高 遠(yuǎn),李隔萍,施 宏,劉 慧,任安芝,高玉葆

南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 天津 300071

感染內(nèi)生真菌的羽茅對大針茅的化感作用

高 遠(yuǎn),李隔萍,施 宏,劉 慧,任安芝*,高玉葆

南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 天津 300071

以羽茅(Achnatherumsibiricum)為材料,采用室內(nèi)生物測定法研究感染不同內(nèi)生真菌的羽茅浸提液對大針茅(Stipagrandis)種子萌發(fā)和幼苗生長的化感作用,并采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術(shù)對羽茅浸提液中的化學(xué)成分進(jìn)行分析。結(jié)果表明：(1)內(nèi)生真菌感染可緩解宿主羽茅對群落優(yōu)勢種大針茅的化感作用;(2)內(nèi)生真菌感染對宿主羽茅化感作用的影響與內(nèi)生真菌種類有關(guān),具體表現(xiàn)為相比于未染菌羽茅,感染Epichlo?gansuensis可顯著緩解宿主羽茅對大針茅的抑制作用,而感染Neotyphodiumsibiricum、Neotyphodiumgansuensis有緩解羽茅對大針茅化感作用的趨勢,但未達(dá)到顯著影響;(3)羽茅浸提液中含有2,4-二叔丁基苯酚、鄰苯二甲酸、鄰苯二甲酸二丁酯和硬脂酸甲酯等潛在化感物質(zhì),這4種物質(zhì)相對含量的差異可能是不同內(nèi)生真菌感染狀態(tài)的羽茅產(chǎn)生不同化感效應(yīng)的主要原因;(4)對羽茅浸提液中4種潛在化感物質(zhì)的化感作用進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,2,4-二叔丁基苯酚對大針茅的化感作用基本表現(xiàn)為低濃度無影響,高濃度抑制,鄰苯二甲酸二丁酯的化感作用表現(xiàn)為“低促高抑”的效應(yīng)趨勢,而鄰苯二甲酸和硬脂酸甲酯對大針茅均表現(xiàn)出“劑量效應(yīng)”的化感作用趨勢,即4種潛在化感物質(zhì)在高濃度時(shí)均可顯著抑制大針茅的種子萌發(fā)和幼苗生長。

內(nèi)生真菌;羽茅;大針茅;化感作用

植物化感作用(allelopathy)是指活體植物通過雨霧淋溶、莖葉揮發(fā)、根系分泌以及植物殘?bào)w的腐解等途徑向環(huán)境中釋放化感物質(zhì)而影響其他有機(jī)體生長和發(fā)育的化學(xué)生態(tài)學(xué)現(xiàn)象[1]。化感作用廣泛存在于草地生態(tài)系統(tǒng)中,并已成為當(dāng)前生態(tài)學(xué)研究的熱點(diǎn)[2]。化感物質(zhì)(allelochemical)主要來源于植物的次生代謝產(chǎn)物[3],其可對鄰近植物的生長發(fā)育(如種子萌發(fā)、幼苗生長)過程產(chǎn)生有利或有害的影響。在自然界中,水溶性的化感物質(zhì)主要通過雨霧淋溶的方式進(jìn)入土壤發(fā)生化感作用,因此,研究植物浸提液中的化感物質(zhì)產(chǎn)生的化感作用對草地植物種子萌發(fā)及幼苗生長的影響可為探究退化草地的恢復(fù)重建、植物的入侵機(jī)制提供理論依據(jù),并在闡明植物個(gè)體及種間的相互作用機(jī)制和構(gòu)建植物群落中起重要作用[4- 6]。

禾草內(nèi)生真菌(fungal endophyte)是指能夠在禾草中度過大部分或全部的生命周期,但不使宿主植物表現(xiàn)明顯病害癥狀的一大類真菌[7],其中研究最多的是香柱菌屬(Epichloё),其無性型被命名為Neotyphodium屬[8]。大量研究表明,感染內(nèi)生真菌可使宿主禾草的競爭能力顯著增強(qiáng)[9- 16]。Vázquez-de-Aldana等[14]提出內(nèi)生真菌對宿主植物競爭能力的影響可能體現(xiàn)在3個(gè)方面：(1) 內(nèi)生真菌能夠促進(jìn)宿主禾草的生長發(fā)育,進(jìn)而提高宿主的競爭優(yōu)勢,如Vila-Aiub等[17]發(fā)現(xiàn),與未感染內(nèi)生真菌植株相比,感染內(nèi)生真菌顯著提高了宿主黑麥草(Loliumperenne)的種子萌發(fā)、分蘗生長和生物量的積累;Malinowski和Belesky等[18]研究表明,內(nèi)生真菌的存在可以促進(jìn)宿主植物的根系發(fā)育和葉片生長。(2) 內(nèi)生真菌能增強(qiáng)宿主植物對昆蟲[19]和食草動(dòng)物[20]的取食、病原菌[21-22]的侵染等生物干擾,以及干旱[23]、低養(yǎng)分[24]和重金屬[25]等非生物脅迫的抵抗能力,使宿主植物的競爭能力顯著增加。(3) 內(nèi)生真菌可引起宿主體內(nèi)化學(xué)物質(zhì)的變化進(jìn)而改變植物的化感潛力,但這一推測目前還缺乏足夠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

