王凱+張昊

從培養(yǎng)條件、培養(yǎng)成本、培養(yǎng)環(huán)境、抑菌劑及現(xiàn)階段存在的問題幾個方面綜述了植物開放式組織培養(yǎng)研究的進(jìn)展，并展望了未來發(fā)展的前景。

【關(guān)鍵詞】污染；開放式組織培養(yǎng)；抑菌劑

1839年，德國生理學(xué)家Theodor Schwann（西奧多·施旺）首次提出“細(xì)胞學(xué)”的概念，指出細(xì)胞有機(jī)體在適宜的外部條件下都具有獨立發(fā)育的潛能，在其之后，Haberlandt進(jìn)一步提出了“細(xì)胞培養(yǎng)”的概念，提出了植物細(xì)胞全能性理論。自此，開放式組織培養(yǎng)研究迎來高潮，高效植物繁殖技術(shù)空前發(fā)展并帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)價值，被廣泛的應(yīng)用于科研與生產(chǎn)各項領(lǐng)域之中。但由于植物組織培養(yǎng)技術(shù)對于無菌環(huán)境的要求極為嚴(yán)格，僅就目前的科研水平來說，常態(tài)化的保持無菌環(huán)境成本巨大，加之植物的種類、取材的時間、處理的方法、消毒的方式以及工作臺的質(zhì)量等都有可能產(chǎn)生污染，因此污染問題的控制成為限制植物組織培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展以及推廣與普及的瓶頸，迫切需要進(jìn)行研究和提升。本文即從培養(yǎng)條件、培養(yǎng)成本、培養(yǎng)環(huán)境、抑菌劑及現(xiàn)階段存在的問題出發(fā)，闡述植物開放式組織培養(yǎng)的應(yīng)用現(xiàn)狀及發(fā)展前景，并提出相關(guān)間接和建議，希望能為組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展提供理論借鑒和參考，略盡綿薄之力。

1 培養(yǎng)條件

在煙草組織培養(yǎng)試驗中，利用自然溫度和太陽輻射光代替日光燈進(jìn)行固體培養(yǎng)，取得了很好的效果，同時在組培室的設(shè)計中如何建立理想的利用自然光源的組培室也是至關(guān)重要的，培養(yǎng)器容器也有簡化的相關(guān)報道，極大降低了成本。在非洲菊組培快繁中讓自然溫度和太陽輻射光來代替日光燈和空調(diào)等設(shè)備，如此就可減少用電量，降低成本，且不影響試管苗的質(zhì)量。

2 減少成本的研究

為進(jìn)一步降低植物組織培養(yǎng)成本，我們分別以自來水、蒸餾水、雨水為材料進(jìn)行試驗配制培養(yǎng)基。通過相關(guān)數(shù)據(jù)分析，利用自來水與蒸餾水所配制出來的培養(yǎng)基上的植物生長情況數(shù)據(jù)相近，發(fā)育正常；而用三者進(jìn)行馬鈴薯的培養(yǎng)試驗時，發(fā)現(xiàn)雨水所制作出的培養(yǎng)基較自來水以及蒸餾水更有利于植株發(fā)展，雨水所制作的培養(yǎng)基馬鈴薯根多而長、植株深綠、發(fā)育優(yōu)良，更有利于移栽（有些工業(yè)地區(qū)的雨水呈酸性，因此，這些地區(qū)的雨水會對植物的生長產(chǎn)生不利影響，不能用來配制培養(yǎng)基）。

