代博娜， 鄒亞娟， 吳節(jié)莉

(上海交通大學(xué) 分析測(cè)試中心，上海 200240)

淬火溫度對(duì)瓊膠多糖凝膠過程的影響

代博娜， 鄒亞娟， 吳節(jié)莉

(上海交通大學(xué) 分析測(cè)試中心，上海 200240)

為表征瓊膠多糖溶液在淬火后形成凝膠過程中分子構(gòu)象的變化，提出脈沖梯度場(chǎng)核磁共振技術(shù)表征的新手段。通過測(cè)量溶液中瓊膠多糖分子的質(zhì)子信號(hào)強(qiáng)度和自擴(kuò)散系數(shù)的變化，考察了淬火溫度對(duì)瓊膠多糖形成凝膠過程影響。研究發(fā)現(xiàn)，淬火發(fā)生30 min內(nèi)，多糖質(zhì)子信號(hào)強(qiáng)度及自擴(kuò)散系數(shù)都急劇減小，而后在恒溫測(cè)量(0.5～18 h)期間，多糖質(zhì)子信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)一步減小。在恒溫測(cè)量(0.5～18 h)期間，當(dāng)淬火溫度接近凝膠轉(zhuǎn)變溫度時(shí)，瓊膠多糖分子的自擴(kuò)散系數(shù)變大，而當(dāng)淬火溫度低于凝膠轉(zhuǎn)變溫度時(shí)，瓊膠多糖的自擴(kuò)散系數(shù)會(huì)減小。結(jié)果表明：淬火發(fā)生后凝膠分兩步形成：首先，多糖分子形成聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；其次，隨著時(shí)間的推移，越來越多的多糖分子進(jìn)入到聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。如果淬火溫度低于凝膠轉(zhuǎn)變溫度，體系的變化快而顯著。

瓊膠； 脈沖梯度場(chǎng)核磁共振； 自擴(kuò)散系數(shù)； 凝膠； 淬火溫度

0 引 言

瓊膠是從紅藻中提取的一種親水性膠體，通?？煞Q為瓊脂、洋菜、凍粉等，英文名Agar或Agar-agar[1-2]。瓊膠是一種復(fù)雜的水溶性多糖，由瓊脂糖和硫瓊膠兩部分組成。瓊脂糖是一種中性多糖且具有極強(qiáng)的凝膠能力，而硫瓊膠是一種陰離子型多糖，不易形成凝膠。瓊膠高溫時(shí)可以在水中溶解，低溫下會(huì)形成凝膠。瓊膠因其良好及穩(wěn)定的凝膠特性而廣泛應(yīng)用在食品工業(yè)。形成凝膠的多糖類對(duì)改善食品的質(zhì)地起著重要的作用[3-4]，對(duì)其凝膠機(jī)理的研究是開發(fā)相同類型水凝膠的基礎(chǔ)，同時(shí)也是對(duì)該體系的各方面性能進(jìn)行改進(jìn)的前提。目前對(duì)多糖水凝膠的研究主要是從流變學(xué)、生物學(xué)和形貌學(xué)的角度[5-8]，這些對(duì)說明凝膠機(jī)理有一定局限性，所以對(duì)其分子水平機(jī)理的研究是十分必要的。

核磁共振(NMR)技術(shù)廣泛應(yīng)用于研究多糖水凝膠，其中，應(yīng)用核磁共振氫譜(1H NMR)可以確定體系的凝膠溫度，即可通過相關(guān)組分化學(xué)位移或信號(hào)強(qiáng)度變化的拐點(diǎn)來確定體系的凝膠轉(zhuǎn)變溫度[9-11]；應(yīng)用弛豫時(shí)間測(cè)量技術(shù)[12-16]可以從分子水平對(duì)凝膠內(nèi)水分子的存在狀態(tài)、與高聚物的相互作用進(jìn)行系統(tǒng)深入的研究；而利用脈沖梯度場(chǎng)(PFG)NMR技術(shù)[17-21]不僅可以從分子水平研究凝膠機(jī)理，還可以通過觀測(cè)探測(cè)分子在凝膠中的擴(kuò)散行為，評(píng)價(jià)凝膠的網(wǎng)孔尺寸等探究多糖水凝膠的微觀構(gòu)象。