目前,對于禾草-內(nèi)生真菌共生關(guān)系的研究多集中于高羊茅(Festucaarundinacea)和黑麥草等栽培禾草,而對天然禾草-內(nèi)生真菌相互作用的研究較少。由于長期的定向選育,高羊茅和黑麥草等栽培禾草通常只感染1種內(nèi)生真菌,而天然禾草可感染多種內(nèi)生真菌[26]。Sullivan和Faeth[27]發(fā)現(xiàn)亞利桑那羊茅(Festucaarizonica)自然種群感染有2種內(nèi)生真菌N.tembladerae和N.huerfanum;Iannone等[28]發(fā)現(xiàn)不同地理種群的雀麥(Bromusauleticus)中也感染有2種內(nèi)生真菌N.pampeanum和N.tembladerae;Leuchtmann等[29]甚至在三柄麥(Hordelymuseuropaeus)中發(fā)現(xiàn)感染有6種不同內(nèi)生真菌。那么禾草的化感潛力是否因內(nèi)生真菌種類的不同而不同呢？目前尚未見報(bào)道。

內(nèi)蒙古草原是我國重要的畜牧業(yè)生產(chǎn)基地,也是我國北方重要的生態(tài)防線[30]。魏宇昆等[31]對內(nèi)蒙古草原天然禾草內(nèi)生真菌感染狀況調(diào)查發(fā)現(xiàn),所調(diào)查的21屬43種禾本科植物中,27種感染有內(nèi)生真菌。其中,羽茅(Achnatherumsibiricum)的內(nèi)生真菌感染率最高(86%—100%),分布范圍最為廣泛。羽茅為禾本科芨芨草屬的一種多年生草本植物,在我國東北、華北等多個(gè)地區(qū)均廣泛分布,多為伴生植物[32],而叢生禾草大針茅(Stipagrandis)是其所在群落的優(yōu)勢種。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn),同一地理種群的羽茅通常感染有2種Epichlo?屬內(nèi)生真菌：即Epichlo?sibiricum和Epichlo?gansuence[33],其中E.sibiricum只發(fā)現(xiàn)有無性型Neotyphodiumsibiricum(Ns),而E.gansuensis既有無性型N.gansuensis(Ng)也有有性型E.gansuence(Eg)[34],因此,羽茅是研究不同種類內(nèi)生真菌對宿主禾草影響的理想材料。本實(shí)驗(yàn)以羽茅為材料,探討感染不同內(nèi)生真菌的羽茅對其所在群落優(yōu)勢種大針茅的化感效應(yīng),并采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術(shù)對羽茅浸提液中的化學(xué)成分進(jìn)行了分析,為進(jìn)一步預(yù)測內(nèi)蒙古草原的植被群落動(dòng)態(tài)變化及草地生態(tài)系統(tǒng)的保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 種子的采集

羽茅種子于2012年采集自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院呼倫貝爾草原生態(tài)系統(tǒng)國家野外科學(xué)觀測研究站(119.67°E,49.100°N),海拔629m,年平均降雨量約為367mm,年均溫為-2℃,土壤為暗栗鈣土。對獲得的種子使用苯胺藍(lán)染色法進(jìn)行內(nèi)生真菌的檢測[35],結(jié)果表明采集地的羽茅種子中內(nèi)生真菌感染率為100%。對羽茅種子進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離純化[36],首先從采自同一穗的種子中選擇5粒飽滿的種子放入7mL離心管中,先在50%硫酸中浸泡20min,將硫酸倒出后用無菌蒸餾水沖洗3次,然后在3%次氯酸鈉中浸泡20min,將次氯酸鈉倒出并用無菌蒸餾水沖洗3次,最后將種子保存在無菌蒸餾水中。在無菌超凈工作臺內(nèi)將表面滅菌后的羽茅種子接種到PDA培養(yǎng)基(200g/L土豆,15g/L瓊脂,20g/L葡萄糖)上。之后使用封口膜將培養(yǎng)皿封好并將其置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。待白色菌絲從種子表面或邊緣長出時(shí),挑取菌絲進(jìn)行3次單胞純化以獲得單胞菌落。以每個(gè)菌株的tubB和tefA序列作為靶序列,用GenBank中的BLAST程序搜索同源序列一起進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,并結(jié)合形態(tài)學(xué)方法鑒定獲得如下內(nèi)生真菌：N.sibiricum、N.gansuensis和E.gansuensis。采自同一穗的種子通常感染同種內(nèi)生真菌,將感染不同內(nèi)生真菌羽茅的種子分為兩份,一份置于4℃冰箱保存,另一份在60℃下高溫處理30d,以獲得不染菌種子。這種高溫處理的方法能夠使羽茅種子所感染的內(nèi)生真菌失活,并且對種子發(fā)芽、幼苗及成株生長均無顯著不利影響[37]。

