白俊其，黃志海，黃 娟，宮 璐，肖水明，李西文，徐 江＊＊，丘小惠＊＊

（1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院/廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院/中國中醫(yī)科學(xué)院廣東分院 廣州 510006；2. 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京 100700）

根莖類中藥精準(zhǔn)煮散飲片探索實例—制何首烏＊

白俊其1，黃志海1，黃 娟1，宮 璐1，肖水明2，李西文2，徐 江2＊＊，丘小惠1＊＊

（1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院/廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院/中國中醫(yī)科學(xué)院廣東分院 廣州 510006；2. 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京 100700）

目的：本文對制何首烏精準(zhǔn)煮散飲片用藥形式進(jìn)行探索研究。方法：比較制何首烏飲片及煮散飲片的出膏率；比較3批制何首烏飲片及采用相同飲片制備的煮散飲片質(zhì)量的均一性，并對其化學(xué)指紋圖譜進(jìn)行相似度評價，采用相對峰面積比較共有峰含量和質(zhì)量均一性。應(yīng)用ITS2序列作為DNA條形碼對何首烏原藥進(jìn)行鑒定。結(jié)果：制何首烏精準(zhǔn)煮散飲片出膏率為原飲片的2.5倍；3批原飲片煎煮液二苯乙烯苷平均含量為3.56±2.61 g·mg-1，RSD為73.28%，煮散飲片煎煮液二苯乙烯苷平均含量為13.23±0.37 g·mg-1，RSD為2.82%；煮散飲片與原飲片的指紋圖譜相似度基本一致，但煮散飲片各共有峰的含量、均一性明顯提高。ITS2序列對何首烏藥材可實現(xiàn)準(zhǔn)確鑒定。結(jié)論：制何首烏煮散飲片顯著提高煎煮率及質(zhì)量均一性，可節(jié)約資源，提高臨床療效。

制何首烏 精準(zhǔn)煮散飲片 煎出率 均一性

何首烏為蓼科植物何首烏Fallopia multiflora（Thunb.）Harald的干燥塊根，始載于《開寶本草》，其生品具有解毒、消癰、潤腸通便之功效，炮制品（制何首烏）具有補肝腎、益精血、烏須發(fā)、強筋骨的功效[1]。種質(zhì)種源、種植方法、采收加工、炮制工藝等因素均可能使制何首烏飲片的質(zhì)量參差不齊[2]，飲片質(zhì)量的不均一，極大地影響其臨床應(yīng)用的療效及穩(wěn)定性，也無法獲取可靠的臨床數(shù)據(jù)。

中藥煮散是傳統(tǒng)中藥的藥用形式，是將中藥粉碎成一定粒度與水共煎，去渣取汁制成的中藥液體制劑。通過將藥材粉碎，制成煮散，有利于提高藥材生物利用度，提高中藥均一性，減少藥材使用量，具有省材、省時之特點[3-5]。但是，由于在粉碎加工過程中破壞了藥材原有形態(tài)，喪失了部分品質(zhì)鑒別的性狀特征，導(dǎo)致“辨藥之難”，阻礙了應(yīng)用與監(jiān)管，后逐步被中藥飲片所取代[6，7]。

隨著中藥質(zhì)量控制技術(shù)的不斷發(fā)展，多種技術(shù)的應(yīng)用可有效解決傳統(tǒng)煮散的 “辨藥之難”問題，實現(xiàn)煮散飲片的精準(zhǔn)化鑒定與檢測?！熬珳?zhǔn)煮散飲片”的概念與思路方法[8]是基于傳統(tǒng)中藥煮散用藥方式，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化工藝將中藥飲片的形狀規(guī)格微小化、均勻化處理，可使飲片批量規(guī)模穩(wěn)定化，批內(nèi)質(zhì)量均一化，實現(xiàn)準(zhǔn)確、高效的自動化分裝、調(diào)劑、煎煮流程，提高臨床湯劑用藥的精準(zhǔn)性。本研究對根莖類中藥制何首烏精準(zhǔn)煮散飲片推廣應(yīng)用的合理性及優(yōu)越性進(jìn)行研究。

