隋 麗，王 豫，關(guān) 華，孔福全，周平坤

（1.中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京100850；2.中國原子能科學(xué)研究院，北京102413）

·基礎(chǔ)研究·

重離子所致DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)的γH2AX焦點響應(yīng)

隋 麗1，2，王 豫1，關(guān) 華1，孔福全2，周平坤1

（1.中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京100850；2.中國原子能科學(xué)研究院，北京102413）

DNA雙鏈斷裂（DSB）是電離輻射所致基因組DNA的主要和最嚴(yán)重的損傷類型，磷酸化組蛋白γH2AX能比較特異地在DSB處形成焦點，是DSB的分子標(biāo)志物之一。比較了重離子7Li、12C與γ射線輻照小鼠MEF細(xì)胞誘發(fā)γH2AX焦點的規(guī)律特征。結(jié)果顯示，誘發(fā)形成的平均每個細(xì)胞的γH2AX焦點數(shù)目與照后時間相關(guān)，表達(dá)峰值出現(xiàn)在照后2 h，但不同類型輻射高表達(dá)的持續(xù)時間不同。在相同劑量下，致焦點形成率與輻射的LET值相關(guān)，LET值越高，形成率越大。γ射線誘發(fā)的γH2AX焦點尺寸隨照后時間無明顯變化，高LET重離子誘發(fā)的γH2AX焦點尺寸隨時間變化先增加后減小；與低LET的γ射線相比，高LET輻射誘發(fā)的焦點平均尺寸明顯變大，LET越高焦點尺寸越大且保持時間越長。

基因組穩(wěn)定性；DNA雙鏈斷裂；DNA修復(fù)；磷酸化組蛋白H2AX聚焦點；重離子；γ射線

1 引言

基因組DNA是放射損傷的關(guān)鍵靶，DNA損傷是引發(fā)包括早期確定效應(yīng)或組織反應(yīng)和遠(yuǎn)后致癌效應(yīng)在內(nèi)的健康危害的放射生物學(xué)原初效應(yīng)［1］。DNA雙鏈斷裂（DNA Double?Strand Break，DSB）是電離輻射誘發(fā)的眾多DNA損傷中最為關(guān)鍵的一種，它的正確和完全修復(fù)可保證細(xì)胞的存活和基因組的穩(wěn)定，而錯誤修復(fù)和殘余DNA損傷將導(dǎo)致細(xì)胞的死亡、突變和發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化［2?4］。當(dāng)DSB發(fā)生時，與基因組DNA密切接觸的組蛋白H2AX在其 SQE基序上的第139絲氨酸迅速發(fā)生磷酸化修飾，并聚焦于 DSB處，在數(shù)量上與DSB位點形成一一對應(yīng)的磷酸化H2AX焦點，即γH2AX foci［5?8］。因此，通過γH2AX特異性抗體和分子免疫熒光激光共聚焦技術(shù)檢測γH2AX，可以確定細(xì)胞中DNA雙鏈斷裂損傷的發(fā)生和修復(fù)情況。進(jìn)一步通過激光共聚焦顯微鏡的斷層掃描優(yōu)勢，可克服非焦平面及焦平面非焦點光斑信息，提高分辨率和圖像清晰度，實現(xiàn)在細(xì)胞中的精確定位、定量和斑點尺寸變化規(guī)律的分析。借助此技術(shù)，本文研究比較了重離子與γ射線照射小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）誘發(fā)的DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)及γH2AX焦點的尺寸效應(yīng)。

2 實驗材料與方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)

實驗采用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF），由美國哥倫比亞大學(xué)放射生物學(xué)中心Tom Hei教授提供，本實驗室保存。細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液、飽和濕度、37℃恒溫和5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。DMEM和胎牛血清均購自Hyclone公司。為了便于免疫熒光實驗，輻照前24小時將細(xì)胞接種和生長于蓋玻片上。

2.2細(xì)胞輻照

實驗分別使用2 Gy劑量的12C離子、7Li離子和γ射線輻照細(xì)胞。

12C離子輻照在中國科學(xué)院近代物理研究所的重離子加速器上進(jìn)行，離子的能量為300 MeV／u，對應(yīng)在水中的LET值為12.6 keV／μm，射程約為15 cm，劑量率為0.35 Gy／min。因為粒子束流為水平出射，所以在輻照前先將置有細(xì)胞爬片的培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液倒掉，再將培養(yǎng)皿面向束流接受輻照，輻照完畢后立即加入培養(yǎng)液繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。

