夏 琨 王瑞耕 劉 玲 孫東明

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院,武漢430016)

KD患兒Th17/Treg細(xì)胞失衡和單核細(xì)胞趨化蛋白1的關(guān)系研究

夏 琨 王瑞耕 劉 玲 孫東明

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院,武漢430016)

目的：探討川崎病(KD)患兒外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Treg)/輔助性T 細(xì)胞17(Th17)與單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)的關(guān)系及其在KD發(fā)病中的作用機(jī)制。方法：2014年6月至2015年6月選取本院收治的48例KD患兒(恢復(fù)期 28例，急性期20例)為研究對(duì)象，另選取40例健康體檢兒童為對(duì)照組，采用ELISA法測(cè)定兩組血清中白細(xì)胞介素-15,17,23(IL-15,17,23)及MCP-1水平，采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定兩組外周血Treg/Th17細(xì)胞比例。結(jié)果：KD組患兒血清IL-15、IL-17、IL-23及MCP-1水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且急性期KD患兒血清IL-15、IL-17、IL-23及MCP-1水平高于穩(wěn)定期組。 KD組患兒Treg細(xì)胞、Treg/Th17、Th17顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，急性期KD患兒Treg細(xì)胞、Treg/Th17水平、Th17高于穩(wěn)定期(P<0.05)。經(jīng)Pearson單因素分析，IL-15、IL-17、IL-23及MCP-1與Treg/Th17呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論：Treg與Th17細(xì)胞間的失衡及MCP-1水平在KD患兒體內(nèi)持續(xù)升高可能與KD病情發(fā)病及進(jìn)展有密切的關(guān)系，通過測(cè)定KD患兒Treg/Th17細(xì)胞比例及MCP-1對(duì)評(píng)估患兒病情及預(yù)后具有一定的指導(dǎo)意義。

川崎??；Treg細(xì)胞；單核細(xì)胞趨化蛋白1

川崎病(Kawasaki disease，KD)是兒科常見的急性發(fā)熱性出診性疾病之一，患兒病理特征為中小動(dòng)脈免疫性血管炎合并冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張、心肌梗死及猝死[1]。KD患兒急性期超抗原激活自身免疫反應(yīng)導(dǎo)致大量炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子釋放至血液中可導(dǎo)致小血管內(nèi)皮壞死，進(jìn)而引起患兒各種并發(fā)癥[2]。目前關(guān)于KD發(fā)病機(jī)制尚不明確，但有目前普遍認(rèn)為Treg/Th17細(xì)胞失衡與KD的發(fā)生有密切的關(guān)系[3]。近年有研究指出單核細(xì)胞趨化蛋白1(Monocyte chemotactic protein，MCP-1)具有調(diào)節(jié)單個(gè)核細(xì)胞黏附及進(jìn)入動(dòng)脈壁的雙重功能[4]。因此，本研究將探討KD患兒外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)與MCP-1的關(guān)系及其在KD發(fā)病中的作用機(jī)制，旨在為KD臨床防治提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2014年6月至2015年6月選取本院收治的48例KD患兒為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患兒均符合日本川崎病中心2002年修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)均簽署知情同意書。排除臨床感染性發(fā)熱、心血管疾病、血液腫瘤疾病患兒。其中男 26例，女22例，年齡1個(gè)月～8歲，平均年齡(3.25±0.89)歲，其中恢復(fù)期 28例，急性期20例。另選取40例健康體檢兒童為對(duì)照組，其中男 22例，女18例，年齡6個(gè)月～9歲，平均(3.69±1.12)歲，兩組患兒性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

(1)KD患兒于入院次日清晨抽取靜脈血3 ml，離心處理后留取上清液，對(duì)照組于檢查當(dāng)天抽取靜脈3 ml,離心處理后留取上清液，并采用ELISA法測(cè)定兩組IL-15、IL-17、IL-23及MCP-1水平，IL-15試劑盒由上海拜力生物科技有限公司提供，IL-17試劑盒由上海圻明生物科技有限公司提供，IL-23試劑盒由上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供，MCP-1試劑盒由上海盈公生物技術(shù)有限公司提供，操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。(2)Treg/Th17細(xì)胞測(cè)定：采用流式細(xì)胞儀測(cè)定外周血CD4+Th17、Th17/Treg 、CD4+CD25+Treg比率。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血IL-15、IL-17、IL-23及MCP-1水平對(duì)比 KD組患兒血清IL-15、IL-17、IL-23及MCP-1水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且急性期KD患兒血清IL-15、IL-17、IL-23及MCP-1水平高于穩(wěn)定期組，見表1。

