移液器槍頭沿著培養(yǎng)板底部做“一”字形劃痕，光學(xué)顯微鏡下記錄劃痕區(qū)的相對(duì)位置，再以無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)0 h、16 h、24 h、40 h時(shí)觀察并拍照，計(jì)算劃痕修復(fù)百分比，劃痕修復(fù)百分比=(細(xì)胞遷移距離/劃痕距離)×100%。

1.2.6 real-timePCR分析MCP-1下游基因mRNA水平的改變 轉(zhuǎn)錄好的MCP-MCF-7和EV-MCF-7細(xì)胞的cDNA作為模板，進(jìn)行 Real-time PCR，檢測MCP-1、p65、p52、FOXO3、FOXO1、STAT2、STAT3、STAT4、RASSF1、MMP2的表達(dá)情況。上述基因熒光定量PCR引物見表1，每個(gè)樣本做4個(gè)副孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。GAPDH為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞MCP-1表達(dá)情況鑒定 在紫外藍(lán)色熒光視野下觀察MCP-1或EV穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，可看到兩種構(gòu)建細(xì)胞中有綠色熒光表達(dá)正常，說明細(xì)胞構(gòu)建成功(圖1A、1B)。通過RT-PCR及west-blot半定量檢測MCP-1過表達(dá)情況。RT-PCR及west-blot結(jié)果均顯示MCP-1在MCP-MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于EV-MCF-7細(xì)胞和未作任何處理的MCF-7細(xì)胞(圖1C、1D)。

表1 Real-time RCR引物序列、Tm值及擴(kuò)增長度

2.2 MCP-1過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng) 實(shí)驗(yàn)證實(shí)從第5天起MCP-1過表達(dá)的MCF-7細(xì)胞株在450 nm處的吸光度(0.62±0.02)明顯高于EV-MCF-7(0.57±0.02)組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P= 0.049)；第7天時(shí)MCP-MCF-7細(xì)胞株在450 nm處的吸光度(0.71±0.02)明顯高于EV-MCF-7(0.62±0.01)組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.03)，說明MCP-1過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)(圖2A)。同時(shí)細(xì)胞計(jì)數(shù)法所得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與CCK-8法一致，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[第5天(286.67±6.51)vs(449.67±18.61)，P=0.00；第7天(797.33±11.15)vs(911.00±10.02)，P=0.00)](圖2B)。

2.3 MCP-1可增強(qiáng)MCF-7細(xì)胞集落形成能力 細(xì)胞接種后第14天時(shí)觀察細(xì)胞單克隆集落形成情況。用顯微鏡對(duì)集落進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示MCP-MCF-7細(xì)胞所形成的集落數(shù)量(24.17±1.41)明顯多余EV-MCF-7細(xì)胞(8.96±0.24)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)，且前者單個(gè)集落的體積亦大于后者。該結(jié)果表明MCP-1可增強(qiáng)MCF-7細(xì)胞的集落形成能力(圖3)。

圖1 成功構(gòu)建MCP-1過表達(dá)MCF-7細(xì)胞及空載對(duì)照細(xì)胞。

圖2 MCP-1對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響

圖3 MCP-1對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞集落形成能力的影響

2.4 MCP-1可以增加MCF-7乳腺癌細(xì)胞的遷移能力 本研究采用劃痕實(shí)驗(yàn)來觀察MCP-1對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響。在劃痕實(shí)驗(yàn)中12 h后MCP-MCF-7細(xì)胞的遷移能力開始增強(qiáng)，到48 h時(shí)劃痕更加明顯(圖4)。

2.5 MCP-1對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞凋亡無影響雖然轉(zhuǎn)染MCP-1后細(xì)胞有效凋亡百分比(0.57%)低于空載細(xì)胞(1.10%)，但是二者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(圖5)。

2.6 MCP-1下游基因篩選 MCP-1促進(jìn)乳腺腫瘤細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究中，筆者采用了RT-PCR及real-timePCR檢測p65、p52、FOX1、FOX3、MMP2、STAT2、STAT3、STAT4、RASSF1 mRNA水平的改變。將未作任何處理的MCF-7細(xì)胞作為內(nèi)參，比較EV-MCF-7細(xì)胞和MCP-MCF-7細(xì)胞中上述基因的改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示p65、MMP2、STAT2基因在MCP-MCF-7細(xì)胞中的mRNA水平較EV-MCF-7細(xì)胞增高，而RASSF1基因則出現(xiàn)降低(圖6)。提示p65、MMP2、STAT2和RASSF1基因有可能是MCP-1的下游基因。

圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)法觀察MCP-1對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響(10×)

圖5 AnnexinⅤ-PE/7-AAD凋亡檢測結(jié)果

圖6 real-time PCR檢測MCP-1下游基因

3 討 論

炎癥可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[1-3]，腫瘤細(xì)胞同炎癥細(xì)胞共同構(gòu)成了一個(gè)特殊的環(huán)境——腫瘤微環(huán)境(tumor microenviroment)。在這個(gè)環(huán)境中原本充當(dāng)人體衛(wèi)士的炎性細(xì)胞失去了其抗腫瘤的作用而成為了腫瘤細(xì)胞的營養(yǎng)供給者和轉(zhuǎn)移通道。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞作為腫瘤微環(huán)境中最主要的炎性細(xì)胞，可以分泌大量細(xì)胞及血管生長因子促進(jìn)腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移，同時(shí)它本身也可作為載體將腫瘤細(xì)胞運(yùn)送到遠(yuǎn)處組織，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生[4-6]。在腫瘤轉(zhuǎn)移灶中它亦可進(jìn)一步促進(jìn)轉(zhuǎn)移灶的生長和浸潤。

單核細(xì)胞趨化因子(monocyte chemoattratant protein-1，MCP-1或CCL2)是趨化血液中巨噬細(xì)胞進(jìn)入局部組織的主要細(xì)胞因子[7]。研究證實(shí)腫瘤組織及患者血清中MCP-1的水平與乳腺癌患者的預(yù)后密切相關(guān)[8,15]。但是目前有研究認(rèn)為MCP-1的促腫瘤增殖轉(zhuǎn)移作用是通過其誘導(dǎo)TAM等炎性細(xì)胞進(jìn)入腫瘤部位后釋放各種因子所造成的，而MCP-1本身并不具有促腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的作用[8，13，15]。但是也有很多研究認(rèn)為MCP-1本身可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。Melanie等[16]進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)侵襲性較高的細(xì)胞系MAD-MB-231、BT549、HS578T表達(dá)高水平的MCP-1，而低侵襲性的MCF-7和T470則基本不表達(dá)MCP-1給予外源性雌激素后，腫瘤細(xì)胞內(nèi)MCP-1的水平明顯升高，同時(shí)細(xì)胞的惡性度增高[17]。用shRNA干擾MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系中MCP-1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)荷瘤小鼠肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量明顯減少，約為對(duì)照組的1/3[18]。給予荷瘤裸鼠CCL2的中和性抗體后，肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量亦明顯減少，小鼠生存期延長[19]。

在本研究中筆者發(fā)現(xiàn)MCP-1過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞在接種后第5天時(shí)增殖能力出現(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的升高(P＜0.05)。在單克隆形成實(shí)驗(yàn)中可以觀察到接種后14 d MCP-1過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞所形成的細(xì)胞集落數(shù)量明顯多于EV-MCF-7細(xì)胞(P＜0.05)，且在集落形態(tài)上亦大于后者。劃痕實(shí)驗(yàn)則表明MCP-1可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移(P＜0.05)。這些結(jié)果均提示MCP-1本身即具有促進(jìn)乳腺惡相腫瘤細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移的能力，但它對(duì)細(xì)胞的凋亡無明顯作用。