本文應(yīng)用PFG-NMR技術(shù)研究不同淬火溫度對(duì)瓊膠溶液形成凝膠過程中微觀結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瓊膠(BA-10，Mw=3.44×105g/mol，Ina Food Industry Co. Ltd.，Nagano， Japan)。

1.2 儀器與設(shè)備

Bruker Avance II 400WB超導(dǎo)核磁共振波譜儀；HLC-8120 GPC(Tosoh Co. Ltd， Japan)。

1.3 方 法

1.3.1 NMR樣品制備

將瓊膠粉末分散在D2O里室溫下攪拌過夜，然后在95 °C下保溫6 h直至樣品完全溶解，最后將所得溶液快速轉(zhuǎn)移到預(yù)熱過的10 mm核磁管中，并控制核磁管中溶液高度不超過1 cm。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，樣品在105 °C的烘箱里干燥12 h后稱重以確定瓊膠溶液中瓊膠的質(zhì)量百分比。

1.3.2 GPC樣品制備

將適量瓊膠粉末置于去離子水中，95 °C溶解制備約0.1%的瓊膠溶液用于GPC實(shí)驗(yàn)以測(cè)定瓊膠的相對(duì)分子質(zhì)量。在可以編程控溫的烘箱中(室溫)對(duì)瓊膠溶液進(jìn)行淬火處理制備瓊膠凝膠，粉碎，10 500 r/min離心15 min，取上清液用于GPC實(shí)驗(yàn)以測(cè)定瓊膠凝膠中處于溶液狀態(tài)的瓊膠的相對(duì)分子質(zhì)量分布情況。

1.4 NMR實(shí)驗(yàn)

溶液NMR實(shí)驗(yàn)采用Bruker Avance II 400WB核磁共振波譜儀，其1H的共振頻率為400.13 MHz，梯度場(chǎng)處于z方向上。擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)所用脈沖序列為PFG-STE，見圖1。第1及第2個(gè)90°脈沖之間的間隔τ2、第2及第3個(gè)90°脈沖之間的間隔τ1分別為2.12和7.85 ms。實(shí)驗(yàn)采用溫控系統(tǒng)為BVT 3200，溫度由放置在核磁管中的光纖溫度計(jì)(Takaoka Electric Manufacturing Co.)測(cè)定，示意圖見圖2，溫控誤差±0.1 K。實(shí)驗(yàn)溫度由80 °C直接降到45 °C、34 °C及23 °C恒溫30 min后開始第1次采樣，而后每隔1.5 h采1次樣直至第18 h最后一次采樣實(shí)驗(yàn)結(jié)束。實(shí)驗(yàn)中1H的90°脈沖的寬度16 μs，弛豫延遲時(shí)間5 s，采樣次數(shù)32，采樣點(diǎn)數(shù)8 192。自擴(kuò)散系數(shù)由下式計(jì)算[22-23]：

其中：I(g)和I(0)分別為t=2τ2+τ1梯度脈沖存在及梯度脈沖為零時(shí)1H的信號(hào)強(qiáng)度；γ為1H的磁旋比；脈沖梯度場(chǎng)寬度δ為1 ms；擴(kuò)散時(shí)間Δ為10 ms；脈沖梯度場(chǎng)強(qiáng)度g從2.0 T/m逐步(分8次)等間隔遞增到8.0 T/m。1H化學(xué)位移以HDO質(zhì)子信號(hào)(25 °C，相對(duì)于DSS為δ4.70)為標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定。

圖1 PFG-STE 脈沖序列

圖2 待測(cè)樣品示意圖

1.5 GPC實(shí)驗(yàn)

所有樣品在實(shí)驗(yàn)前都經(jīng)0.45 μm濾膜過濾。實(shí)驗(yàn)所用流動(dòng)相為0.1 mol/L NaCl，實(shí)驗(yàn)溫度為30 °C，流速1.0 mL/min，以普魯蘭(pullulan)多糖標(biāo)樣繪制校正曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶液中瓊膠多糖質(zhì)子信號(hào)強(qiáng)度的變化

