陳曉飛，劉琪琦，周偉，張五星，李穎

1.解放軍第309醫(yī)院，北京 100091；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京 100850

人腺病毒及其分型方法研究進(jìn)展

陳曉飛1，2，劉琪琦2，周偉1，張五星1，李穎1

1.解放軍第309醫(yī)院，北京 100091；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京 100850

人腺病毒是引起嬰幼兒急性呼吸道感染的主要病原體，還可引起其他系統(tǒng)感染。在臨床表現(xiàn)方面與其他病原微生物的感染比較相似，僅根據(jù)臨床表現(xiàn)診斷疾病比較困難，需要實(shí)驗(yàn)室的診斷證實(shí)。腺病毒的致病譜根據(jù)血清型的不同而不同，而其血清型是由分子結(jié)構(gòu)中高變區(qū)的特異抗原決定的，特定血清型與疾病的嚴(yán)重程度、臨床表現(xiàn)密切相關(guān)，所以腺病毒的檢測(cè)分型尤為重要。本文就腺病毒的分子結(jié)構(gòu)、流行特點(diǎn)及檢測(cè)分型方法進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述。

人腺病毒；分子結(jié)構(gòu)；分型方法

腺病毒最早是在人體的扁桃體組織中發(fā)現(xiàn)的，經(jīng)培養(yǎng)、鑒定后，確定為一種新病毒[1]。腺病毒感染多發(fā)于嬰幼兒和軍隊(duì)，近年來，腺病毒引起的呼吸道感染時(shí)有暴發(fā)，疫情具有發(fā)展快、感染性強(qiáng)的特點(diǎn)，病情嚴(yán)重者危及生命[2]，影響了嬰幼兒和士兵的健康。因此，我們要做好腺病毒感染的預(yù)防控制工作，同時(shí)也對(duì)腺病毒的檢測(cè)及分型提出了更高的要求。

1 腺病毒的分子生物學(xué)特點(diǎn)

腺病毒是一種無包膜球形DNA病毒顆粒，直徑65～90 nm。腺病毒的分子結(jié)構(gòu)主要包括兩部分：一是由蛋白構(gòu)成的外層衣殼，包含240個(gè)六鄰體蛋白和頂角的12個(gè)五鄰體蛋白，六鄰體蛋白是型特異性蛋白，而五鄰體蛋白是群特異性蛋白，每個(gè)五鄰體上伸出一條具有血凝特性的纖突，從而使病毒顆粒類似于通訊衛(wèi)星樣構(gòu)型；二是衣殼內(nèi)包裹的雙鏈DNA遺傳物質(zhì)，整個(gè)基因組長(zhǎng)約38 kb[3]，根據(jù)復(fù)制時(shí)間將DNA分為早期轉(zhuǎn)錄基因和晚期轉(zhuǎn)錄基因，早期轉(zhuǎn)錄基因表達(dá)調(diào)節(jié)蛋白，晚期轉(zhuǎn)錄基因表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白[4]。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道確定了68個(gè)腺病毒型別[5]。依據(jù)生物學(xué)特性的不同，國(guó)際病毒學(xué)分類委員會(huì)（ICTV）將1～52血清型劃分為A～G共7個(gè)亞屬[6]，A、F和G主要引起消化道感染、腹瀉，C、E和部分B亞屬主要引起呼吸道疾病，其他B亞屬主要引起尿路感染，D亞屬主要引起角膜炎和結(jié)膜炎[7]。53～68型是通過高通量測(cè)序技術(shù)確定的新型腺病毒，都是由2個(gè)或多個(gè)腺病毒株重組產(chǎn)生的[8-11]，且多發(fā)生在同一種屬的不同型別之間，A、B、C、D亞屬中均有重組發(fā)生[12]。由于新毒株的感染特性和母病毒株不同[13-14]，這些病毒必須進(jìn)行全基因組測(cè)序和重組分析才能明確其生物學(xué)特性和基因特征。

2 腺病毒的流行特點(diǎn)