大針茅為多年生密叢型旱生草本植物,是亞洲中部草原亞區(qū)最具代表性的建群植物之一,也是劃分草原植被的指示植物[38]。實(shí)驗(yàn)所使用的大針茅種子于2012年采集,由內(nèi)蒙古大學(xué)梁存柱教授惠贈(zèng)。

1.2 不同內(nèi)生真菌感染狀況的羽茅種群構(gòu)建

選取不同內(nèi)生真菌感染狀況的羽茅種子浸泡過夜后播種到直徑20cm高20cm,裝滿蛭石的塑料花盆中,置于南開大學(xué)網(wǎng)室(允許透過80%以上的自然光,不透水)培養(yǎng),光照每天8h左右,溫度10—30℃。待植株生長一個(gè)月后,選取長勢一致且生長良好的幼苗,每盆定株到10株用于實(shí)驗(yàn)。每周澆灌1次Hoagland完全營養(yǎng)液,每次500mL/盆,從2015年4月5日至6月29日共持續(xù)85d。不同內(nèi)生真菌感染狀況的羽茅各種植5盆,收獲后將同種內(nèi)生真菌感染狀況的羽茅綠葉混合備用。

1.3 羽茅浸提液的制備

稱取不同內(nèi)生真菌感染狀況的羽茅綠葉各20g,將其剪成2cm長的小段,用200mL蒸餾水浸泡48h后,雙重過濾。第一重用定量濾紙過濾,第二重用0.45μm的濾膜過濾,制備得到不含微生物的濃度為0.1 g/mL的羽茅浸提液原液,將原液稀釋得到0.01、0.03 g/mL和0.05 g/mL的浸提液,置于4℃冰箱中冷藏備用。

1.4 化感活性生物測定

試驗(yàn)采用室內(nèi)生物測定法。取直徑9cm的培養(yǎng)皿洗凈、烘干后鋪入兩層滅菌濾紙,將消毒后的大針茅種子均勻放入培養(yǎng)皿中,每皿50粒,然后向培養(yǎng)皿中分別倒入6mL 3種不同濃度的羽茅浸提液。用蒸餾水處理作為對照(CK),每個(gè)處理設(shè)6次重復(fù)。

將培養(yǎng)皿置于人工智能培養(yǎng)箱中恒溫25℃下暗培養(yǎng)3d,從第4天起在溫度25℃、光照12h條件下培養(yǎng)。試驗(yàn)期間適量補(bǔ)充浸提液以保持濾紙濕潤。種子開始發(fā)芽后,每天觀察并記錄發(fā)芽種子數(shù)目(胚根或胚軸突破種皮1—2mm為萌發(fā)),直至連續(xù)2d無種子萌發(fā)為止,從2015年7月16日至8月1日共歷時(shí)17d。計(jì)算大針茅種子的發(fā)芽率及發(fā)芽勢,計(jì)算公式[39]如下：

發(fā)芽率=(發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%

發(fā)芽勢=(前10d內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%

在培養(yǎng)期末,于每個(gè)培養(yǎng)皿中挑選10株健壯幼苗,用吸水紙吸干水分,用直尺測定每株幼苗的苗高和根長,并用電子天平稱量這10株幼苗的干重(105℃殺青0.5h后,70℃烘干至恒重)。

1.5 羽茅浸提液化學(xué)成分分析

選取化感活性較強(qiáng)的未染菌(E-)羽茅浸提液和活性較弱的感染Eg的羽茅浸提液進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)物質(zhì)測定。各取10mL羽茅浸提液母液,加入等量的石油醚萃取得到石油醚萃取物,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40℃下濃縮至干,再用1mL石油醚溶解,進(jìn)樣GC-MS分析。

GC條件：色譜柱為HP- 5MS;石英毛細(xì)管柱(30m×250μm×0.25μm);升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0℃,以15℃/min的速率升至180℃,保持5min,再以10℃/min升至220℃,保持15min;載氣為He(99.99%),柱流速為1mL/min,不分流;進(jìn)樣口溫度為280℃。