7Li離子輻照在中國原子能科學(xué)研究院的HI?13串列加速器裝置上進(jìn)行，離子的能量為37.3 MeV，對應(yīng)在水中的LET值為70.2 keV／μm，射程約為300 μm，劑量率為0.33 Gy／min。

γ射線（LET為0.2 keV／μm）輻照在軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所60Co輻照裝置上進(jìn)行，樣品輻照方法同重離子照射，輻照劑量率為0.22 Gy／min。

2.3 γH2AX的免疫熒光檢測及定量分析

細(xì)胞受照后立即置于37℃恒溫、飽和濕度的5%二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在照后0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h和24 h的不同時間點收取長有細(xì)胞的玻片，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2遍，用4℃預(yù)冷的 4%多聚甲醛固定過夜。PBS洗 3× 10 min，0.3%Triton?100冰上透化15 min，然后使用3%的胎牛血清白蛋白（BSA）封閉1 h，再用抗γH2AX的一抗（購自 Upstate）按1∶200稀釋后4℃孵浴過夜，1%BSA洗3×5 min。接著使用熒光標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗（FITC）按1：1000稀釋后室溫孵育1 h，再用PBS洗3×5 min，DAPI對細(xì)胞樣品染色5 min，PBS洗3×5 min，10%甘油封片，最后用掃描激光共聚焦顯微鏡40×物鏡觀察γH2AX焦點。對于每一個樣品，均隨機選取5個不同區(qū)域進(jìn)行掃描成像，細(xì)胞統(tǒng)計數(shù)不少于100個。每個細(xì)胞核內(nèi)的γH2AX焦點同時使用人工和Image J（National Institutes of Health）圖像分析軟件兩種方法進(jìn)行統(tǒng)計，以驗證結(jié)果的可靠性。每個γH2AX焦點的大小由Image J軟件定量得到。

2.4統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果中所有數(shù)據(jù)用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，組間比較采用方差分析及t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析，所有統(tǒng)計結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)方差表示。

3 結(jié)果與討論

3.1 γ射線、12C和7Li重離子照射細(xì)胞誘發(fā)γH2AX焦點的變化規(guī)律

圖1（a）為激光共聚焦掃描顯微鏡觀測到的小鼠成纖維細(xì)胞MEF在2 Gy γ射線輻照后0.5～24 h不同時間點的γH2AX焦點變化情況。從圖中可以直觀地看到，與對照細(xì)胞相比，照后0.5 h細(xì)胞中的γH2AX焦點數(shù)量就有了明顯增多。隨著時間的增加，γH2AX焦點的表達(dá)出現(xiàn)先增后減的變化趨勢。而且，輻照后細(xì)胞核中的γH2AX焦點基本呈現(xiàn)為均勻和分散的分布規(guī)律，即使在焦點數(shù)很多的細(xì)胞中也是如此，體現(xiàn)了γ射線稀疏電離輻射的特性。

對不同時間點細(xì)胞樣品中的γH2AX焦點和細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計，得到了平均每個細(xì)胞中γH2AX焦點隨時間的變化情況（圖1（b））。在照后0.5 h焦點數(shù)就增加到了1.54個，約為對照樣品中的13倍。隨著時間的推移，焦點數(shù)繼續(xù)上升，至2 h時達(dá)到最大值2.4個，之后開始下降，但趨勢極為緩慢，到24 h時基本恢復(fù)到本底水平，尤其在8 h之后至24 h進(jìn)入比較全面的修復(fù)階段。

以每個細(xì)胞中的γH2AX焦點數(shù)為統(tǒng)計對象，得到了細(xì)胞中焦點數(shù)量的分布情況。圖1（c）給出了輻照后0.5 h、2 h和8 h的不同γH2AX焦點數(shù)細(xì)胞的分布圖?？梢钥吹剑瑢τ谶@三個時間點來說，有45%～50%的細(xì)胞沒有觀察到γH2AX焦點。每個細(xì)胞中形成的焦點數(shù)量，以1～3個為最多，占到了25%～35%。其次是4～6個和7～9個，分別占到了10%～15%和4%～5%，其中8 h點略占優(yōu)勢。數(shù)量介于10～15個的在2 h和8 h時出現(xiàn)，比例為3%～5%，其中2 h點比例略高于8 h。而數(shù)量大于19的只出現(xiàn)在2 h，且僅占了不到1%。由此可見，從2 h到8 h這段時間內(nèi)，每個細(xì)胞中的焦點數(shù)量在逐漸減少，這一變化趨勢暗示了細(xì)胞的緩慢修復(fù)過程。此外，對于γ射線輻照后每一個時間點來說，焦點數(shù)量越少的細(xì)胞在細(xì)胞總數(shù)中占的比例越多。