腺病毒感染可引發(fā)呼吸系統(tǒng)、胃腸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)及眼部疾病，如肺炎、腹瀉、膀胱炎、結(jié)膜炎等[15]。腺病毒的傳染源主要是腺病毒感染者，顯性感染者發(fā)病初期感染性最強(qiáng)，隱性感染者傳染作用較大，危害較大。腺病毒的傳播途徑主要是飛沫傳播，感染者的呼吸道分泌物可在空氣中保持半小時(shí)，另外還可經(jīng)糞口傳播和接觸傳播。腺病毒的易感人群有兩類：一是免疫力低下的嬰幼兒。嬰幼兒腺病毒感染可引起嚴(yán)重的肺炎或支氣管炎，甚至有致命的危險(xiǎn)。錢淵等[16]對(duì)北京地區(qū)呼吸道腺病毒感染兒童的研究，發(fā)現(xiàn)以腺病毒3、7型為主，其次是11、14型。腺病毒55型是腺病毒11和14型重組而成的新型腺病毒，2006年在陜西首次出現(xiàn)，造成1名患兒死亡[17-18]。二是生活在聚居環(huán)境的新兵，根據(jù)全軍傳染病專業(yè)委員會(huì)編寫的《腺病毒感染診療指南》，部隊(duì)多起腺病毒疫情的病原為腺病毒55、7和14型[19]。腺病毒感染導(dǎo)致的急性呼吸道疾病是基層部隊(duì)冬春常見的傳染病，2011～2013年我國(guó)部分地區(qū)軍營(yíng)中共發(fā)生8期腺病毒感染疫情。2012年腺病毒55型在河北保定和北京軍營(yíng)開始傳播。醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)表明，新兵腺病毒感染率通常超過50%，其中20%～40%發(fā)展為肺炎且須住院治療。

3 腺病毒的分型方法

病毒分離法、免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法是用于臨床和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的傳統(tǒng)方法。病毒分離法通常被認(rèn)為是診斷腺病毒感染的金標(biāo)準(zhǔn)。常用A549和HeLa細(xì)胞培養(yǎng)臨床標(biāo)本中的腺病毒，除血清型40和41外，其他血清型在人上皮細(xì)胞系上生長(zhǎng)良好，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞圓縮，出現(xiàn)核內(nèi)包涵體聚集成串等病變現(xiàn)象，通過觀察這些特征性細(xì)胞致病作用（CPE）來分離腺病毒。該方法耗時(shí)長(zhǎng)（通常要21 d），需要良好的技術(shù)和典型的細(xì)胞病變，不能大規(guī)模應(yīng)用于臨床快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）用于定性和（或）定量檢測(cè)人血清和血漿中抗腺病毒的IgA/IgG抗體，它包括對(duì)人體致病的所有血清型，用于診斷和鑒別診斷腺病毒的急性感染。以上兩種方法均不能區(qū)分具體血清型別。但由于腺病毒血清型眾多、致病譜廣、全球范圍內(nèi)流行[20]，且有與其他病毒混合感染的趨勢(shì)[21-22]，需要檢測(cè)具體的血清型別。中和試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)是常用的分型方法。中和試驗(yàn)通過直接檢測(cè)腺病毒六鄰體蛋白的抗原決定簇，血凝抑制試驗(yàn)則根據(jù)五鄰體蛋白的抗原決定簇檢測(cè)結(jié)果判定血清型[23]。隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，PCR擴(kuò)增法、基因測(cè)序和生物芯片在腺病毒的分型鑒別中更具優(yōu)勢(shì)。

3.1 PCR擴(kuò)增法

PCR擴(kuò)增法是目前應(yīng)用最多的一種分子診斷方式，包括常規(guī)PCR、多重PCR、巢式PCR、熒光定量PCR。它主要以腺病毒特異基因hexon的高度可變區(qū)為基礎(chǔ)，根據(jù)不同血清型基因核酸序列特點(diǎn)設(shè)計(jì)引物和探針，在特定的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下，通過擴(kuò)增特異性目的片段進(jìn)行分型?？梢栽跀?shù)小時(shí)分析出結(jié)果，快速地對(duì)腺病毒進(jìn)行血清型鑒定。多重PCR對(duì)腺病毒符合感染的診斷效果較好，熒光定量PCR在型別檢測(cè)的同時(shí)還能對(duì)病毒量進(jìn)行判斷。