1 實驗材料

1.1 主要儀器及試劑

美國Waters 2695型高效液相色譜儀系統(tǒng)、W2998 DAD檢測器、Empower 色譜工作站（美國Waters公司）；BT 125D型十萬分之一分析天平（瑞士METTLER-TOLEDO公司）；Centrifuge 5430R高速臺式冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；中藥材粉碎機（臺灣榮聰鐵工廠）；2720 Thermal Cycler PCR儀（美國Applied Biosystems）；DYY-8C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；JY04S-3C型凝膠成像分析系統(tǒng)（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；MX-RL-E型混合儀（大龍興創(chuàng)儀器有限公司）；DP305植物基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；DL 2000 DNA Marker（日本TaKaRa公司）；Glodview（上海賽百盛基因技術(shù)有限公司）；Tris-HCl（上海麥克林生化科技有限公司，生產(chǎn)批號：T818979）；Tris（美國 Sigma公司，生產(chǎn)批號：M6250、V900483）；β-巰基乙醇、瓊脂（美國 Sigma公司，生產(chǎn)批號：V900500）；引物由上海美吉生物科技有限公司合成；2×Taq PCR Mix酶（北京艾德萊生物科技有限公司）；乙腈、甲酸均為色譜純（美國Fisher公司）；超純水由Millipore制得。

圖1 制何首烏飲片形態(tài)圖

1.2 受試藥物

二苯乙烯苷（含量≥98%，上海源葉生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：B20185）；何首烏（產(chǎn)地：德慶，生產(chǎn)批號：160301301、20160801；產(chǎn)地：高州，批號：20160817），制何首烏由本實驗室按照現(xiàn)行版《中國藥典》（一部）制何首烏項下方法和前期研究結(jié)果[9]自行炮制。

2 實驗方法

2.1 原飲片與煮散飲片出膏率比較

制何首烏煮散飲片制備方法如下：取制何首烏飲片（生產(chǎn)批號：160301301），粉碎后過篩，得到5-10目（2-4 mm）、10-24目（0.8-2 mm）、24-65目（0.25-0.8 mm）等不同粒徑范圍的煮散飲片。

稱取原飲片及不同粒徑范圍煮散飲片各100 g，采用標(biāo)準(zhǔn)湯劑煎煮法[10]進(jìn)行提取。分別加7倍量水，浸泡30 min，煮沸后保持30 min，過濾，濾渣再加6倍量水煎煮30 min。合并濾液，減壓濃縮至100 mL，即為相當(dāng)于制何首烏飲片1 g·mL-1的藥液。精密量取25 mL溶液，蒸干，得干浸膏重量，計算出膏率。

2.2 原飲片與煮散飲片均一性比較

分別取3個批次制何首烏飲片各200 g，充分混合后，粉碎，用10目、65目篩網(wǎng)過篩，即得10-65目粒徑范圍制何首烏煮散飲片（圖1）。不同批次原飲片各取50 g（S1：批號160301301，S2：批號20160801，S3：批號20160817）；取制何首烏煮散飲片，均勻攤平，畫格分為9份，隨機選取3份（S4-S6），從每份中分別稱取50 g。

上述6份樣品分別按標(biāo)準(zhǔn)湯劑煎煮法進(jìn)行提取。合并提取液，定容至500 mL，即相當(dāng)于飲片0.1 g·mL-1的藥液。精密量取藥液并用水稀釋5倍，采用0.22 μm濾膜過濾，取10 μL進(jìn)樣。

2.3 指紋圖譜檢測方法

2.3.1 色譜條件的建立

色譜柱：Welch ODS-C18柱（5 μm，250×4.6 mm）；流動相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（5%→65%）；流速：1 mL·min-1，檢測波長：280 nm；柱溫：25 ℃；洗脫時間：30 min；進(jìn)樣體積：10 μL。

2.3.2 對照品溶液的制備

精密稱取二苯乙烯苷對照品適量，加甲醇配制成含二苯乙烯苷1 mg·mL-1的對照品溶液，依次稀釋成12.5、25、50、100、200及400 μg·mL-1系列對照品溶液，采用0.22 μm濾膜過濾，備用。

2.3.3 供試品溶液的制備

精密量取適量飲片提取液，用水稀釋成相當(dāng)于制何首烏飲片0.02 g·mL-1的樣品供試品溶液，采用0.22 μm濾膜過濾，備用。

2.3.4 線性關(guān)系考察

按照“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析。以對照品峰面積（Y）對濃度（X）進(jìn)行線性回歸，計算回歸方程，考察二苯乙烯苷在上述色譜條件下的線性關(guān)系。

