王楠楠, 韓冬雪, 孫 雪, 國 微, 馬宏宇, 馮富娟,*

1 東北林業(yè)大學, 哈爾濱 150040 2 長白山科學研究院, 安圖 133613

降水變化對紅松闊葉林土壤微生物功能多樣性的影響

王楠楠1, 韓冬雪1, 孫 雪1, 國 微2, 馬宏宇2, 馮富娟1,*

1 東北林業(yè)大學, 哈爾濱 150040 2 長白山科學研究院, 安圖 133613

紅松闊葉林生態(tài)系統(tǒng)是中國東北地帶性頂級植被,具有重要的生態(tài)學意義；長白山是研究溫帶森林對大氣降水變化正負反饋的理想地帶。以長白山紅松闊葉林0—5cm、5—10cm表層土和紅松根際土為研究對象,基于Biolog生態(tài)平板法,分析了不同降水量條件下土壤微生物功能多樣性的變化規(guī)律及機制。結果表明,平均顏色變化率(Average well color development,AWCD)隨培養(yǎng)時間的延長而增加,在培養(yǎng)初期的表現(xiàn)為降水減少30%樣地>降水增加30%>對照樣地,培養(yǎng)的末期,AWCD值的變化沒有表現(xiàn)出明顯的規(guī)律性。各降水量條件下根際土土壤微生物的AWCD值均高于表層土。Shannon多樣性指數(shù)、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)和McIntosh均勻度指數(shù)在不同降水量樣地間均未表現(xiàn)出顯著的差異,即降水量增減30%的情況下,未對紅松林表層土和紅松根際土的微生物功能多樣性產生顯著影響。土壤微生物利用率最高的碳源是氨基類,其次是碳水類和多聚類,其中氨基類和碳水類也是不同降水條件下微生物功能多樣性表現(xiàn)出異質性的主要碳源。

碳源利用；Biolog；土壤微生物；功能多樣性；土壤水分

在全球氣候變化背景下,全球或局部地區(qū)的降水格局(包括降水量,降水強度及降水的季節(jié)分配)發(fā)生了改變。近50年來,東北地區(qū)降水量呈現(xiàn)減少的趨勢,降水事件具有向極端化發(fā)展的傾向,降水分布更不均勻[1-2]。降雨的變化,特別是極端降雨會對森林生態(tài)系統(tǒng)的結構和功能產生重大影響[3]。土壤微生物作為森林生態(tài)系統(tǒng)中極為重要的組成部分,對植物的生長、生態(tài)系統(tǒng)中能量流動和物質循環(huán)等均起著重要作用,對保持森林土壤質量和生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性等意義重大[4-5]。因此,土壤微生物群落特征對氣候變化(如溫度升高、降水格局變化等) 和各種擾動的響應和適應的探討將是今后全球變化生態(tài)學研究的核心問題[6]。

土壤微生物多樣性是評價微生物群落特征的重要內容,其中土壤微生物群落功能多樣性是表達土壤微生物群落與生態(tài)功能的重要指標之一,可以評價土壤中微生物的生態(tài)特征和土壤的肥力特征,微生物功能多樣性信息對于明確不同環(huán)境中微生物群落的作用具有重要意義[7]。土壤微生物多樣性的研究手段眾多,如聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)、基因克隆文庫分析法(gene cloning library,GCL) 、熒光原位雜交法(fluorescence in situ hybridization,FISH)、限制性酶切片段長度多態(tài)性分析法(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、變性梯度凝膠電泳法(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE) 和溫度梯度凝膠電泳法(thermal gradient gel electrophoresis, TGGE)等[8- 11],其中Biolog微平板技術,可以直接獲得微生物功能多樣性的信息,最大限度的保存了土壤微生物的代謝特點,目前廣泛應用于估價土壤微生物群落代謝多樣性和功能多樣性的研究[12-13]。