由圖3(a)可見，分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)引起NMR信號(hào)強(qiáng)度的衰減，與梯度脈沖的脈寬δ、強(qiáng)度g及分子的自擴(kuò)散系數(shù)D有關(guān)。我們將脈沖梯度場(chǎng)的強(qiáng)度從2.0 T/m逐步(分8次)等間隔遞增到 8.0 T/m，記錄一系列相應(yīng)的1D1H NMR譜，然后對(duì)δ(3.0～5.8)×10-6的譜峰進(jìn)行積分。由圖3(b)可見，盡管瓊膠多糖的相對(duì)分子質(zhì)量分布存在一定的范圍，但實(shí)驗(yàn)所用樣品在所有時(shí)刻的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都是呈線性分布的，因此，得到3組平均自擴(kuò)散系數(shù)值Dagar，并獲得質(zhì)子信號(hào)強(qiáng)度值Iagar(0)。所有的Iagar(0)值都基于相應(yīng)樣品在80 °C時(shí)的Iagar(0)值進(jìn)行了歸一化。

(a)

(b)

圖3 (a) 2.0%瓊膠溶液在80 °C時(shí)的1H堆積譜；(b)γ2g2δ2(Δ-δ/3)對(duì)積分強(qiáng)度的自然對(duì)數(shù)值作圖

BA-10瓊膠多糖溶液在質(zhì)量濃度為2.0%左右時(shí)的凝膠溫度為45 °C[21]。在溶液狀態(tài)，瓊膠多糖分子以無序的無規(guī)線團(tuán)形式存在，分子鏈段的運(yùn)動(dòng)是自由的。瓊膠多糖分子的橫向弛豫時(shí)間T2在81～103 ms(遠(yuǎn)大于2τ2，約4 ms)，縱向弛豫時(shí)間T1在1 s左右(遠(yuǎn)大于τ1，約8 ms)。在PFG-STE實(shí)驗(yàn)中，多糖分子質(zhì)子信號(hào)強(qiáng)度在回波時(shí)間2τ2+τ1內(nèi)因弛豫引起的衰減很少。當(dāng)瓊膠多糖分子形成雙螺旋的剛性結(jié)構(gòu)后，分子鏈段運(yùn)動(dòng)受阻，其弛豫時(shí)間變短，低于回波時(shí)間2τ2+τ1，在PFG-STE實(shí)驗(yàn)中這些多糖分子信號(hào)在回波時(shí)間內(nèi)衰減為零，儀器將無法采集到這些多糖分子的質(zhì)子信號(hào)。

從圖4可知，3條Iagar(0)曲線在溶液溫度從80 °C驟降至目標(biāo)溫度后，最初的30 min都呈現(xiàn)一個(gè)大幅的減少。這說明當(dāng)瓊膠多糖溶液的溫度驟降到凝膠轉(zhuǎn)變溫度附近或低于凝膠轉(zhuǎn)變溫度時(shí)，凝膠開始形成，分子鏈長(zhǎng)的多糖分子經(jīng)歷從無序的無歸線團(tuán)到有序的雙螺旋的構(gòu)象轉(zhuǎn)換過程之后，并于分子鏈之間產(chǎn)生氫鍵作用和分子纏結(jié)，形成交聯(lián)點(diǎn)，最終形成聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)是剛性的，多糖分子鏈運(yùn)動(dòng)受限，相應(yīng)質(zhì)子信號(hào)在回波時(shí)間內(nèi)衰減為零，所以實(shí)驗(yàn)所能檢測(cè)到的仍處于溶液狀態(tài)中的多糖分子的信號(hào)Iagar(0)變小。由圖4可以發(fā)現(xiàn)，淬火溫度越低，初期形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的瓊膠多糖分子越多。在凝膠恒溫保存至18 h的時(shí)間里，越來越多的瓊膠多糖分子參與到網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，到第18 h，淬火溫度為34 °C及23 °C的兩份瓊膠溶液，約90%的瓊膠多糖分子已經(jīng)形成聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而淬火溫度為45 °C的瓊膠溶液，約45%的瓊膠多糖分子還處于溶液狀態(tài)。