2.4 DNA 條形碼鑒定

選取何首烏飲片樣本約40 mg，用液氮進(jìn)一步磨碎，改良的CTAB法提取何首烏基因組總DNA。ITS2序列擴增采用正向引物ITS2 F：5′-ATGCGATACTTGG TGTGAAT-3′，反向引物：ITS3 R： 5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′，進(jìn)行擴增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括2×Taq PCR Mix酶12.5 μL，正向、反向引物各1 μL（2.5 μmol·L-1），模板DNA 2.0 μL（約30-100 ng），加ddH2O補足至25 μL。擴增程序：94℃變性5 min；94℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s（40個循環(huán)）；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物采用1.2 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，將電泳條帶清晰、明亮、單一的PCR產(chǎn)物送測序公司進(jìn)行雙向測序[10]。

2.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較時，采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

HPLC圖譜采用國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2004 A版），生成指紋圖譜共有模式，計算樣品的相似度。標(biāo)定共有峰，以二苯乙烯苷為參照峰，計算共有峰的相對保留時間與相對峰面積。

所得序列采用CodonCode Alinger 6.02軟件進(jìn)行校對拼接，去除低質(zhì)量區(qū)并采用基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法去除兩端5.8S和28S區(qū)段，獲得完整的ITS2序列。利用軟件MEGA 6.06分析比對，分析ITS2序列特點。以條形碼附加二維碼的方式展示主導(dǎo)單倍型序列特征，左側(cè)部分為DNA序列轉(zhuǎn)換的彩色條形碼圖片，右側(cè)二維碼圖片為QRcode的編碼方式進(jìn)行編碼，掃描可讀取序列信息[11，12]。

3 實驗結(jié)果

3.1 原飲片與煮散飲片出膏率比較

出膏率考察結(jié)果表明，與原飲片比較，制何首烏不同粒徑煮散飲片的出膏率均大幅度提高，為原飲片的2.5倍以上，具有顯著性差異；但不同粒徑煮散飲片間出膏率無顯著性差異，本實驗選10-65目為精準(zhǔn)煮散飲片，具體結(jié)果見表1。

3.2 色譜條件考察

將對照品溶液及供試品溶液按“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣，發(fā)現(xiàn)該色譜條件下二苯乙烯苷分離度良好，對照品及提取液色譜圖見圖2。以對照品峰面積（Y）對濃度（X）進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：二苯乙烯苷（280 nm），Y=12 173X-68 128（R2= 0.999 9），表明二苯乙烯苷在12.5-400 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.2 飲片均一性評價

以二苯乙烯苷為考察指標(biāo)，測定其在原飲片及煮散飲片中的含量，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，混合制成煮散飲片后指標(biāo)成分煎出率明顯提高，達(dá)3.7倍，結(jié)果有顯著性差異（P＜0.05）；其含量均值的RSD值也明顯減小，表明飲片質(zhì)量及飲片均一性均有所提高。

表1 制何首烏原飲片與精準(zhǔn)煮散飲片出膏率（n=3）

圖2 二苯乙烯苷對照品（A）和制何首烏水提液（B）色譜圖

表2 原飲片與精準(zhǔn)煮散飲片提取液中二苯乙烯苷含量（n=3）

表3 制何首烏指紋圖譜相似度評價結(jié)果

3.3 指紋圖譜研究

3.3.1 指紋圖譜及相似度評價

按照“2.3.1”項下方法，對制何首烏飲片水提液進(jìn)行指紋圖譜的測定，結(jié)果見圖3。以制何首烏原飲片為參照譜，進(jìn)行自動匹配并計算指紋圖譜相似度，結(jié)果見表3。原飲片相似度在0.784以上，而精準(zhǔn)煮散飲片相似度較高，均達(dá)到0.935以上，進(jìn)一步表明制何首烏精準(zhǔn)煮散飲片均一性明顯提高。