除了選取材料以控制植物組織培養(yǎng)成本之外，培養(yǎng)容器的選擇也是減少成本的又一重要方式。該項實驗中，我們分別以罐頭瓶、簡易塑料瓶、傳統(tǒng)三角瓶等材料對象進(jìn)行試驗，研究發(fā)現(xiàn)：使用冰盒及塑料盒對櫻桃和蘋果進(jìn)行瓶外生根試驗時，同使用三角瓶時作物發(fā)育情況基本相同且生長狀態(tài)更為良好（但是塑料盒容積較大時，植株褐化嚴(yán)重、少數(shù)愈傷組織變褐，導(dǎo)致植株被污染或壞死）。此外，一次性塑料杯在實驗室雖然同罐頭瓶、簡易塑料瓶等材料數(shù)據(jù)相同，但使用及密封過于繁瑣和耗材，因而不適用于在組織培養(yǎng)中應(yīng)用。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，含糖濃度以及有機(jī)物較低的生長環(huán)境不適宜菌類的生長，所以為實現(xiàn)營造無菌環(huán)境和減少研究成本兩大目的，需要對植物種類所需糖濃度和有機(jī)物數(shù)量進(jìn)行相關(guān)研究，選取最合適的環(huán)境進(jìn)行組織培養(yǎng)。

袁麗娜研究發(fā)現(xiàn)，卡拉膠比瓊脂粉更能促進(jìn)東北紅豆杉愈傷組織的增加，而培養(yǎng)基對于東北紅豆杉值體的影響較小。此外，研究發(fā)現(xiàn)，半固態(tài)的培養(yǎng)基更有利于對東北紅豆杉的細(xì)胞曾重。解輝在香蕉初代培養(yǎng)采用自然光，半液態(tài)培養(yǎng)基，提高了香蕉培養(yǎng)的增殖倍數(shù)，利于移栽成活，另外還可用棉籽殼、珍珠巖等代替生根培養(yǎng)基的固化物，不僅能降低成本，減少生根過程中愈傷組織的產(chǎn)生，而且還提高了生根率。

現(xiàn)階段植物無糖培養(yǎng)逐漸成為植物組織培養(yǎng)的焦點，出現(xiàn)簡化組織培養(yǎng)、降低污染的全新方向。無糖組織培養(yǎng)技術(shù)克服了常規(guī)組織培養(yǎng)過程中普遍的培養(yǎng)容器中氣體環(huán)境差、易污染等問題。無糖組織培養(yǎng)是利用工程技術(shù)手段調(diào)控組培微環(huán)境的CO2、濃度、光照、濕度等因子，提高組培苗質(zhì)量，山芋在無糖組織培養(yǎng)培養(yǎng)基中未加入糖，通過人工環(huán)境的控制，用二氧化碳代替蔗糖為植物提供碳源，污染率也隨之降低 ，添加谷氨酸是促進(jìn)無糖培養(yǎng)的一條好途徑。20世紀(jì)80年代后期由日本千葉大學(xué)的古在豐樹教授研究開發(fā)組培新技術(shù)，自開發(fā)以來備受人們的關(guān)注。

3 培養(yǎng)環(huán)境

3.1 pH值

植物形態(tài)生成及器官發(fā)育與pH值的聯(lián)系不可分割，特別是對培養(yǎng)基的軟硬度、鹽類是否沉淀及外植體生長發(fā)育起到?jīng)Q定性作用。在培養(yǎng)基配制時pH值大多調(diào)整在5.3-5.7之間（固體培養(yǎng)基約為5.7；液體培養(yǎng)基約為5.3） 。pH值太高會導(dǎo)致固體培養(yǎng)基過硬而影響實驗數(shù)據(jù)，反之，pH值太低的話又會導(dǎo)致培養(yǎng)基不易凝結(jié)，同樣不利于實驗進(jìn)行。培養(yǎng)基經(jīng)高溫高壓殺菌或長時間的培養(yǎng)均會使pH值降低。降低培養(yǎng)基的pH值，可促進(jìn)硝酸態(tài)氮的利用量，而提高pH值則使錢態(tài)氮利用率提高。

3.2 光源

使用適當(dāng)?shù)墓庠凑丈渲参铮兄谥参锏纳婚L，但在誘導(dǎo)愈傷組織時，大多不照光。適當(dāng)?shù)墓庠赐ǔＰ枰紤]光照的強度，光周期及光譜性質(zhì)。一般實驗室以14/10小時的光/暗周期為主。有學(xué)者考察一系列光源對植物體的影響，指出藍(lán)光有助于莖頂培養(yǎng)的芽體誘導(dǎo)；紅光有助于植物形成不定根。所以藍(lán)光和紅光組合使用，或用全太陽光做為植物生長燈成為實驗室的普遍選擇。這可能和細(xì)胞對光反應(yīng)的生理狀態(tài)有關(guān)。