2.2 兩組外周血Treg/Th17水平對(duì)比 KD組患兒Treg細(xì)胞、Treg/Th17、Th17顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。急性期KD患兒Treg細(xì)胞、Treg/Th17水平、Th17高于穩(wěn)定期(P<0.05)，見表2，圖1、2。

2.3 MCP-1與外周血Treg/Th17細(xì)胞比例的關(guān)系研究 經(jīng)Pearson單因素分析，IL-15、IL-17、IL-23及MCP-1與Treg/Th17成負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見表3。

GroupsnIL-15IL-17IL-23MCP-1KDchildren Acutephasegroup2028.63±4.891)2)30.45±5.621)2)28.25±6.321)2)412.36±42.421)2) Stablephasegroup2817.98±5.361)24.58±6.321)20.78±5.361)202.36±8.691)Normalcontrolgroup4012.02±3.4820.12±5.6917.47±4.2245.36±20.12Fvalue22.36225.25630.25224.522Pvalue0.0000.0000.0000.000

Note：Compared with the stable phase group,1)P<0.05;compared with the normal control group,2)P<0.05.

GroupsnTh17cell(%)Tregcell(%)Th17/Treg(%)KDchildren Acutephasegroup206.96±1.021)2)5.36±0.861)2)1.48±0.261)2) Stablephasegroup283.32±0.861)4.78±0.721)0.82±0.321)Normalcontrolgroup401.82±0.120.55±0.140.45±0.11Fvalue9.1237.8236.452Pvalue0.0000.0000.000

Note：Compared with the stable phase group,1)P<0.05;compared with the normal control group,2)P<0.05.

圖1 患兒Th17細(xì)胞流式散點(diǎn)圖Fig.1 KD children Th17 cells flow scatterplotNote: A.Normal control group；B.KD children with stable phase；C.KD acute phase.

圖2 患兒Treg細(xì)胞流式散點(diǎn)圖Fig.2 KD children Treg cells flow scatterplotNote: A.Normal control group；B.KD children with stable phase；C.KD acute phase.

表3 MCP-1與外周血Treg/Th17細(xì)胞比例的關(guān)系研究

Tab.3 Relationship between MCP-1 and peripheral Treg/Th17 cells in proportion

CellsIL-15IL-17IL-23MCP-1Th17cell0.11000.00180.12300.1450Tregcell0.11900.12500.13600.1480Th17/Treg0.32501)0.33801)0.31401)0.33601)

Note：1)P<0.05.

3 討論

KD是兒童常見的免疫相關(guān)性血管炎癥綜合征，近年研究指出，KD患兒普遍存在冠狀內(nèi)皮功能異常并持續(xù)存在且呈彌散性分布的情況，而炎癥性血管疾病是由受感染血管壁細(xì)胞與免疫細(xì)胞相互作用并維持的，因此選擇靈敏度及特異度較高的血管炎癥標(biāo)準(zhǔn)物將有助于對(duì)KD患兒早期診斷、預(yù)后及監(jiān)測(cè)[5]。Guo等[6]對(duì)KD患兒冠狀動(dòng)脈進(jìn)行病理檢查發(fā)現(xiàn)血管中存在大量單核細(xì)胞浸潤。盧紅飛等[7]研究也指出，單核細(xì)胞在KD發(fā)病及病情進(jìn)展中起到重要的作用。MCP-1屬于趨化因子中的一員，具有趨化單個(gè)核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞的功能。本研究結(jié)果顯示，KD組患兒血清MCP-1水平顯著高于對(duì)照組，且急性期KD患兒血清MCP-1水平高于穩(wěn)定期組，對(duì)這種現(xiàn)象的解析是MCP-1參與了KD冠狀動(dòng)脈患者發(fā)病過程，并在體內(nèi)持續(xù)較長的時(shí)間，并在KD患兒體內(nèi)強(qiáng)烈表達(dá)，從而導(dǎo)致KD患兒急性期患兒血清中MCP-1水平較高[8]。

目前認(rèn)為T淋巴細(xì)胞免疫功能紊亂與KD的發(fā)生及病情進(jìn)展有密切的關(guān)系，免疫系統(tǒng)高度活化及免疫損傷性血管炎是KD的兩大免疫特征，由此可以推測(cè)免疫功能紊亂在KD發(fā)生及進(jìn)展中扮演重要的角色[9]。Treg細(xì)胞屬于免疫調(diào)節(jié)功能T細(xì)胞亞群，主要表達(dá)細(xì)胞表面分子CD4+CD5+，其主要作用為抑制機(jī)體病理性免疫反應(yīng)，介導(dǎo)自身免疫反應(yīng)，從而維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性及免疫系統(tǒng)功能[10]。本研究結(jié)果顯示，KD患兒外周血腫Treg水平顯著低于對(duì)照組，且急性KD患兒顯著低于恢復(fù)期，結(jié)果與既往研究一致，進(jìn)一步表明Treg細(xì)胞在KD患兒中存在異常，導(dǎo)致對(duì)感染引起的效應(yīng)性促炎癥因子激活、T細(xì)胞活化及非特異性免疫性應(yīng)答增強(qiáng)等免疫活化反應(yīng)受到抑制，從而導(dǎo)致機(jī)體各系統(tǒng)尤其是血管系統(tǒng)損傷。