MS條件：EI離子源,離子源溫度為230℃;電子能量為70eV;掃描范圍為39—450amu;采集方式為全掃描。

采用Agilent數(shù)據(jù)分析軟件和NIST11譜庫兼顧色譜保留時(shí)間定性,采用峰面積表示物質(zhì)含量。根據(jù)“80%原則”[40],采用譜庫匹配系數(shù)大于等于80%的化合物進(jìn)行分析。

1.6 潛在化感物質(zhì)的驗(yàn)證試驗(yàn)

參考周寶利[41]等的方法。將2,4-二叔丁基苯酚、鄰苯二甲酸、鄰苯二甲酸二丁酯和硬脂酸甲酯先用無水乙醇溶解,再逐漸加入蒸餾水,配制得到0.01、0.05mmol/L和0.10mmol/L的溶液,乙醇最終濃度為1.5%,以1.5%乙醇作為對照(CK),設(shè)置6個(gè)重復(fù)。取不同濃度的溶液6mL分別加入鋪有兩層滅菌濾紙的干燥培養(yǎng)皿中進(jìn)行大針茅種子萌發(fā)和幼苗生長試驗(yàn),具體方法同1.4。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2010軟件錄入,采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析處理,文中數(shù)據(jù)均以“均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 羽茅浸提液對大針茅種子萌發(fā)的影響

大針茅種子的發(fā)芽率受羽茅浸提液濃度的顯著影響,且4種不同內(nèi)生真菌感染狀況的羽茅浸提液均表現(xiàn)出“劑量效應(yīng)”,即隨浸提液濃度的增大,對大針茅種子發(fā)芽率的抑制作用逐漸增強(qiáng)(表1,圖1)。大針茅種子的發(fā)芽率也受內(nèi)生真菌的顯著影響,具體表現(xiàn)在：3種浸提液濃度條件下,未染菌(E-)羽茅浸提液對大針茅種子發(fā)芽率的抑制作用均最強(qiáng),內(nèi)生真菌感染可緩解宿主羽茅對大針茅發(fā)芽率的抑制作用,且這種抑制效應(yīng)與內(nèi)生真菌種類有關(guān),相比于未染菌羽茅,感染Eg可顯著緩解宿主羽茅對大針茅的抑制作用,而感染Ns、Ng有緩解羽茅對大針茅化感作用的趨勢,但同E-羽茅相比未達(dá)到顯著差異(表1,圖1)。

表1 不同內(nèi)生真菌-羽茅共生體中,浸提液濃度、內(nèi)生真菌感染狀態(tài)對受體大針茅種子萌發(fā)和幼苗生長影響的方差分析

Table 1 Analysis of variance for the effects of extract concentration, endophyte infection status of differentAchnatherumsibiricum-endophyte symbionts on the seed germination and seedling growth ofStipagrandis

df發(fā)芽率/%Germinationrate發(fā)芽勢/%Germinationpotential苗高/cmSeedlingheight根長/cmRootlength苗干重/mgShootweight根干重/mgRadicleweightFpFpFpFpFpFpC245．149<0．00182．104<0．001131．436<0．00137．680<0．001165．479<0．00119．671<0．001E36．4180．0016．3400．0012．6090．0590．6460．58910．348<0．0013．4150．023C×E61．6690．1442．4170．0370．4320．8550．6420．6961．2880．2761．5330．183誤差62

C: 浸提液濃度extract concentration,E: 內(nèi)生真菌感染狀態(tài)endophyte infection status; 表中黑色字體表示差異顯著(P<0.05)

圖1 不同浸提液濃度和染菌狀態(tài)對大針茅種子發(fā)芽率的影響Fig.1 Effects of different extract concentration and endophyte infection status on the germination rate of Stipa grandis

圖2 不同浸提液濃度下,不同內(nèi)生真菌感染狀態(tài)對大針茅種子發(fā)芽勢的影響Fig.2 Effects of different endophyte infection status on the germination potential of Stipa grandis under various extract concentration Eg： Epichlo? gansuence;Ng： Neotyphodium gansuensis;Ns： Neotyphodium sibiricum;E-： endophyte-free

大針茅種子發(fā)芽勢受羽茅浸提液濃度和內(nèi)生真菌的交互影響(表1,圖2)。0.01 g/mL浸提液處理下E-羽茅對受體發(fā)芽勢的抑制作用顯著高于感染Eg的羽茅。而0.03 g/mL濃度水平下,感染Ng和未染菌(E-)的羽茅浸提液對大針茅發(fā)芽勢的化感作用強(qiáng)度顯著高于感染Eg的羽茅。0.05 g/mL浸提液處理對大針茅種子發(fā)芽勢的抑制作用最強(qiáng),但此濃度下內(nèi)生真菌的感染狀況對受體發(fā)芽勢的影響無顯著差異。