3.3.2 指紋圖譜共有峰的標(biāo)定

本研究以何首烏原飲片中二苯乙烯苷（tR= 16.894 min）的平均峰面積為參考峰，計算制得精準(zhǔn)煮散飲片與原飲片各共有峰的相對峰面積（表4）。結(jié)果表明，煮散飲片與原飲片比較，6個共有峰相對峰面積均明顯升高，均一性也明顯提高，進(jìn)一步說明制何首烏精準(zhǔn)煮散飲片能提高有效成分的浸出率。

3.4 ITS2序列分析

應(yīng)用MEGA6.06分析何首烏3條ITS2序列特征，有1個變異位點，為88位點的G-A變異。何首烏序列比對后長度均為193 bp，典型序列特征見圖4。BLAST搜索結(jié)果顯示，各樣品相似性最高的為何首烏Fallopia multiflora，與其最相似序列的相似度為100%。

圖3 原飲片及精準(zhǔn)煮散飲片HPLC指紋圖譜

圖4 何首烏ITS2主導(dǎo)單倍型序列

4 討論

本研究采用標(biāo)準(zhǔn)湯劑煎煮法[13]提取，水煎液中大黃素及大黃素甲醚含量極低。因此，本實驗僅以二苯乙烯苷作為考察指標(biāo)成分。

對制何首烏進(jìn)行的DNA擴增結(jié)果顯示為陰性，究其原因，制何首烏經(jīng)高溫長時間炮制而成，在炮制過程中往往導(dǎo)致DNA的嚴(yán)重降解，致使無法擴增出相應(yīng)片段。但是，有研究報道[14]制何首烏可以擴增出ITS2片段，這可能與何首烏的炮制工藝參數(shù)有關(guān)，炮制的時間和方法不同，導(dǎo)致DNA降解的程度不同而最終影響到擴增結(jié)果。因此，對于制何首烏的DNA條形碼是否與其炮制程度相關(guān)，有必要進(jìn)一步研究。同時，何首烏藥材品種來源單一[1]，且制何首烏煮散飲片仍保留了飲片原有的外觀色澤、氣味等鑒別性狀，結(jié)合指紋圖譜等檢測技術(shù)，即可實現(xiàn)對其質(zhì)量有效控制的目的。

何首烏為根莖類飲片，粉性足者為佳，雖經(jīng)高溫炮制烘干后質(zhì)地堅硬，但破碎時仍易產(chǎn)生大量細(xì)粉，細(xì)粉摻雜在精準(zhǔn)煮散飲片中易導(dǎo)致糊化，篩去細(xì)粉導(dǎo)致生產(chǎn)制何首烏精準(zhǔn)煮散飲片的得率降低，所以制何首烏破碎時需用剪切式粉碎儀，將制何首烏切割成大小不等的顆粒狀飲片即可。

表4 共有峰相對峰面積比較（±s，n= 3）

表4 共有峰相對峰面積比較（±s，n= 3）

峰號保留時間/min原飲片平均相對峰面積精準(zhǔn)煮散飲片平均相對峰面積1 7.896 0 0.58±0.25 0.96±0.06 2 10.608 1.36±0.09 1.41±0.03 3 14.040 0.08±0.03 0.16±0.01 4 16.672 0.19±0.05 0.23±0.01 5 16.984 1.00±0.73 3.72±0.03 6 24.748 0.11±1.10 0.13±0.01

制何首烏煮散飲片較原飲片的藥物成分煎出率、質(zhì)量均一性均顯著提高，這應(yīng)該與飲片自身質(zhì)地及形制、規(guī)格有關(guān)。從有效節(jié)約中藥資源，提高臨床療效等方面考慮，制何首烏煮散飲片的推廣應(yīng)用，無疑是一種有益的嘗試。

1 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(一部). 北京：中國醫(yī)藥科技出版社, 2015：76.

2 劉振麗, 宋志前.不同地區(qū)制何首烏中二苯乙烯苷含量測定及穩(wěn)定性考察. 中成藥,2002,24(9)：684-685.

3 唐安玲, 宋英, 李圓圓等. 續(xù)斷煮散顆粒煎煮工藝正交試驗與溶出曲線的研究. 中成藥,2015,37(2)：430-433.

4 劉偉玲. 黃柏煮散顆粒制備工藝研究. 中國執(zhí)業(yè)藥師, 2015,12 (7)：20-23.