圖2給出了12C重離子以2 Gy劑量輻照MEF細(xì)胞后，在0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h和24 h的不同時間點，細(xì)胞中γH2AX焦點的變化情況。由圖2（a）可見，γH2AX焦點直觀圖像的變化趨勢與γ射線類似，即隨著時間的推移，呈現(xiàn)先增加后減少的變化規(guī)律。但在相同時刻，與γ射線相比，形成焦點的數(shù)量多、尺寸大。而且焦點多在核內(nèi)的局部區(qū)域成簇出現(xiàn)，與γ射線誘發(fā)的均勻和分散的分布規(guī)律截然不同。

圖2 （b）為12C離子輻照后，每個細(xì)胞平均γH2AX焦點數(shù)隨照后時間變化的動力學(xué)曲線。從整體變化趨勢看，它與γ射線誘發(fā)的相同，即焦點數(shù)量先增加而后減少。形成的焦點數(shù)量上，在2 h之前（含2 h）各時間點和24 h高于γ射線，但在4～8 h期間又低于γ射線，而且與其自己的2 h點相比，4 h點數(shù)量減少了28%。很明顯，12C離子輻照后24 h，細(xì)胞中焦點的數(shù)量相對較高，提示12C離子由于其高能和高 LET值，在局部范圍內(nèi)電離密度較高，可能會形成相對多的不易修復(fù)的簇集DSB，導(dǎo)致DNA殘留損傷的增加。

圖2（c）為12C離子輻照后0.5 h、2 h和8 h單個細(xì)胞中形成的γH2AX焦點數(shù)量的細(xì)胞分布圖。從整體看，分布規(guī)律與 γ射線的相似，焦點數(shù)集中于柱狀圖的左側(cè)，即較少焦點區(qū)域。不同之處是，在2 h和8 h點，無 γH2AX焦點的細(xì)胞所占比例減少了25%。而且形成的γH2AX焦點數(shù)量在1～18個范圍內(nèi)分布，同比所占比例明顯高于γ射線產(chǎn)生的，尤其是在照射后8 h出現(xiàn)一個含有16～18個焦點數(shù)細(xì)胞分布次高峰期。這說明12C離子在細(xì)胞核單位面積上誘發(fā)的γH2AX焦點數(shù)更多，反映出了高能量的12C離子在穿過細(xì)胞時，沉積的能量強于γ輻射。此外，重離子還有可能干擾了細(xì)胞的氧化應(yīng)激系統(tǒng)，致使局部產(chǎn)生代謝性高濃度的自由基，導(dǎo)致繼發(fā)性 DNA損傷的發(fā)生。

圖3（a）給出了7Li離子以2 Gy劑量輻照MEF細(xì)胞后，在0.15 h、0.5 h、1 h、2 h、8 h和24 h的不同時間點，細(xì)胞中γH2AX焦點的觀察結(jié)果?？梢?，焦點量的變化趨勢與 γ射線和12C離子類似，即隨著時間的推移，呈現(xiàn)先增加后減少的變化規(guī)律。但在相同時刻，與 γ射線甚至12C離子相比，形成焦點的數(shù)量多，尺寸大。而且焦點多在核內(nèi)的局部區(qū)域成簇出現(xiàn)，有些甚至呈斑塊狀。

圖3 （b）為7Li離子輻照后不同時間點，平均每個細(xì)胞中γH2AX焦點數(shù)的定量結(jié)果。如圖所示，焦點數(shù)在照后0.25 h就激增到了2.2個，接近γ射線的最高表達(dá)水平。隨著時間的增長，焦點數(shù)急劇上升，到2 h時達(dá)到峰值，約為0.25 h時的3倍，γ射線相同時間點的2.8倍，隨后開始逐漸減少，8 h時減為峰值的83%。之后繼續(xù)減少，至24 h時變?yōu)?.24個，約為本底水平和γ射線相同時間點的2倍。γH2AX焦點數(shù)在照后0.25～2 h急劇增加現(xiàn)象的一種可能解釋是，在7Li輻照后的細(xì)胞中，存在大量的非雙鏈斷裂DNA集簇性損傷，這些損傷在細(xì)胞的修復(fù)過程中雙鏈DNA的兩條在相臨近的位點被同時切割而轉(zhuǎn)化為新的雙鏈斷裂，隨著時間的延長，這些損傷又被逐漸修復(fù)，因而又出現(xiàn)逐漸減少的現(xiàn)象，體現(xiàn)了細(xì)胞中針對復(fù)雜的集簇?fù)p傷的修復(fù)機制的存在。