2.2 羽茅浸提液對大針茅幼苗生長的影響

2.2.1 羽茅浸提液對大針茅幼苗苗高和根長的影響

大針茅幼苗的苗高受羽茅浸提液濃度的顯著影響,4種不同內(nèi)生真菌感染狀況的羽茅浸提液均表現(xiàn)出“低濃度無影響,高濃度抑制”的濃度效應(yīng)趨勢(表1,圖3)。與對照相比,0.05 g/mL濃度水平的浸提液顯著抑制受體的苗高,而0.03 g/mL和0.01 g/mL浸提液水平對大針茅的苗高無顯著影響。而內(nèi)生真菌的感染狀況對大針茅苗高的影響無顯著差異(表1)。

大針茅幼苗的根長也受羽茅浸提液濃度的顯著影響,且不同內(nèi)生真菌感染狀況的羽茅浸提液的作用趨勢均表現(xiàn)為低濃度促進(jìn),高濃度抑制(表1,圖3)。與對照相比,高濃度的0.05 g/mL浸提液處理顯著抑制受體的根長生長,而0.01 g/mL濃度水平可顯著促進(jìn)受體根的生長。但內(nèi)生真菌的感染狀況對受體大針茅根長的生長無顯著影響(表1)。

圖3 不同浸提液濃度對大針茅幼苗苗高和根長的影響Fig.3 Effects of different extract concentration on the seedling height and root length of Stipa grandis

2.2.2 羽茅浸提液對大針茅幼苗苗重和根重的影響

大針茅的幼苗苗重受浸提液濃度的顯著影響,4種不同內(nèi)生真菌感染狀況的羽茅浸提液均表現(xiàn)出“低濃度無明顯作用,高濃度抑制”的效應(yīng)趨勢(表1,圖4)。與對照相比,0.05 g/mL濃度的浸提液對受體苗重表現(xiàn)出顯著的抑制作用,而0.01 g/mL和0.03 g/mL濃度水平的羽茅浸提液對幼苗苗重?zé)o顯著影響。與苗高類似,大針茅的幼苗苗重還受內(nèi)生真菌的顯著影響(表1,圖4),表現(xiàn)為3種浸提液濃度條件下,E-羽茅浸提液對大針茅幼苗苗重的抑制作用均最強(qiáng),感染Eg可顯著緩解羽茅對大針茅幼苗苗重的抑制作用,而感染Ns、Ng有緩解宿主羽茅對大針茅苗重化感作用的趨勢,但同E-羽茅的抑制作用相比未達(dá)到顯著差異。

圖4 不同浸提液濃度和內(nèi)生真菌感染狀態(tài)對大針茅幼苗苗重和根重的影響Fig.4 Effects of different extract concentration and endophyte infection status on the shoot weight and radicle weight of Stipa grandis

大針茅幼苗的根重也受羽茅浸提液濃度的顯著影響,不同內(nèi)生真菌感染狀況的羽茅浸提液的作用趨勢均表現(xiàn)為“劑量效應(yīng)”,即隨浸提液濃度的增加,大針茅幼苗根重受到的抑制作用逐漸增強(qiáng)(表1,圖4)。另外,受體大針茅的幼苗根重受內(nèi)生真菌的顯著影響(表1,圖4),表現(xiàn)在：3種浸提液濃度條件下,E-羽茅浸提液對大針茅幼苗的根重均具有最強(qiáng)的抑制作用。與未染菌羽茅相比,感染Eg可顯著緩解羽茅對大針茅幼苗根重的化感作用,而感染Ns、Ng的羽茅對大針茅根重的抑制作用同E-羽茅相比未達(dá)到顯著差異。

2.3 羽茅浸提液化學(xué)成分分析

對化感活性較強(qiáng)的未染菌(E-)羽茅和化感活性較弱的感染Eg的羽茅浸提液樣品經(jīng)石油醚萃取后進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析,并通過標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫NIST11進(jìn)行計(jì)算機(jī)檢索,鑒定出E-羽茅浸提液中含有19種物質(zhì),而感染Eg的羽茅浸提液含有17種物質(zhì)(表2),其中,E-羽茅浸提液中主要有烷烴類化合物(18.39%)、酯類(5.07%)、有機(jī)酸(2.93%)、對二甲苯(2.68%)、萘(2.61%)、醇類(1.74%)和酚類(1.37%);而感染Eg的羽茅浸提液中的主要成分是烷烴類化合物(18.47%)、酯類(2.60%)、對二甲苯(2.36%)、萘(1.94%)、有機(jī)酸(1.89%)、醇類(1.27%)和酚類(0.65%)。兩種化感活性不同的浸提液中均含有2,4-二叔丁基苯酚、鄰苯二甲酸、鄰苯二甲酸二丁酯和硬脂酸甲酯,只是化感活性較強(qiáng)的E-羽茅浸提液中的上述4種物質(zhì)含量均高于Eg羽茅。