以紅松(Pinuskoraiensis)為建群種的紅松闊葉林是我國東北地區(qū)最有代表性的地帶性頂極植被,是我國溫帶針闊混交林帶內最典型、最多樣、最重要的森林生態(tài)系統(tǒng),也是全球北方森林的組成部分。該區(qū)域氣候寒冷、土壤潮濕、有島狀永久性凍土存在,屬于全球氣候變化敏感區(qū)域。長白山是研究溫帶森林對全球氣候變化正負反饋的理想地帶,具有顯著的區(qū)域特性。本研究利用Biolog微平板技術,以長白山原始紅松闊葉林表層土及紅松根際土的土壤微生物為研究對象,比較了人工控制降水條件下土壤微生物的代謝特征的變化,旨在探討降水變化對土壤微生物功能多樣性的影響規(guī)律和機制,為進一步研究紅松闊葉林生態(tài)系統(tǒng)中土壤微生物群落對全球氣候變化大背景下降雨格局改變的響應規(guī)律提供理論依據(jù)和科學參考。

1 材料方法

1.1 研究區(qū)概況及樣地設置

試驗在中國科學院沈陽應用生態(tài)研究所長白山森林生態(tài)系統(tǒng)定位研究站內依托“國家重點基礎研究發(fā)展計劃”(973)項目建立的“原始闊葉紅松林降水格局控制試驗研究樣地”內進行。樣地坐標40°24′ N,128°28′ E,海拔736m,該區(qū)域為典型的溫帶大陸性山地氣候。林地內優(yōu)勢種為紅松,多種闊葉樹與其混交,常見的為紫椴 (Tiliaamurensis)、水曲柳 (Fraxinusmandshurica)、楓樺(Betulacostata)等,此外混有少量的色木槭(Acermono)、蒙古櫟(QuercusMongolica)、春榆(Ulmusdavidianavar.japonica)及白樺(Betulaplatyphylla)。紅松平均株高16.70m,胸徑23.45cm,林內郁閉度0.75。

該樣地內設置9塊50m×50m的樣方,樣方內通過截水板來控制降水量,共有3種控水模式,分別為截水板下降水增加30%、截水板下降水減少30%和無截水板對照,每個模式3個重復。降水量的控制,按照林面積的30%計算,即截水板攔截穿透雨的30%,樹干徑流量(小于18%)的影響被忽略。整個降水控制系統(tǒng)采用計算機控制,于2009年啟動運行至今,樣地概況見圖1。該樣地9月土壤主要理化性質見表1。

圖1 樣地內截水板設置 Fig.1 The rainout shelters in sample site

樣品Samples含水量Watercontent/%pH有效磷AvailableP/(mg/kg)有機碳OrganicC/(g/kg)總氮TotalN/(g/kg)C/NLT50．0±0．5Ac5．14Aa23．1132±0．41Ac26．126±1．75Ab13．180±0．6aAb11．5253CKT53．1±0．1Ab5．25Aa25．9434±0．38Ab28．266±0．70Aab13．895±1．0Aab11．8547MT63．9±0．2Aa5．38Aa27．8302±0．47Aa30．321±0．62Aa15．565±1．0Aa11．3293LD38．0±0．4Bc4．51Bb8．0189±0．68Bc8．421±0．71Bb0．512±0．02Bb9．5775CKD45．4±0．2Bb4．70Bab10．849±0．44Bb9．237±0．41Bb0．5177±0．08Bb10．5099MD48．7±0．3Ba4．79Ba22．6415±0．42Ba17．83±1．03Ba1．048±0．11Ba9．9974

LT: 降水減少30% 0—5cm土層,Precipitation 30% decrease and 0—5cm layer；CKT: 對照樣地的0—5cm土層,0—5 cm layer in control site；MT: 降水增加30% 0—5cm土層,Precipitation 30% increase and 0—5cm layer； LD: 降水減少30% 5—10 cm土層,Precipitation 30% decrease and 5—10 cm layer； CKD：對照樣地的5—10 cm土層,5—10 cm layer in control site； MD：降水增加30% 5—10 cm土層,Precipitation 30% increase and 5—10 cm layer. 同列不同大寫字母表示不同土層間差異顯著(P<0. 05),不同小寫字母表示不同降水量間差異顯著(P<0. 05)

1.2 樣品采集

取樣工作于2014年9月進行,在每一樣方內按S型布點作10個1m×1m的小樣方,每個小樣方內按自然土壤剖面取樣法采集0—5cm和5—10cm表層土樣,紅松根際土樣品采集時采用手工抖落法[14],采集后分別裝于采集袋中,帶回實驗室。去除凋落物及土壤動物等雜質,過2mm篩后,將每個樣方內的10個點充分混合組成1個混合樣,立即進行biolog實驗。