3.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，針對(duì)靶基因的6個(gè)不同區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶的作用下，于60～65℃恒溫環(huán)境，經(jīng)起始階段和擴(kuò)增循環(huán)階段，實(shí)現(xiàn)核酸不停地自我循環(huán)合成。它具有靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)[24-26]。由于腺病毒的疾病譜較廣，可以利用LAMP技術(shù)進(jìn)行針對(duì)性檢測(cè)[27]，如Ziros等[28]檢測(cè)了腺病毒40和41型，李凡等[29]檢測(cè)了腺病毒3、7和14型，趙娜等[30]檢測(cè)了腺病毒7、14和55型。但LAMP技術(shù)也存在對(duì)引物設(shè)計(jì)要求較高，不能實(shí)現(xiàn)高通量的不足。

3.3 基因測(cè)序法

測(cè)序是對(duì)基因序列最準(zhǔn)確、直觀的表達(dá)。隨著新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，測(cè)序速度提高，成本有所降低，有望用于診斷。通過對(duì)腺病毒基因組中變異最大的區(qū)域，即編碼六鄰體蛋白、五鄰體蛋白和纖維蛋白的區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，可以快速準(zhǔn)確地確定其型別。目前，測(cè)序主要應(yīng)用在兩個(gè)方面：一是流行病學(xué)調(diào)查。Tohma等對(duì)40例腺病毒樣本的六鄰體蛋白編碼區(qū)測(cè)序，確定為3型和7型腺病毒[31]。二是腺病毒新型別的確定。新型重組型腺病毒（52～67型）都是基于全基因組測(cè)序分析而確定的[32]，Robinson認(rèn)為DNA測(cè)序及生物信息學(xué)分析是識(shí)別腺病毒新型別的主要方法。

3.4 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是伴隨人類基因組計(jì)劃的實(shí)施而發(fā)展起來的，它以高通量、高靈敏度、高特異、微型化和平行化的特點(diǎn)，被逐漸用于病毒的基因分型，其原理是把病毒分型探針固定在基片上制成芯片，與PCR產(chǎn)物雜交，觀察信號(hào)強(qiáng)弱進(jìn)行分型?；蛐酒夹g(shù)操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)樣本量大，它的運(yùn)用將大大提高腺病毒分型效率[33-34]。

綜上所述，腺病毒所致的疾病譜較廣，不僅可以引起呼吸道疾病和腸道疾病，還可引起全身其他系統(tǒng)的疾病，這與其型別有密切關(guān)系。近來，由于重組變異產(chǎn)生了許多新型腺病毒并且導(dǎo)致混合感染的增多，因此需要快速準(zhǔn)確的分型檢測(cè)方法。與病毒分離和免疫學(xué)方法相比，分子生物學(xué)方法具有快速、高靈敏度、高特異性的優(yōu)勢(shì)，被廣泛用于腺病毒的分型檢測(cè)。以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的基因測(cè)序和基因芯片技術(shù)具有高通量的特點(diǎn)，可以快速準(zhǔn)確地檢測(cè)大量樣本，在腺病毒疫情暴發(fā)后可為疾病治療爭(zhēng)取時(shí)間，提高應(yīng)對(duì)突發(fā)疫情的能力，也可指導(dǎo)臨床診斷及監(jiān)測(cè)預(yù)后。

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Research Progress of Adenovirus and its Classification Methods

CHEN Xiao-Fei1,2,LIU Qi-Qi2*,ZHOU Wei1*,ZHANG Wu-Xing1,LI Ying1
1.309thHospital of PLA,Beijing 100091;2.Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850;China

Human adenovirus is the main pathogen of the acute respiratory infection in infant,and it also can in?fect other systems.It is difficult to diagnose the disease according to the clinical maifestation,because it is simi?lar with other pathogenic microorganism in clinical manifestations.Thus,we need laboratory diagnosis.The sero?type is decided by hypervariable region specific antigen of molecular structure.Different serotype have different pathogenic spectrum,so the adenovirus serotyping detection is particularly important.In this paper,we summarized the molecular structure and detection of adenovirus serotyping methods.

human adenovirus;molecular structure;serotyping methods

R373

A

1009-0002（2017）05-0700-04

10.3969/j.issn.1009-

*Co-corresponding authors,ZHOU Wei,E-mail:cxiaofei0805@163.com;LIU Qi-Qi,E-mail:shuixiyinhexl@sina.com

2017-01-12

重大新藥創(chuàng)制科技重大專項(xiàng)（2015ZX09J15105-001-001）

陳曉飛（1988- ），女，碩士，（E-mail）1191040061@qq.com

周偉，（E-mail）cxiaofei0805@163.com；劉琪琦，（E-mail）shuixiyinhexl@sina.com