3.3 光

光在植物的生長發(fā)育過程中起到至關(guān)重要的作用，主要體現(xiàn)在光照時間的長短會影響百合等植株的休眠狀態(tài)（主要發(fā)生在植株球根的生長和發(fā)育階段）、不同的光環(huán)境會影響植株的莖葉緊密度和結(jié)實度以及光照程度會影響植株表皮顏色的深淺上。有實驗表明，隨著光照強度的增加，植物玻璃化現(xiàn)象逐漸加重，光強達(dá)到40001ux以上時，組培苗的生長較差。有研究者曾經(jīng)對蘭州百合進(jìn)行過光照實驗，所設(shè)置的實驗情境為8h黑暗2000LuX16h光照、12h黑暗12h光照兩種。研究發(fā)現(xiàn)，暗培養(yǎng)環(huán)境有助于降低植株的褐化率，光暗交替培養(yǎng)環(huán)境褐化率則較高，暗處理下的蘭州百合愈傷組織部分呈現(xiàn)為白色或淺黃色，莖葉部分也比光暗交替條件下更為緊密。此外，實驗數(shù)據(jù)還證明，黑暗條件下培養(yǎng)180d后轉(zhuǎn)入光照條件下培養(yǎng)可提高庸香百合愈傷組織誘導(dǎo)率與分化率。但是需要注意的是，在暗培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)出的植株會出現(xiàn)明顯的休眠狀況且暗培養(yǎng)環(huán)境下不利于不定芽和小鱗莖的葉片的生長。

3.4 溫度

溫度是影響組織培養(yǎng)的又一個關(guān)鍵性因素，是影響百合鱗莖休眠的最主要因子。實驗證明，低溫條件下外植物的分化活動變得更為活躍，提高了鱗莖的生理活性，從而有助于促進(jìn)該植株的生長和發(fā)育。此外，高溫（28-29℃）培養(yǎng)與叢芽繼代方式實現(xiàn)了蘭州百合高頻溫燙處理種球可顯著提高‘多安娜及‘普瑞頭幼的耐熱性。一般實驗室對相對濕度容易忽視，導(dǎo)致霉菌及微生物滋生，或造成玻璃質(zhì)化現(xiàn)象，一般濕度以70%為宜。

3.5 水

水分在植物的生長中發(fā)揮著極其重要的作用，植物生長的每一個階段都離不開水，水分虧缺往往可以加速百合休眠，甚至可以直接引起休眠，所以根據(jù)目的不同可以通過水分來調(diào)控百合的休眠。除此之外物理作用也會影響百合的生長和分化，微直流可促進(jìn)多種植物培養(yǎng)組織的生長和分化。一般實驗室以14/10小時的光/暗周期為主，濕度高易滋生霉菌及微生物，或造成組培苗質(zhì)量下降的現(xiàn)象。

4 現(xiàn)階段開放式組培存在的問題

植物組織培養(yǎng)中最容易出現(xiàn)的是污染問題。在植物組培過程中，組培瓶清洗不干凈、培養(yǎng)基滅菌不徹底、接種用具滅菌不嚴(yán)格、超凈工作臺帶菌太多、無菌操作不規(guī)范、接種室消毒不嚴(yán)格或后期培養(yǎng)室管理不規(guī)范等均會導(dǎo)致污染的發(fā)生。實驗人員的操作手段也會引起污染，要防止實驗人員被微生物感染。

4.1 廣譜性抑菌劑的問題

不同的植物在組培過程中產(chǎn)生的污染菌類不同，菌類的種類及抗性又具有很大的復(fù)雜性，就現(xiàn)階段而言還沒有找到針對各種污染菌類均有抑制作用的廣譜性抑菌劑，已投入使用的部分抑菌劑有次氯酸鈉，代森錳鋅等?，F(xiàn)階段已有人發(fā)現(xiàn)對部分植物具有廣譜性殺菌能力的抗菌劑，但是對于大部分植物的抑菌劑仍未報道。