表2 不同化感活性的羽茅浸提液化學(xué)成分

2.4 潛在化感物質(zhì)的驗(yàn)證試驗(yàn)

如表3所示,2,4-二叔丁基苯酚對大針茅的化感作用基本表現(xiàn)為“低濃度無影響,高濃度抑制”的現(xiàn)象。與對照相比,當(dāng)濃度為0.01 mmol/L時(shí),2,4-二叔丁基苯酚除顯著促進(jìn)了大針茅幼苗的苗高生長外,對其余指標(biāo)均無顯著影響;當(dāng)濃度為0.05 mmol/L時(shí),2,4-二叔丁基苯酚顯著抑制了大針茅種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢及幼苗的根長生長;當(dāng)濃度為0.10 mmol/L時(shí),除苗干重外,大針茅的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、苗高、根長和根干重等指標(biāo)均受到顯著抑制。

鄰苯二甲酸對大針茅的化感作用表現(xiàn)為“劑量效應(yīng)”的濃度效應(yīng)趨勢。與對照相比,當(dāng)濃度為0.01 mmol/L和0.05 mmol/L時(shí),鄰苯二甲酸均顯著抑制了大針茅種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和根干重,但0.05 mmol/L的鄰苯二甲酸對大針茅種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢的抑制效應(yīng)達(dá)到極顯著水平;當(dāng)濃度為0.10 mmol/L時(shí),除幼苗根長外,大針茅的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、苗高、苗干重和根干重等指標(biāo)均受到鄰苯二甲酸的顯著抑制。

鄰苯二甲酸二丁酯對大針茅的化感作用表現(xiàn)為“低促高抑”的效應(yīng)趨勢。與對照相比,0.01 mmol/L濃度的鄰苯二甲酸二丁酯顯著促進(jìn)了大針茅種子的發(fā)芽率、苗高和苗干重;當(dāng)濃度為0.05 mmol/L時(shí),鄰苯二甲酸二丁酯對大針茅幼苗的苗高有顯著抑制作用,對其余指標(biāo)無顯著影響;而當(dāng)濃度為0.10 mmol/L時(shí),除根長和根干重外,大針茅的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、苗高和苗干重等指標(biāo)均受到顯著抑制。

與鄰苯二甲酸類似,硬脂酸甲酯對大針茅的化感效應(yīng)趨勢也表現(xiàn)為“劑量效應(yīng)”。與對照相比,當(dāng)濃度為0.01mmol/L時(shí),硬脂酸甲酯顯著抑制了大針茅種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和苗高;而0.05 mmol/L濃度的硬脂酸甲酯抑制作用更強(qiáng),對大針茅種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、苗高和苗干重均有顯著抑制;當(dāng)濃度為0.10 mmol/L時(shí),除根干重外,大針茅的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、苗高、苗干重和根長等指標(biāo)均受到硬脂酸甲酯的顯著抑制。

表3 4種潛在化感物質(zhì)對大針茅種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

3 討論

關(guān)于內(nèi)生真菌感染對宿主植物化感潛力的影響目前只在高羊茅和黑麥草等栽培禾草中有研究報(bào)道,而且內(nèi)生真菌對宿主化感作用影響的結(jié)論也不一致。如Sutherland等[42]發(fā)現(xiàn)感染內(nèi)生真菌的多年生黑麥草對白三葉草(Trifoliumrepens)的化感效應(yīng)顯著強(qiáng)于未染菌植物;Vázquez-de-Aldana等[43]的研究也表明相比于未染菌宿主植物,染菌高羊茅的根部浸提液能顯著抑制百脈根(Lotuscorniculatus)和車前草(Plantagolanceolata)等目標(biāo)植物的幼苗生長。但Springer等[44]的結(jié)果卻發(fā)現(xiàn),高羊茅對5種豆科植物的種子萌發(fā)、幼苗生長的化感作用與內(nèi)生真菌無顯著相關(guān)性。Renne等[45]也發(fā)現(xiàn),高羊茅對南美本地草原植物種子萌發(fā)和幼苗生長的抑制效應(yīng)并不受到內(nèi)生真菌感染與否的影響。本研究以群落伴生種羽茅和群落優(yōu)勢種大針茅為實(shí)驗(yàn)材料,發(fā)現(xiàn)未染菌羽茅的化感作用最強(qiáng),感染內(nèi)生真菌可緩解宿主羽茅對群落優(yōu)勢種大針茅的化感作用,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一方面說明內(nèi)生真菌感染沒有提高宿主植物的干擾性競爭能力,另一方面也為解釋自然生境中感染內(nèi)生真菌的羽茅和大針茅長期共存的現(xiàn)象提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究中,人們發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌對宿主羽茅的生長發(fā)育和抗性方面具有正效應(yīng),如李夏[36]研究發(fā)現(xiàn),與未染菌羽茅相比,內(nèi)生真菌感染顯著增加了宿主羽茅的綠葉生物量和地上部分總生物量的積累,從而促進(jìn)了宿主的生長發(fā)育;秦俊華等[46]發(fā)現(xiàn),內(nèi)生真菌可顯著提高宿主羽茅對東亞飛蝗的抗性;而謝鳳行等[47]的研究結(jié)果表明,內(nèi)生真菌對宿主植物羽茅在抗病原菌侵染方面具有一定的增益作用。因此,對于羽茅而言,內(nèi)生真菌感染是通過促進(jìn)宿主植物的生長和增強(qiáng)其抗逆性而增強(qiáng)宿主植物的競爭力的。

