程明林

(青島科技大學(xué) 化工學(xué)院，山東 青島 266000)

生物制藥在治療人類疾病方面起著重要的作用。然而，它們生產(chǎn)成本高，需要高純度和低溫儲存，同時又受到短時間保質(zhì)期的限制。通過開發(fā)具有低成本效益的大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白的表達(dá)平臺可以解決這些問題[1]。轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的藥用蛋白質(zhì)在很大程度上被生物技術(shù)工業(yè)所拋棄，主要是由于其產(chǎn)量低和最終產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性所導(dǎo)致[2]。相比之下，轉(zhuǎn)基因表達(dá)具有將轉(zhuǎn)基因精確整合到葉綠體基因組內(nèi)位點(diǎn)的能力，具有更高的產(chǎn)量和更穩(wěn)定的基因表達(dá)水平等優(yōu)點(diǎn)，在可食用植物細(xì)胞的葉綠體中生產(chǎn)治療蛋白質(zhì)取得了顯著進(jìn)展[3]。

1 葉綠體中的轉(zhuǎn)錄修飾(PTM)機(jī)制

PTM在維持治療性蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和生物活性方面起著重要作用[4]。雖然植物細(xì)胞質(zhì)和分泌途徑中的PTM途徑已被大量闡明，但是葉綠體中蛋白質(zhì)修飾的機(jī)制仍然知之甚少?？赡媪姿峄瘞缀踉诩?xì)胞過程的每個環(huán)節(jié)都嚴(yán)格調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能的活性。因此，異常磷酸化是許多疾病的主要原因之一，包括癌癥、神經(jīng)變性和慢性炎癥[5]。研究表明，凝血因子磷酸化會增強(qiáng)激活蛋白C(APC)失活的敏感性，從而降低凝血效率[6]。同樣，組織因子的高磷酸化阻止了它與其他止血蛋白的相互作用，并干擾凝血酶的形成[7]。通過定位葉綠體的磷酸蛋白和執(zhí)行磷酸化功能的激酶來證明植物葉綠體中磷酸化活性的存在。植物葉綠體中復(fù)雜的氧化還原調(diào)節(jié)機(jī)制表明葉綠體系統(tǒng)中多聚體蛋白的組裝與二硫鍵的形成有關(guān)[8]。二硫鍵的形成對穩(wěn)定三級結(jié)構(gòu)和促進(jìn)多種重組治療蛋白的功能起著重要的作用。在植物葉綠體中生產(chǎn)藥物蛋白質(zhì)以治療糖尿病和傳染病等疾病，表明了葉綠體中存在著內(nèi)源性蛋白二硫轉(zhuǎn)移酶，以確保適蛋白質(zhì)的完整。在葉綠體中表達(dá)的RC101(逆轉(zhuǎn)錄酶)被認(rèn)為是二硫鍵的環(huán)化。此外，葉綠體衍生的CTB融合蛋白與GM1受體的有效結(jié)合需要通過二硫鍵形成五聚體結(jié)構(gòu)。除了內(nèi)源性酶外，外源蛋白二硫鍵異構(gòu)酶和硫氧還蛋白的共同表達(dá)使人血清蛋白在葉綠體中蛋白質(zhì)折疊效率提高[9]。

2 植物葉綠體中重組蛋白的功能

2.1 預(yù)防和治療傳染病

將各種從細(xì)菌，病毒，真菌或原生動物的疫苗抗原克隆到葉綠體表達(dá)載體中，并通過基因槍轟擊將其轉(zhuǎn)化成葉綠體基因組[3]。一旦實(shí)現(xiàn)了同源，重組蛋白的高水平表達(dá)占總蛋白的70%[10]。已經(jīng)在植物葉綠體中表達(dá)了幾種亞單位疫苗候選物，針對各種感染性病原體[7]。針對全球傳染病產(chǎn)生的PMB包括幾種結(jié)核分枝桿菌疫苗抗原，炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原(PA)和脊髓灰質(zhì)炎(脊髓灰質(zhì)炎VP1)疫苗抗原，表達(dá)水平占全部可溶性蛋白質(zhì)的4%至18%。除亞單位疫苗抗原外，抗原肽(AMP)也已在葉綠體中表達(dá)[11]。AMPs是在一類不斷增長的低分子量寡肽，廣泛的抗菌活性，對病毒、真菌和細(xì)菌有廣泛的抗菌作用。與抗生素不同，AMPs針對微生物細(xì)胞膜中的脂多糖，并誘導(dǎo)快速殺死病原體。除抗菌作用外，AMPs已被證明具有免疫調(diào)節(jié)和傷口愈合的特性[12]。