4.2 抑菌劑對組培苗的生長是否有影響

在植物開放組織培養(yǎng)中培養(yǎng)基加入抑菌劑對植株生長是否具有抑制作用僅就目前的實驗數(shù)據(jù)和科學(xué)論證而言還沒有統(tǒng)一定論。目前僅能確定的是針對某些已經(jīng)通過實驗進(jìn)行分析的植物所篩選出來的抑菌劑是對植物生長沒有影響的，但是繼代培養(yǎng)之后的變異情況還需要另行分析或?qū)嶒炑芯?，尤其是在如今抑菌劑對苗木的抑制作用的機(jī)理相關(guān)理論尚未突破的情況下。

4.3 開放式組織培養(yǎng)的培養(yǎng)環(huán)境問題

迫于技術(shù)條件的限制，現(xiàn)階段的開放式組織培養(yǎng)研究還不十分成熟，培養(yǎng)環(huán)境還沒有達(dá)到自然培養(yǎng)的要求，僅限于在溫室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)（只需要進(jìn)行規(guī)范的操作和精確的環(huán)境控制即可），存在較大的局限性，迫切需要在形式上和技術(shù)上予以突破。但目前，開放組培和光自養(yǎng)微繁殖還處于探索階段，其中包括廣譜抑菌劑的篩選和抑菌劑對組培苗生長影響、培養(yǎng)環(huán)境問題。

5 展望

傳統(tǒng)組織培養(yǎng)的重中之重在于無菌，并且需要昂貴的設(shè)備，技術(shù)要求苛刻，難以廣泛應(yīng)用普及。近些年無數(shù)科學(xué)家探索簡化傳統(tǒng)組織培養(yǎng)，但均未獲得顯著突破。組培污染主要是由于富含營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基，給各種菌類提供了適宜的滋生場所。由此，只要將培養(yǎng)基改造成即保證植物組織正常生長，找到一種能夠添加到培養(yǎng)基的廣譜性殺菌劑使植物組織培養(yǎng)脫離嚴(yán)格無菌的操作環(huán)境，具有殺菌、抗菌功能的培養(yǎng)基，進(jìn)行開放式組織培養(yǎng)是完全可能的。近幾年來，已有不少植物組織培養(yǎng)簡化成功，并應(yīng)用于生產(chǎn)。國外已經(jīng)有100多個以高檔花卉、蔬菜為主的植物品種實現(xiàn)了組培產(chǎn)業(yè)化。我國僅有香蕉、馬鈴薯、草幕、蘭花等少數(shù)實現(xiàn)了組培產(chǎn)業(yè)化。

由于一些添加抑菌劑的組培苗會出現(xiàn)褐化，生長較緩慢，增殖倍數(shù)較低等影響，這是建立開放式組培難以解決的重要環(huán)節(jié)。因此，篩選并研究合適的抑菌劑對組培苗生長發(fā)育影響生理，從建立具有較高增殖倍數(shù)和生根率的高效開放式組織培養(yǎng)體系，成為組培新技術(shù)研究的焦點。

有理由相信，開放式組織培養(yǎng)若實現(xiàn)了低配置成本與無菌環(huán)境普及兩大瓶頸，定會帶來巨大的經(jīng)濟(jì)價值和廣闊市場。因而如何實現(xiàn)其成本減少與無菌環(huán)境普及兩大難題將是未來較長一段時間內(nèi)的研究重點、熱點和難點，衷心期望植物培養(yǎng)組織技術(shù)能真正在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)普及，從而為現(xiàn)代大農(nóng)業(yè)的發(fā)展奠定堅實的技術(shù)支持。

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作者簡介

王凱（1991-），男，陜西省安塞縣人。碩士學(xué)位。研究方向為生物化學(xué)與分子生物學(xué)。

張昊（1987-），男，陜西省涇陽縣人。碩士學(xué)位。研究方向為生物化學(xué)與分子生物學(xué)。

作者單位

延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 陜西省延安市 716000