相比于內(nèi)生真菌種類較為單一的栽培禾草,天然禾草通常感染有多種內(nèi)生真菌,而內(nèi)生真菌種類對宿主影響的研究主要集中植物的生長和抗性方面,在生長方面,Iannone等[28]發(fā)現(xiàn)2種內(nèi)生真菌N.pampeanum和N.tembladerae對宿主雀麥屬植物生物量的影響有顯著差異,N.pampeanum對宿主生物量的貢獻(xiàn)顯著高于N.tembladerae。Hamilton等[48]的研究也表明,不同的內(nèi)生真菌N.tembladerae和N.huerfanum對宿主生物量的有益影響在所有處理下均有顯著差異。但Oberhofer等[49]發(fā)現(xiàn)不同種類的內(nèi)生真菌E.hordelymi、E.sylvaticassp.Pollinensis和E.bromicola對宿主三柄麥屬植物營養(yǎng)生長的影響均無顯著差異?？剐苑矫?Brem等[50]發(fā)現(xiàn),感染無性型菌株對宿主禾草抗蟲性的增益作用顯著強(qiáng)于有性型菌株。而李夏[36]發(fā)現(xiàn),不同內(nèi)生真菌對宿主羽茅生長的影響不同,感染Ng的羽茅綠葉生物量顯著高于Ns-羽茅共生體,而感染Eg的羽茅綠葉生物量同感染Ng和Ns的羽茅無顯著差異。本研究也表明,不同種類內(nèi)生真菌感染的羽茅對受體大針茅種子萌發(fā)和幼苗生長的化感效應(yīng)有顯著差異,與未染菌羽茅相比,感染Eg可顯著緩解宿主羽茅對大針茅的抑制作用,而感染Ns、Ng有緩解羽茅對大針茅化感作用的趨勢,但未達(dá)到顯著影響。

植物體內(nèi)的化感物質(zhì)往往是微量的,提取、分離和鑒定具有一定的難度。現(xiàn)代化學(xué)鑒定手段的進(jìn)步為植物化感物質(zhì)的分離鑒定提供了有力的技術(shù)支持,氣相色譜-質(zhì)譜儀(GC-MS)是常用的鑒定化感物質(zhì)的儀器[51]。劉成等[52]利用GC-MS方法分離鑒定出蘆葦中含有的化感物質(zhì)有棕櫚酸甲酯、2-甲基烯丙醇等。鄔彩霞等[53]用GC-MS技術(shù)鑒定出香豆素可能是黃花草木樨浸提液中的主效化感物質(zhì)。董曉寧等[54]采用GC-MS技術(shù)分離鑒定了多花黑麥草的化感物質(zhì)有草酸、鄰苯二甲酸及其衍生物等。本研究通過GC-MS技術(shù)從化感活性較強(qiáng)的未染菌羽茅浸提液中鑒定得到了19種物質(zhì)成分,其中2,4-二叔丁基苯酚、鄰苯二甲酸、鄰苯二甲酸二丁酯和硬脂酸甲酯已分別在茄子[55]、蘿卜[56]、萵苣[57]、南美蟛蜞菊[58]中被證實(shí)具有化感活性,對化感活性較弱的感染Eg的羽茅浸提液運(yùn)用GC-MS技術(shù)分離得到17種化學(xué)成分,其浸提液中也含有2,4-二叔丁基苯酚、鄰苯二甲酸、鄰苯二甲酸二丁酯和硬脂酸甲酯,但感染Eg的宿主羽茅體內(nèi)這4種化感物質(zhì)的含量低于未染菌羽茅,這可能是兩種羽茅浸提液化感活性具有顯著差異的原因。對羽茅浸提液中4種潛在化感物質(zhì)的化感作用進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果表明,2,4-二叔丁基苯酚對大針茅的化感作用表現(xiàn)為低濃度無影響,高濃度抑制,鄰苯二甲酸二丁酯的化感作用表現(xiàn)為“低促高抑”的效應(yīng)趨勢,而鄰苯二甲酸和硬脂酸甲酯對大針茅表現(xiàn)出“劑量效應(yīng)”的化感作用趨勢,4種潛在化感物質(zhì)在高濃度時(shí)均可顯著抑制大針茅的種子萌發(fā)和幼苗生長,這與GC-MS測定得到的結(jié)果一致。當(dāng)然,由于GC-MS不能對植物中的熱不穩(wěn)定性和一些大分子代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析[59],本研究不排除羽茅中還存在其他種類的化感物質(zhì),因此進(jìn)一步研究羽茅中潛在的化感物質(zhì),并分析其化感成分的作用和轉(zhuǎn)化機(jī)理將成為以后研究的方向。