1.3 實驗方法

Eco板接種液的制備采用Classen等的方法[15]。首先土壤樣品在25℃的條件下活化24 h。取3 g新鮮土樣放入盛有27 mL的0.85% NaCl溶液的三角瓶中,渦旋振蕩1 min后,置于冰水浴中1 min,重復此操作3次。轉入超凈工作臺中靜置5min,吸取3 mL上清,加入27 mL NaCl溶液,混勻后再吸取3 mL上清,加入27 mL NaCl溶液。最終的稀釋比例為1∶1 000。向Eco板的各孔中加入150mL的稀釋液,將接種好的微孔板放入25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用酶標儀(Sunrise Re-mote, TECAN)測定590、750nm下biolog微孔板的吸光度值,分別記錄培養(yǎng)24、48、72、96、120、144、168、192 h和216 h的數(shù)值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

微生物代謝活性用590 nm 下的值減去750 nm下的值表示, 孔的平均顏色變化率(AWCD) 計算方法如下[16]:

AWCD=∑(Ci-R)/n

式中,Ci為各反應孔在590nm與750nm吸光度值之差；R為Eco板對照孔的光密度值；n為Biolog生態(tài)板的碳源數(shù)目,該實驗中值為31。Ci-R小于零的孔,計算中記為零。

通過Shannon多樣性指數(shù)、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)和McIntosh均勻度指數(shù)來表示表層土和根際土壤微生物群落代謝功能的多樣性。計算公式如下：

Shannon多樣性指數(shù)

H=-∑(Pi×lnPi)

Simpson優(yōu)勢度指數(shù)

D=1-∑(Pi)2

McIntosh均勻度指數(shù)

U=∑(Ci-R)2

式中,Pi=Ci-R/∑(Ci-R)。

數(shù)據(jù)處理分析應用Excel2013、SPSS(Version14.0forWindows)軟件進行, 繪圖應用Sigma-plot10.0 軟件。

2 結果與分析

2.1 不同降水量條件下土壤微生物利用全部碳源的動力學特征

平均顏色變化率(AWCD) 是反映土壤微生物活性,即利用單一碳源能力的一個重要 指標[17-18]。計算9個樣品利用31種碳源的AWCD值可知,隨著培養(yǎng)時間的延長,微生物利用碳源的量呈逐漸增加趨勢,且24h至96h增長快速,144h后這種增加逐漸緩慢(圖1)。說明培養(yǎng)初期,土壤微生物經(jīng)過短暫的環(huán)境適應后,利用碳源的能力逐漸提升,首先進入快速增長期,微生物代謝強度達到頂峰,隨后逐漸達到穩(wěn)定期。培養(yǎng)初期(48h),3種降水條件下AWCD值對空間位置的響應規(guī)律一致,均表現(xiàn)為根際土>0—5cm表層土>5—10cm表層土；同樣,AWCD值對降水的響應規(guī)律也基本一致,即降水減少30%>降水增加30%>對照,但0—5cm表層土除外,表現(xiàn)為降水增加30%最高,降水減少30%最低。培養(yǎng)末期(168h),AWCD值在對照樣地表現(xiàn)為0—5cm表層土>根際土>5—10cm表層土,其他兩個樣地均表現(xiàn)為根際土>0—5cm表層土>5—10cm表層土；不同空間位置的AWCD值對降水變化的響應規(guī)律差異較大,根際土表現(xiàn)為降水減少30%>降水增加30%>對照,0—5cm表層土表現(xiàn)為對照>降水增加30%>降水減少30%,5—10cm表層土表現(xiàn)為降水增加30%>對照>降水減少30%。整體來看,培養(yǎng)末期根際土土壤微生物的碳源利用能力高于表層土。