在對(duì)MCP-1下游基因的初步研究中，我們采用了比較MCP-MCF-7細(xì)胞和EV-MCF-7細(xì)胞real-time PCR結(jié)果。研究結(jié)果顯示MCP-1過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞中p65、MMP2、STAT2基因的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，同時(shí)RASSF1基因的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，提示MCP-1有可能通過調(diào)節(jié)這些下游基因而發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖浸潤及轉(zhuǎn)移。在這些下游基因中p65為核因子-核因子過調(diào)節(jié)這些下二聚體中的一種，研究發(fā)現(xiàn)該蛋白可以與多種基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子上NF-中的結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合進(jìn)而促進(jìn)該基因的轉(zhuǎn)錄。在多種腫瘤細(xì)胞的研究均表明NF-點(diǎn)特通過促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)，pRB高磷酸化和G1/S其轉(zhuǎn)換來加速細(xì)胞周期的進(jìn)行，抑制細(xì)胞分化，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)失控使細(xì)胞表現(xiàn)為無限增殖和自主分裂狀態(tài)，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[20-21]。此外NF-2還參與了細(xì)胞粘附、血管生成相關(guān)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，如細(xì)胞間粘連分子(ICAM)、基質(zhì)金屬蛋白-9(MMP-9)環(huán)氧化酶-2(COX-2)等?；|(zhì)金屬蛋白作為蛋白水解酶，可以降解細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜，是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中最為關(guān)鍵的一步。此外MMP-2也具有促進(jìn)腫瘤新生血管生成的作用[22-23]。由此可見，MCP-1可以通過對(duì)P65、MMP2、下游基因的調(diào)節(jié)來直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移。STATs為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子，是一類重要的核轉(zhuǎn)錄因子，其中STAT1和STAT2細(xì)胞凋亡調(diào)控有關(guān)，而STAT3作為癌基因的一種參與細(xì)胞增殖調(diào)控[24-25]。RASSF1也是一種可以直接參與細(xì)胞周期調(diào)控，在體內(nèi)和體外能抑制細(xì)胞生長，并參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的蛋白。RASSF1基因的下調(diào)則可減少對(duì)細(xì)胞增殖的抑制，減少細(xì)胞凋亡。但在本研究的凋亡實(shí)驗(yàn)中，未發(fā)現(xiàn)MCP-1有抑制乳腺腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，提示可能存在其他信號(hào)途徑來對(duì)抗MCP-1對(duì)STAT2和 RASSF1的調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，在本研究中我們利用慢病毒載體介導(dǎo)成功構(gòu)建出可以過表達(dá)MCP-1基因的MCF-乳腺癌細(xì)胞。通過比較MCP-MCF-7細(xì)胞和EV-MCF-7細(xì)胞在細(xì)胞增殖能力，單克隆集落形成能力、劃痕愈合和transwell小室遷移能力，得出MCP-1本身即具有促進(jìn)乳腺腫瘤細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移的能力，而非僅僅依靠其趨化功能吸引TAM等細(xì)胞進(jìn)入腫瘤部位釋放各種細(xì)胞因子來促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。通過real-time PCR實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)MCP-1促腫瘤增殖能力可能是通過調(diào)節(jié)P65和MMP2基因的轉(zhuǎn)錄來完成的。

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Function of MCP-1 in malignant breast carcinoma cells proliferation and metastasis.

LV Ming-li,ZHOU Yun, ZHOU Lei-ping,NIU Jian-mei.Department of Ultrasonography,International Peace Maternity&Child Health Hospital, School of Medicine,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200030,CHINA

Objective To analyze the function of monocyte chemotactic protein-1(MCP-1)in promoting proliferation and metastasis of malignant breast cancer cells.MethodsMCF-7 cells with MCP-1 over-expression and no-load MCF-7 cells(control)were constructed,which were labeled as MCP-MCF-7 and EV-MCF-7 respectively.The CCK8 cells proliferation assay,colony formation assay,scratch assay and cell apoptosis assay were employed to measure the effect of MCP-1 over-expression on MCF-7 cells proliferation,metastasis and apoptosis.Real-time PCR was used to identify candidate downstream genes.ResultsThe MCP-1 over-expressed MC-7 cells and control cell line were successfully constructed.CCK8 assay showed that the absorbance of MCP-MCF-7 at 450 nm was higher than that of EV-MCF-7 from day 5,and the statistical significance was significant(P＜0.05).Colony formation assay illustrated that colony number was significantly higher in MCP-MCF-7 cells than the EV-MCF-7 cells(P＜0.05),and colony volume was larger in MCP-MCF-7 cells.Scratch assay demonstrated that the migratory ability of MCP-MCF-7 cell increased at 12 hours,and wound healing became more evident at 48 hours.The percentage of early apoptotic MCP-MCF-7 cells(0.57%)was lower than that in EV-MCF-7 cells(1.10%),with no statistically significant difference (P＞0.05),which suggested no effect on MCP-1 induced apoptosis in MCF-7 cells.Real-time PCR analysis of the MCP-1 downstream-regulated gene indicated that p65,MMP2 and STAT2 gene were up-regulated,while RASSF1 gene was down-regulated.ConclusionMCP-1 directly promotes breast carcinoma cell proliferation and metastasis.This effect may relate to candidate genes p65,MMP2,STAT2 and RASSF1.

MCP-1;Breast carcinoma cells;Proliferation;Metastasis

R737.9

A

1003—6350(2017)06—0861—06

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.06.001

2016-12-16)

國家自然科學(xué)基金(編號(hào)：81402386)；中國福利會(huì)國際和平婦幼保健院優(yōu)秀青年培育計(jì)劃

呂明麗。E-mail：great8181@sina.com