5 李文. 金銀花煮散顆粒的藥學(xué)研究. 瀘州：瀘州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文, 2012.

6 徐海波. 中藥煮散源流考. 河北中醫(yī)藥學(xué)報, 1999,14(4)：11-13.

7 穆蘭澄, 曹京梅. 中藥煮散的歷史沿革與現(xiàn)代研究概述. 中國實驗方劑學(xué)雜志,2008,14(7)：74-75.

8 陳士林,黃志海,丘小惠,等. 中藥精準(zhǔn)煮散飲片. 世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2016, 18(9)：1430-1440.

9 丘小惠,宋艷剛,孫景波,等. 不同炮制工藝制首烏對大鼠血虛模型的作用研究. 中藥材, 2008, 31(1)：14-17.

10 辛天怡,雷美艷,宋經(jīng)元. 中藥材DNA條形碼鑒定研究進(jìn)展. 中國現(xiàn)代中藥, 2015, 17(2)：170-176.

11 辛天怡,李西文,姚輝,等. 中藥材二維DNA條形碼流通監(jiān)管體系研究. 中國科學(xué)：生命科學(xué), 2015, 45(7)：695-702.

12 陳士林,宋經(jīng)元. 本草基因組學(xué). 中國中藥雜志,2016, 40(21)：3881-3889.

13 陳士林,劉安,李琦,等. 中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究策略. 中國中藥雜志, 2016,40(8)：1367-1375.

14 黎潔文. 基于ITS2序列分析的何首烏PCR-RFLP和AS-PCR的分子鑒別研究. 廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)碩士學(xué)位論文, 2015.

Comparison of Precise Powder Decoction Pieces and Original Traditional Chinese Medical Slices of Rhizomatic——A Case Study on Fallopia multiflora Radix Preparata

Bai Junqi1, Huang Zhihai1, Huang Juan1, Gong Lu1, Xiao Shuiming2, Li Xiwen2, Xu Jiang2, Qiu Xiaohui1
(1. The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine / Guangdong Provincial Academy of Chinese Medical Sciences / China Academy of Chinese Medical Sciences Guangdong Branch / Guangzhou 510006, China; 2. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China)

This study aimed at investigating the drug preparation of precise powder decoction pieces (PPDP) system，F(xiàn)allopia multifloraradix preparata (FMRP) was employed in this study. Different specifications of PPDP were prepared， their extract rates were in contrast with the original pieces. Compared the quality uniformity of three batches between FMRP original slices and its PPDP extraction， the similarity of the chemical fingerprints was evaluated， and the contents of common peaks and quality uniformity were compared by relative peak areas. ITS2 sequence was taken as a DNA barcode to identifyF. multifloraradix (FMR). As a result， the extract rate of PPDP was 2.5 times as much as the original slices. The average content of stilbene glucoside from the three original slices and the PPDP extraction were 3.56±2.61 and 13.23±0.37 mg·g-1， respectively； while the RSD were 73.28% and 2.82%. The similarity of the fingerprints of the PPDP extraction was almost the same as that of the original slices， but the content and the uniformity of the common peaks of the PPDP extraction were significantly improved. Thus， FMR was accurately identified using ITS2 sequences. It was concluded that the PPDP considerably improve the decocting rate and quality uniformity， indicating that PPDP could save resources and improve the clinical efficacy.

Fallopia multifloraradix preparata， precise powder decoction pieces， decocting rate， uniformity

10.11842/wst.2017.01.014

R283.3

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-12-23

修回日期：2017-01-05

＊ 國家發(fā)展改革委、中醫(yī)藥管理局中藥標(biāo)準(zhǔn)化項目（ZYBZH-Y-SH-38）子課題：制首烏飲片標(biāo)準(zhǔn)研究，負(fù)責(zé)人：丘小惠；廣東省中醫(yī)院專項(2015KT1817)：嶺南中草藥DNA條形碼分子鑒定和生態(tài)適宜性研究，負(fù)責(zé)人：黃志海；中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥健康服務(wù)專項（ZZ0908067）：200種嶺南中草藥DNA條形碼研究，負(fù)責(zé)人：黃志海。

＊＊ 通訊作者：徐江，博士，助理研究員，主要研究方向：中藥分子生物學(xué)研究；丘小惠，碩士，研究員，主要研究方向：中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究。