圖2 不同降水量條件下9種土壤微生物的平均顏色變化率 Fig.2 The average well color devolopment of 9 kinds of soil microorganisms under different amount of precipitationLT: 降水減少30% 0—5cm土層,Precipitation 30% decrease and 0—5cm layer；CKT: 對照樣地的0—5cm土層,0—5 cm layer in control site；MT: 降水增加30% 0—5cm土層,Precipitation 30% increase and 0—5cm layer； LD: 降水減少30% 5—10 cm土層 Precipitation 30% decrease and 5—10 cm layer； CKD：對照樣地的5—10 cm 土層,5—10 cm layer in control site；MD：降水增加30% 5—10 cm土層,Precipitation 30% increase and 5—10 cm layer；LR：降水減少30% 紅松根際土,Precipitation 30% decrease and Rhizosphere soil of Korean pine；CKR：對照樣地的紅松根際土,Rhizosphere soil of Korean pine in control site；MR：降水增加30%根際土,Precipitation 30% increase and Rhizosphere soil of Korean pine

2.2 不同降水量條件下土壤微生物多樣性指數(shù)

Shannon指數(shù)可以表征土壤中微生物群落豐富度,Simpson指數(shù)常用來評估土壤中微生物群落優(yōu)勢度,McIntosh指數(shù)反映土壤中微生物群落均勻度[19]。土壤微生物經(jīng)過168h培養(yǎng)后,分析其Shannon指數(shù)、McIntosh均勻度指數(shù)和Simpson優(yōu)勢度指數(shù)。結果表明,在降水增減30%條件下,Shannon指數(shù)和均勻度指數(shù)表現(xiàn)為根際土>0—5cm表層土>5—10cm表層土,在對照樣地則表現(xiàn)為0—5cm表層土>根際土>5—10cm表層土；且在3塊樣地中,5—10cm土層與0—5cm土層、根際土的Shonnon指數(shù)差異均極顯著(P<0.001),其他兩個指數(shù)在不同空間位置上未達到顯著水平。3個指數(shù)在不同降水條件差異均不顯著。

2.3 不同降水量條件下土壤微生物對6大類碳源的利用強度

Biolog微孔板中的31種碳源可以根據(jù)官能團的不同分為6大類,分別為胺類、 氨基酸類、碳水類、羧酸類、酚酸類和多聚物。本研究中,土壤微生物對這6類碳源的利用率大小為氨基類>多聚類>碳水類>胺類>羧酸類>酚酸類(圖2)。表明長白山紅松闊葉林土壤微生物偏好的碳源類型是氨基類、碳水類和多聚類。

不同降水量條件下,6類碳源利用率存在差異：在降水減少30%樣地,除胺類表現(xiàn)為0—5cm表層土>根際土>5—10cm表層土外,其余碳源的利用率均表現(xiàn)為根際土>0—5cm表層土>5—10cm表層土；對照樣地中,除羧酸類表現(xiàn)為0—5cm表層土>5—10cm表層土>根際土,其余則表現(xiàn)為0—5cm表層土>根際土>5—10cm表層土；降水增加30%樣地中,不同空間位置土壤微生物對六大類碳源的利用并沒有表現(xiàn)出一致的規(guī)律。除羧酸類和胺類碳源外,其余4類碳源對降水變化的響應均達到顯著水平。

表2 不同降水量條件下的土壤微生物多樣性指數(shù)(培養(yǎng)168h)

LR：降水減少30% 紅松根際土,Precipitation 30% decrease and Rhizosphere soil of Korean pine；CKR：對照樣地的紅松根際土,Rhizosphere soil of Korean pine in control site；MR：降水增加30%根際土,Precipitation 30% increase and Rhizosphere soil of Korean pine;同列小寫字母不同代表不同土壤樣品間差異極顯著(P<0.001)

不同空間位置上,這6類碳源對降水變化的響應規(guī)律也不一致。對根際土而言,降水的增加和減少均提高了6大類碳源的利用率,降水增加明顯提高了氨基酸類和羧酸類碳源的利用,降水減少則明顯提高了其他4種碳源的利用率；0—5cm表層土中,除胺類外,對其余5類碳源的利用率在對照樣地最高；5—10cm表層土中,微生物對6大類碳源的利用沒有表現(xiàn)出對降水響應的一致的規(guī)律。6類碳源中,只有酚酸類碳源的利用率對空間位置變化的響應達到顯著水平。