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Allelopathic effect of endophyte-infectedAchnatherumsibiricumonStipagrandis

GAO Yuan, LI Geping, SHI Hong, LIU Hui, REN Anzhi*, GAO Yubao

CollegeofLifeScience,NankaiUniversity,Tianjin300071,China

Endophytes are commonly defined as fungi that colonize internal tissues of plants for all or part of their life cycle. The largest plant family hosting endophytes is Poaceae. Enhanced competitive ability of endophyte-infected grasses has been well documented, including improved shoot and root growth, and greater resistance to biotic and abiotic stresses. However, the role of endophytes on the allelopathic effect of host grass is less studied.Achnatherumsibiricumis a perennial sparse bunchgrass, which always occurs as an accompanying species, and is typically highly infected by fungal endophytes.A.sibiricumcan be infected by three endophytic fungi,Neotyphodiumsibiricum(Ns),Neotyphodiumgansuensis(Ng), andEpichlo?gansuensis(Eg). Early studies ofA.sibiricum-endophyte symbiota suggested that endophyte infection could improve the growth and stress tolerance ofA.sibiricum, allowing the host grass to adapt to stressful or even extreme environmental conditions. However, few studies have examined effects of endophyte infection on allelopathic performance ofA.sibiricum. In our study, we selected the natural grassStipagrandis, a dominant species in a native community ofA.sibiricum, as our research subject. The allelopathic effect of water aqueous extracts ofA.sibiricumwith different endophyte infection levels on seed germination and seedling growth ofS.grandiswas tested in petri dishes in the laboratory. GC-MS were used to identify chemical components of aqueous extracts ofA.sibiricum. The results were as follows: (1) UninfectedA.sibiricumelicited the strongest inhibitory effect on the germination and seedling growth ofS.grandis. Endophyte infection could alleviate allelopathic effect ofA.sibiricumon the target species. (2) The allelopathic effect ofA.sibiricumwas related to the endophyte species. Compared with endophyte-freeA.sibiricum, Eg infection significantly alleviated the allelopathic effect ofA.sibiricum, whereas Ns and Ng infection tended to alleviate the allelopathic potential of the host grass, although the difference was not significant. (3) Four allelochemicals in water aqueous extracts ofA.sibiricumwere identified via GC-MS, including 2,4-di-tert-butylphenol, phthalic acid, dibutyl phthalate, and methyl stearate. The relative difference in the amounts of these four allelochemicals may account for different allelopathic responses ofA.sibiricum. (4) The allelopathic effect of the four potential allelochemicals was validated. The results showed that 2,4-di-tert-butylphenol had no significant effect onS.grandisat lower concentration, but was inhibitory at higher concentration, as compared to the control. Dibutyl phthalate showed a “l(fā)ow-promotion and high-inhibition effect”, whereas phthalic acid and methyl stearate showed a “dose effect” onS.grandis. Therefore, the four potential allelochemicals could inhibit seed germination and seedling growth ofS.grandisat higher concentrations.

endophyte;Achnatherumsibiricum;Stipagrandis; allelopathy

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31270463,31570433);教育部博士點(diǎn)基金資助項(xiàng)目(20130031110023)

2016- 04- 16;

2016- 08- 15

10.5846/stxb201604160704

*通訊作者Corresponding author.E-mail: renanzhi@nankai.edu.cn

高遠(yuǎn),李隔萍,施宏,劉慧,任安芝,高玉葆.感染內(nèi)生真菌的羽茅對大針茅的化感作用.生態(tài)學(xué)報(bào),2017,37(4):1063- 1073.

Gao Y, Li G P, Shi H, Liu H, Ren A Z, Gao Y B.Allelopathic effect of endophyte-infectedAchnatherumsibiricumonStipagrandis.Acta Ecologica Sinica,2017,37(4):1063- 1073.