圖4 瓊膠溶液中瓊膠多糖的1H時(shí)相圖

2.2 溶液中瓊膠多糖分子自擴(kuò)散系數(shù)的變化

在淬火發(fā)生后30 min時(shí)，多糖分子的自擴(kuò)散系數(shù)都驟降，這是由于溫度驟降造成的。而在恒溫保存期間，淬火溫度為34 °C及23 °C的兩份瓊膠溶液中，多糖的Dagar數(shù)據(jù)雖然有些分散，但整體趨勢(shì)有略微減小，由此可推測(cè)在約90%的瓊膠多糖分子已經(jīng)形成聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)之后，有些瓊膠多糖分子形成了松散的聚集體但仍處于溶液狀態(tài)[21]，使得處于溶液狀態(tài)中的多糖運(yùn)動(dòng)變慢。而淬火溫度為45 °C的瓊膠溶液中多糖的自擴(kuò)散系數(shù)Dagar略有增大，表明在越來越多的多糖分子形成聚合物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)留在溶液狀態(tài)的分子越來越少的同時(shí)，多糖分子運(yùn)動(dòng)變快。這與從凝膠中提取的水相中多糖的相對(duì)分子質(zhì)量分布情況一致。與原始的瓊膠多糖分子大小相比(見圖5)，凝膠中仍處于溶液狀態(tài)的瓊膠多糖相對(duì)分子質(zhì)量都有減小，而從淬火溫度為45 °C的凝膠中提取的水相多糖相對(duì)分子質(zhì)量較另外兩組要偏大些。

圖5 BA-10瓊膠及從其凝膠中提取的液相的瓊膠相對(duì)分子質(zhì)量分布圖

3 結(jié) 語

脈沖梯度場(chǎng)核磁共振實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，淬火發(fā)生后，瓊膠多糖凝膠的聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)很快形成。凝膠在恒溫保存時(shí)間內(nèi)，越來越多的多糖分子加入到網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)之中。當(dāng)淬火溫度低于凝膠轉(zhuǎn)變溫度時(shí)，凝膠的聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更快形成，留在溶液中的多糖分子也越少。

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堅(jiān)持以人為本、推進(jìn)素質(zhì)教育是教育改革發(fā)展的戰(zhàn)略主題，是貫徹黨的教育方針的時(shí)代要求，核心是解決好培養(yǎng)什么人、怎樣培養(yǎng)人的重大問題，重點(diǎn)是面向全體學(xué)生、促進(jìn)學(xué)生全面發(fā)展，著力提高學(xué)生服務(wù)國(guó)家人民的社會(huì)責(zé)任感、勇于探索的創(chuàng)新精神和善于解決總是的實(shí)踐能力。

——摘自《國(guó)家中長(zhǎng)期教育改革和發(fā)展規(guī)劃綱要(2010—2020年)》

Pulse Field Gradient NMR Studies on the Gelation Mechanism in Agar Solutions by Different Quenching Temperatures

DAIBo-na，ZOUYa-juan，WUJie-li

(Instrumental Analysis Center，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200240, China)

Changes in the molecular mobility of agar were measured by pulsed-field-gradient stimulated echo (PFG-STE)1H NMR after quenching, in order to elucidate the effect of different quenching temperature on gelation in agar solutions. Both the echo signal intensity of agarIagar(0) and the diffusion coefficient of agarDagarshowed a steep decrease during the initial cooling stage (in the first ca. 30 minutes) andIagar(0) decreased further with time going by，whileDagarincreased a little after quenching occurred at aroundTs-gand decreased a little when quenching temperature was belowTs-g. These results suggested that the gelation occurred in two stages：firstly the polysaccharide chains in agar aggregated into bundles to form a network when quenching happened. And then more and more agar chains were involved into the network. Changes became more rapidly and more obviously while the quenching temperatures was belowTs-g.

agar； pulse field gradient nuclear magnetic resonance (PFG NMR)； diffusion coefficient； gelation； quenching temperature

2016-04-07

上海交通大學(xué)科技創(chuàng)新專項(xiàng)—青年教師科研起步(AF4040006)

代博娜(1981-)，女，博士，工程師，研究方向：核磁共振在化學(xué)、生物學(xué)中的應(yīng)用。

Tel.：021-34206175/34206173-116；E-mail：daibona@sjtu.edu.cn

TS 201.7

A

1006-7167(2017)01-0042-04