2.4 不同降水量條件下土壤微生物的主成分分析

對各樣品培養(yǎng)168h后的平均顏色變化率做主成分分析,以探究不同降水量條件下土壤微生物碳源利用的差異(圖4)。第1主成分和第2主成分的貢獻率分別為54.165%和45.835%。其中降水減少30%樣地兩個層次表層土均有較低的第1主成分和較高的第2主成分,與其他樣品區(qū)分開來,說明降水減少30%確實引起了表層土壤微生物對碳源利用的明顯變化。降水增加30%樣地中,0—5cm表層土與根際土均有較高的第1主成分,對照樣地中0—5cm表層土與根際土均有較高的第1主成分和較低的第2主成分,說明降水增加30%和對照樣地中,0—5cm表層土與根際土對碳源的利用情況都是相近的。

圖3 不同降水條件下土壤微生物對6大類碳源的利用強度 Fig.3 Carbon source utilization of soil microorganisms under different precipitation

圖4 不同降水條件下土壤微生物的主成分分析 Fig.4 Principle component analysis of soil microbial community microorganism under different precipitation

對31種碳源主成分分析中的因子載荷可反映碳源利用的差異,絕對值越大,表明該基質的影響越大,在眾多碳源中起主要分異作用[20]。本研究中PC1載荷值絕對值>0.5的有21種,0.8以上的有7種,其中氨基酸類4種,多聚類、羧酸類和碳水類各1種(表3)。PC2的載荷在0.5以上的碳源有7種,其中碳水類4種,羧酸類1種,胺類2種。綜合分析,碳水類和氨基酸類碳源為不同降水條件下微生物功能多樣性表現(xiàn)出空間異質性的敏感碳源。此外,碳水類中的N-乙酰-D-葡萄糖胺、D-纖維二糖、α-D-乳糖,在PC1和PC2載荷均達到0.5以上,三者為碳水類碳源中的最敏感類型。

表3 31種碳源的因子載荷值

3 結論與討論

3.1 不同降水量條件下AWCD值和微生物多樣性

AWCD值能反應出土壤微生物活性及微生物利用單一碳源的反應速率[21]。研究中發(fā)現(xiàn),AWCD值在培養(yǎng)初期和培養(yǎng)末期對降水量變化的響應不一致,培養(yǎng)初期,降水量增、減樣地的AWCD值高于對照,即降水量的變化對微生物的代謝活性產生了一定的促進作用；在培養(yǎng)末期,AWCD值趨于穩(wěn)定后,這種促進作用消失,導致AWCD值產生明顯差異的因素主要是土樣的空間位置(圖2)。在整個培養(yǎng)過程中,降水量增減30%的控制幅度對微生物代謝活性的影響并不大。但是,我們前期的研究結果已經(jīng)證實,降水變化能夠明顯驅動土壤微生物群落的組成結構發(fā)生較大變化,如不同降水條件下,真菌群落中的優(yōu)勢種群具有較大差異[22],同時降水變化也顯著影響了細菌群落中優(yōu)勢種群的豐度[23]?？梢?在相同控制降水條件下,微生物群落的結構和功能所表現(xiàn)出的響應程度并不一致。其原因可用“功能冗余”來解釋,即同一群落中的某些物種在生態(tài)功能上有一定程度的重疊[24]。降水變化雖然導致土壤微生物群落中優(yōu)勢種群的變化,但由于功能的冗余性,其變化程度反應到功能上就會被稀釋。因而,微生物群落的結構對外界條件變化的反應比功能更為敏感,這一結論也與Berga等的研究相一致[25]。

整個培養(yǎng)過程中,各降水條件下根際土土壤微生物的AWCD值均高于表層土,與國內外眾多的研究結果一致,普遍認為根際分泌物對其周圍微生物群落生長和代謝的促進作用是導致這一結果的主要原因[26-29]。不同降水量條件下,Shannon指數(shù)Simpson指數(shù)和McIntosh 指數(shù)均差異不顯著,和上述AWCD的值一樣,說明降水增減30%的變化幅度并沒有對微生物多樣性產生顯著影響。3個指數(shù)在根際土、0—5cm和5—10cm表層土間沒有表現(xiàn)出一致的顯著差異,這與AWCD值在土壤空間位置上表現(xiàn)出了明顯的異質性(根際土高于表層土)不同,說明根際對周圍微生物的影響主要體現(xiàn)在代謝活性上,并沒有影響微生物的均勻度和優(yōu)勢度。