Th17是近年新發(fā)現(xiàn)的新型CD4+T細(xì)胞亞型。Th17細(xì)胞及其分泌的炎癥相關(guān)因子如IL-15、IL-17、IL-23可參與機(jī)體炎癥反應(yīng)，并對(duì)多種免疫性疾病具有促進(jìn)作用[11]。國外研究指出，在炎癥行疾病患者體內(nèi)血清IL-15、IL-17、IL-23顯著高于正常人群[12]，在支氣管哮喘小鼠模型中從肺臟組織及呼吸道灌液中明顯可以檢測(cè)Th17細(xì)胞及其炎癥相關(guān)細(xì)胞水平顯著升高。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KD患兒外周血腫Th17水平顯著高于對(duì)照組，急性期KD患兒血清Th17水平顯著高于穩(wěn)定期，這提示KD患兒體內(nèi)Th17水平升高可能與其KD患兒病情發(fā)生及進(jìn)展有密切的關(guān)系。經(jīng)Pearson單因素分析，IL-15、IL-17、IL-23及MCP-1與Treg/Th17成負(fù)相關(guān)(P<0.05)，提示KD的發(fā)生除了與患兒自身免疫系統(tǒng)功能異常有關(guān)外，還可能與單核趨化細(xì)胞分泌異常有密切的關(guān)系，KD的發(fā)生不是單因素引起的，可能是由多個(gè)危險(xiǎn)因素相互作用相互影響引起的，這在日后還需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

綜上所述，Treg與Th17細(xì)胞間的失衡及MCP-1水平在KD患兒體內(nèi)持續(xù)升高可能與KD病情發(fā)病及進(jìn)展有密切的關(guān)系，通過測(cè)定KD患兒Treg/Th17細(xì)胞比例及MCP-1對(duì)評(píng)估患兒病情及預(yù)后具有一定的指導(dǎo)意義。

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[收稿2016-04-11 修回2017-02-03]

(編輯 張曉舟)

Relationship between Th17/Treg cells and monocyte chemoattractant protein-1 in KD children

XIAKun,WANGRui-Geng,LIULing,SUNDong-Ming.

WuhanChidren′sHospital，TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScience&Technology,Wuhan430016,China

Objective:To investigate the relationship between CD4+CD25+regulatory T cells (Treg) and monocyte chemoattractant protein-1 and its mechanism in KD pathogenesis.Methods: 48 patients of KD (28 cases of recovery,20 cases of acute phase) were admitted from June 2014 to June 2015 and the other 40 cases of healthy children was admitted to control group.The levels of serum interleukin-15,17,23 (IL-15,17,23) and MCP-1 of two groups were measured with ELISA.The levels of Treg/Th17 cell ratio of two groups were measured with flow cytometry.Results: The levels of IL-15,IL-17,IL-23 and MCP-1 of KD group were higher than control groups(P<0.05) and the levels of IL-15,IL-17,IL-23 and MCP-1 of acute phase groups were higher than recovery groups.The levels of Th17,Treg cells,Th17/Treg of KD group were lower than the control group (P<0.05),while the levels of Th17,Treg cells,Th17/Treg cells in the acute phase of KD patients were higher than stable phase.The levels of IL-15,IL-17,IL-23 and MCP-1 and Treg/Th17 were negative correlation with univariate analysis by Pearson(P<0.05).Conclusion: The imbalance between Treg and Th17 cells and MCP-1 levels continue to rise may be associated with KD onset and progress of the disease is closely related to children in KD vivo by measuring children with KD Treg/Th17 cells and MCP-1 ratio of assessment Children with the condition and prognosis has some significance.

Kawasaki disease;Treg cells;Monocyte chemoattractant protein-1

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.024

夏 琨(1977年-)，女，主治醫(yī)師，主要從事兒童心血管疾病方面的研究。

及指導(dǎo)教師：孫東明(1971年-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事兒童心血管疾病方面的研究。

R725.9

A

1000-484X(2017)03-0429-04