2.2 治療代謝紊亂

在糖尿病治療中蛋白質(zhì)治療有著最高的需求。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在植物質(zhì)粒中完成胰島素的表達(dá)水平占總可溶性蛋白的50%。轉(zhuǎn)基因植物的大規(guī)模生產(chǎn)使植物胰島素劑量每年增加2000萬。在植物葉綠體中，葉綠體表達(dá)的CTB-胰島素原融合蛋白有效組裝可在動物模型中具有完全功能。利用胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)刺激胰腺分泌胰島素來治療II型糖尿病。由于GLP-1在血清中的半衰期非常短，治療II型糖尿病集中在二肽基肽酶IV(DPP-IV)類似物(如：毒蜥外泌肽-4(EX4))，其具較長的血清半衰期(≥4h)。小鼠口服給藥植物衍生的EX4融合人轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(轉(zhuǎn)鐵蛋白)，通過刺激胰島素的分泌來降低葡萄糖，并促進(jìn)胰腺b細(xì)胞的分化和增殖[13]。此外，葉綠體表達(dá)的CTB-EX4在口服給藥時表現(xiàn)出刺激胰島素的作用，而不引起低血糖的副作用[14]。CTB-EX4融合蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中有非常高的產(chǎn)量并且成本效益低，使其成為治療II型糖尿病最理想的口服生物藥物。

2.3 免疫調(diào)節(jié)

血友病是由凝血因子X連鎖突變引起的一種出血性疾病。目前，終身輸注凝血因子VIII(FVIII，治療血友病A)或因子IX(FIX，治療血友病B)是血友病患者的治療標(biāo)準(zhǔn)。血友病治療的主要問題是連續(xù)輸入蛋白質(zhì)后會抑制抗體的發(fā)展。這種對蛋白質(zhì)抗原的免疫引起的過敏反應(yīng)，在嚴(yán)重的情況下是致命的[15]。目前免疫耐受誘導(dǎo)(ITI)的臨床方案需要長期施用高劑量的凝血因子。然而，這種臨床方案非常昂貴，并不能保證有效的免疫耐受。在蛋白質(zhì)替代治療期間，通過口服給藥植物細(xì)胞表達(dá)的FIX可誘導(dǎo)免疫耐受性[16]。通過口服給藥在葉綠體中表達(dá)全長FIX結(jié)構(gòu)域或凍干轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞凝血因子VIII可成功地消除了小鼠體內(nèi)抑制劑的形成[17]。除血友病外，口服給藥在植物葉綠體中表達(dá)的酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)抗原決定簇可讓小鼠消除了龐貝氏癥的抗體反應(yīng)[18]。因此，使用在葉綠體中表達(dá)抗原的免疫調(diào)節(jié)是可行的。

3 結(jié)語

在植物葉綠體中生產(chǎn)功能性藥物蛋白質(zhì)通過口服給藥用以治療糖尿病、血液疾病、代謝紊亂和傳染病以及免疫調(diào)節(jié)是可行的，并且解決了生物制藥生產(chǎn)成本高昂和難儲存的問題。然而功能性蛋白質(zhì)的開發(fā)仍面臨挑戰(zhàn)。例如，來源細(xì)菌的原核基因的高水平表達(dá)是可行的，但大型基因(人類或病毒)的表達(dá)仍未解決。因此，必須在可食用作物中開發(fā)無標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植物，以推進(jìn)葉綠體生物藥物臨床應(yīng)用。更重要的是，需要進(jìn)一步的研究來了解在植物葉綠體中表達(dá)的外源蛋白質(zhì)的翻譯后修飾。這應(yīng)有助于進(jìn)一步推進(jìn)在植物細(xì)胞中制備口服給藥的生物藥物。

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