3.2 不同降水量條件下微生物對碳源利用的差異

綜上所述,降水量增減30%的情況下,未對原始紅松闊葉林表征土和紅松根際土的微生物功能多樣性產生顯著影響,但3種降水條件下,土壤微生物功能多樣性在土層之間及表征土與根際土之間差異較為明顯。

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Effects of precipitation change on soil microbial functional diversity in the primitive Korean pine and broadleaved forests

WANG Nannan1, HAN Dongxue1, SUN Xue1, GUO Wei2, MA Hongyu2, FENG Fujuan1,*

1NortheastForestryUniversity,Harbin150040,China2ChangbaimountainAcademyofScience,Antu133613,China

Global climate change and sustainable development are the two most important challenges worldwide. Patterns of precipitation, includes quantity, intensity and distribution, are expected to change. Subsequently, soil moisture content is expected to followed the precipitation pattern changes, which would affect the aboveground biomass and soil microorganisms activity. The latter would consequently affect the structure and functioning of terrestrial ecosystem. Therefore, it is critical to understand how ecosystem structure and function will respond to the expected changes of precipitation pattern. Many large controlled field experiments modify the precipitation pattern change. Most of those studies have been focusing on species composition, productivity and soil respiration. Soil microorganisms are sensitive to micro-environmental changes, which drive the soil nutrient cycling, as well as ecosystem processes such as soil material conversion and energy flow. Therefore, they have been recognized as sensitive indicator of soil ecosystem. As a consequence, soil microorganisms have been a popular research topic in pedology, and have become an extremely important and relatively quick growing research field. Forest ecosystem can contribute greatly to adjust of global climate change. Broad-leavedKoreanpine mixed forest is zonal climax vegetation in northeastern China, and it plays a significant ecological role in this region. We selected Changbai Mountain to study the microbial feedbacks to the precipitation changes. Soil microbial functional diversity and its changes driven by precipitation change (30% increase and decrease) were measured in different layer soil (0—5cm, 5—10cm andKoreanpine rhizosphere soil), using the Biolog microplate. Our results showed that the average well color development (AWCD) value were highest in the increased precipitation plots, and lowest in the control plot at the beginning of the cultivation. however, it did not have an obvious pattern with precipitation regime at the end of cultivation. Throughout the whole incubation periods, the AWCD value in rhizosphere soil was higher than in surface soil. Shannon-Wiener, Simpson, and McIntosh diversity indices showed no significant difference between different layers and precipitation patterns. This suggest that precipitation increasing or decreasing with 30% had no significant effect on functional diversity of different layers or the rhizosphere soil in broad-leavedKoreanpine mixed forest. However, the utilization intensity of six categories carbon sources types were specified. Amino acids, carbohydrate and polymers were the main carbon sources with a high utilization rate, especially the amino acids. The microbial functional diversity under different precipitation conditions showed that the spatial heterogeneity was reflected the use of amino acids and carbohydrate by microrganisms. N-Acetyl-D-Glucosamine, D-cellobiose, and α-D-Lactose was the most specified carbon sources to microbes. This evaluation of microbial functional diversity in bulk soil and rhizosphere soil under different precipitation patterns can help other researchers to summarize the patterns and mechanism of microorganism responses to precipitation change. It is also provide a scientific reference for further study on climate change.

Carbon use; Biolog; soil microbiology; functional diversity; soil moisture

國家自然科學基金項目(41105104)；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項(2572015EA02)；長白山科學研究院開放基金項目(201506)

2015- 09- 10;

日期:2016- 06- 13

10.5846/stxb201509101873

*通訊作者Corresponding author.E-mail: ffj9018@sina.com

王楠楠, 韓冬雪, 孫雪, 國微, 馬宏宇, 馮富娟.降水變化對紅松闊葉林土壤微生物功能多樣性的影響.生態(tài)學報,2017,37(3):868- 876.

Wang N N, Han D X, Sun X, Guo W, Ma H Y, Feng F J.Effects of precipitation change on soil microbial functional diversity in the primitive Korean pine and broadleaved forests.Acta Ecologica Sinica,2017,37(3):868- 876.