圖3（c）為7Li離子輻照后0.5 h、2 h和8 h單個細(xì)胞中形成的γH2AX焦點數(shù)量的細(xì)胞分布圖。對于2 h僅有6%沒有出現(xiàn)焦點，表明此時絕大多數(shù)細(xì)胞中的DNA都發(fā)生了雙鏈斷裂。而且2 h與其它兩個時間點相比，焦點數(shù)的分布區(qū)間明顯后移，表明2 h時刻每個細(xì)胞中出現(xiàn)了更多的焦點，由圖中可見僅在數(shù)量為1～3個或16～18個的范圍內(nèi)的細(xì)胞略少，其它各處均高于另外兩點，特別是表達(dá)7～15個和19～21個焦點數(shù)的細(xì)胞明顯較多。8 h與0.5 h相比，出現(xiàn)γ?H2AX焦點的細(xì)胞有所增多，且γ?H2AX數(shù)量為7～21個的細(xì)胞顯著多于0.5 h。與γ射線相比，7Li離子輻照后，各時間點未出現(xiàn)γ?H2AX焦點的細(xì)胞明顯減少，這是因為7Li離子是具有高LET的射線，相比低LET的γ射線而言，它的徑跡結(jié)構(gòu)復(fù)雜，局部劑量大，通過自由基攻擊和細(xì)胞間信號傳遞能誘發(fā)更多的細(xì)胞DNA發(fā)生雙鏈斷裂。

3.2重離子與γ射線誘發(fā)γH2AX焦點尺寸大小的變化規(guī)律

DNA依賴蛋白激酶（DNA?PK）是DNA損傷應(yīng)答和雙鏈斷裂修復(fù)中的一個關(guān)鍵分子，有研究報道，在缺乏DNA?PK激酶活性的細(xì)胞中觀察到高LET輻射誘發(fā)大尺寸的γH2AX焦點的存在，但其詳細(xì)的產(chǎn)生和變化規(guī)律及生物意義尚不清楚［7］。圖4（a）為2 Gy γ射線輻照后0.5 h、2 h和8 h時，細(xì)胞中不同大小尺寸γH2AX焦點的分布規(guī)律。可見，在這三個時間點，70%的焦點分布在0.8 μm2以下，并以0.2～0.4 μm2的較小焦點為最多，約達(dá)到了總焦點數(shù)的一半或一半以上。尺寸在1.0～1.8 μm2的中等大小和大于2 μm2的較大焦點也有出現(xiàn)，所占比例依時間不同而有所差別，2 h時刻最多，其次是 8 h和 0.5 h。0.5 h、2 h和8 h三個不同時間點的γH2AX焦點尺寸大小的平均值沒有差別（圖4（b））。

2 Gy12C離子輻照后細(xì)胞中γH2AX焦點大小的分布如圖4（c）所示。與γ射線相比，大于1 μm2以上的焦點有所增多，特別是在2 h時間點出現(xiàn)了較多的大于2 μm2的焦點。圖4（d）為12C離子誘發(fā)γH2AX焦點的平均尺寸的測量結(jié)果，表明形成焦點的平均最大尺寸約為γ射線的1.5倍。γH2AX焦點尺寸大小的差異，很可能與重離子誘發(fā)的DNA雙鏈斷裂為復(fù)雜的集簇性損傷有關(guān)。γH2AX焦點尺寸大小可成為表征細(xì)胞修復(fù)和輻射敏感性的一個生物學(xué)參數(shù)。

圖4 （e）和（f）給出了7Li離子輻照后0.5 h、2 h和8 h細(xì)胞中γH2AX焦點大小的分布情況。同樣，與γ射線的結(jié)果相比，在相同時間點，7Li離子輻照后的焦點大小的分布譜明顯向較大尺寸方向移動，而且分布譜的范圍變寬，在大于2 μm2的范圍出現(xiàn)了峰值，以2 h點最多，達(dá)到了約25%，其次是0.5 h和8 h，相同時間點在比例上較γ射線增加了2倍多，在具體尺寸上也顯著增大。這些大尺寸焦點是7Li離子徑跡直接誘發(fā)產(chǎn)生的，每一個焦點代表了一個集簇性基因組DNA損傷。而那些小尺寸的焦點，則可能是由δ射線、次級粒子或旁效應(yīng)誘發(fā)而成。另外，結(jié)果還顯示，對于7Li離子來說，8 h時焦點尺寸有向較小尺寸變化的趨勢，提示細(xì)胞進(jìn)入了損傷修復(fù)階段。細(xì)胞中焦點的平均尺寸的結(jié)果如圖4（f）所示，可見，焦點大小呈現(xiàn)為明顯地先增后減的趨勢，從0.5 h的1.1 μm2增加到2 h的2.0 μm2，至8 h點降為1.2 μm2，表明了雙鏈斷裂損傷開始產(chǎn)生、加重到緩慢修復(fù)的反應(yīng)過程。與γ射線相比，相同時間處7Li離子誘發(fā)形成的焦點的平均尺寸要大，尤其是在2 h點，約為γ射線的2.2倍。與12C離子相比，在分析的這三個時間點，誘發(fā)的效應(yīng)整體較大，大尺寸焦點的形成率也明顯多。此外，與低LET的γ射線不同，7Li離子輻照后形成的焦點在數(shù)量和大小上均具有時間響應(yīng)，12C離子輻照也產(chǎn)生類型的效應(yīng)現(xiàn)象，表明了高LET輻射與細(xì)胞中DNA相互作用的不同機制。

4 結(jié)論

本研究通過免疫熒光染色和激光共聚焦顯微鏡掃描技術(shù)，觀測了不同LET值的7Li（70.2 keV／μm）、12C（12.6 keV／μm）和γ射線（0.2 keV／μm）輻照MEF細(xì)胞誘發(fā)γH2AX聚焦點及DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)的效應(yīng)規(guī)律。與低LET的γ射線相比，具有較高LET的12C離子和高LET的7Li離子誘發(fā)的DNA雙鏈斷裂的損傷更嚴(yán)重。本研究從γH2AX焦點大小變化，描述了不同類型輻射誘發(fā)DNA雙鏈斷裂損傷點即電離輻射誘發(fā)焦點（IRIF）的尺寸效應(yīng)。2 Gy不同品質(zhì)射線（包括7Li、12C和γ射線）輻照MEF細(xì)胞后，誘發(fā)形成的平均每個細(xì)胞的γH2AX焦點數(shù)具有時間響應(yīng)性，最大值均出現(xiàn)在照后2 h，效應(yīng)的強弱依次為7Li離子＞12C離子＞γ射線。不同射線誘發(fā)的γH2AX焦點高表達(dá)持續(xù)時間不同，γH2AX焦點大小與LET值相關(guān)，LET越高誘發(fā)的焦點平均尺寸越大，焦點尺寸的變化有可能作為表征不同類型輻射作用、輻照集簇DNA斷裂損傷及細(xì)胞修復(fù)過程的參數(shù)。

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（責(zé)任編輯：龐迎春）

Response of γH2AX Foci in Repair of DNA Double Strand Breaks Induced by Heavy Ions

SUI Li1，2，WANG Yu1，GUAN Hua1，KONG Fuquan2，ZHOU Pingkun1

（1.Beijing Institute of Radiation Medicine，Beijing 100850，China；2.China Institute of Atomic Energy，Beijing 102413，China）

DNA double?strand break（DSB）is a major and severe damage of genomic DNA induced by ionizing radiation.In case of the occurrence of DSB，the histone protein H2AX is phosphorylated and recruited at DSB site to form phosphorylated H2AX（γH2AX）foci as a DSB biomarker.The yield，size and dynamics of γH2AX foci in mouse MEF cells induced by different linear energy transfer（LET）radiation including heavy ions7Li，12C and60Co γ?ray were investigated.The results indicated that the average number of γH2AX foci per cell was changed as a function of time post?ir?radiation for all the radiations，and the peak of γH2AX foci formation appeared at 2h after irradia?tion.The persistence of increased number of foci was depended on the radiation type.The frequency of γH2AX foci production was associated with the LET value，the higher the LET，the greater the production frequency.The average size of γ?H2AX foci induced by γ?rays was not changed with the post?irradiation times.An increase in the size of γH2AX foci induced by high LET ion beams was found，as compared with γ?rays irradiation.Moreover，the foci size increased with elevated LET.

genomic stability；DNA double?strand break；DNA repair；γH2AX foci（phosphoryla?ted H2AX foci）；heavy ion；γ?ray

Q691.5；Q789

：A

：1674?5825（2017）02?0245?07

2016?05?19；

2017?02?28

載人航天預(yù)先研究項目（040101）

隋麗，女，博士，研究員，研究方向為重離子輻射生物學(xué)與防護(hù)。Email：lisui＠ciae.ac.cn