宋明銘 王佳奇 黃寶亮 高銘彤 李婧毓 丁傳波 鄭毅男 劉文叢 徐曉華

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春130118)

精氨酸單糖苷(AF)對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能的影響①

宋明銘 王佳奇 黃寶亮 高銘彤 李婧毓 丁傳波 鄭毅男 劉文叢 徐曉華

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春130118)

目的：研究精氨酸單糖苷(Arginyl-fructose，AF)對(duì)環(huán)磷酰胺(CTX)誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠免疫功能的影響。方法： ICR小鼠100只，隨機(jī)分成5組，即正常對(duì)照組(N)，免疫抑制模型組(M)，免疫抑制AF低、中、高劑量組(M-L、M-M、M-H)。試驗(yàn)組連續(xù)給藥28 d。免疫抑制組，每周前3天，腹腔注射80 mg/kg環(huán)磷酰胺，形成免疫抑制。末次給藥12 h解剖后，測(cè)定免疫器官指數(shù)，AF對(duì)脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化及增殖、巨噬細(xì)胞吞噬功能、特異性IgG抗體、血清中TNF-α 、IL-2含量的影響。并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TNF-α 、IL-2 基因表達(dá)的差異。結(jié)果：AF能夠顯著提高小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的自然轉(zhuǎn)化與增殖，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能，顯著提高小鼠血清中特異性IgG抗體含量，可顯著提高小鼠血清中TNF-α、IL-2含量，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，TNF-α、IL-2 mRNA能夠良好表達(dá)。結(jié)論：AF能拮抗CTX免疫功能低下小鼠的免疫抑制作用。

精氨酸單糖苷；ICR小鼠；免疫；熒光定量PCR

精氨酸單糖苷(Arginyl-fructose，AF)，是鄭毅男等[1]首次從鮮參加工成紅參的過程中獲得，為美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物的非褐變部分，是精氨酸與葡萄糖羥醛脫水縮合的產(chǎn)物[2,3],分子量為337.3。AF純品為白色粉末，極易溶于水，不溶于甲醇等有機(jī)溶劑。實(shí)驗(yàn)研究表明，AF具有抗氧化[4,5]、抗腫瘤[6]、促進(jìn)微循環(huán)等功能[7]，而且具有抑制葡萄糖苷酶、抗糖尿病等作用[8]。

李敏珍等[9]報(bào)道，紅參類藥物有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能作用。Yool等[10]報(bào)道，紅參能夠平衡體內(nèi)免疫系統(tǒng)，調(diào)節(jié)免疫機(jī)能，抵抗疾病侵襲。AF在紅參中含量豐富，所以通過此次試驗(yàn)，探討AF是否在紅參的免疫活性中發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 儀器、材料、試劑 萬分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；LC-2010A高效液相色譜儀(日本島津公司)；熒光定量PCR儀電泳儀(北京六一)；MX3000 RT-PCR儀(美國(guó) Stratagene)；PCR儀(美國(guó)SBP公司)；瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)；TGL-20B高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；凝膠成像儀(美國(guó)BIORAD公司)；MK3型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Electron公司)。

IL-2和TNF-α試劑盒(美國(guó)R&D公司，長(zhǎng)春百金生物科技公司分裝)。高純總RNA快速提取試劑盒、2×Power Taq PCR Master Mix、Bio Take super RT Kit、2×SYBP Real-time PCR premixture(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)。

精氨酸單糖苷AF，自制，純度大于95%，臨用時(shí)用純凈水配制成低、中、高劑量所需濃度；4周齡ICR小鼠，SPF級(jí)(18～22 g)，購自吉林省億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與劑量 100只ICR小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成5組，每組20只，即正常對(duì)照組(N)，免疫抑制模型組(M)，免疫抑制 AF低劑量組(M-L，20 mg/kg)，免疫抑制AF中劑量組(M-M，40 mg/kg)，免疫抑制 AF 高劑量組(M-H，80 mg/kg)。各組每日按10 ml/kg體重給小鼠灌胃給藥，每天給藥1次，連續(xù)給藥28 d。M、M-L、M-M及M-H組，每周前3 d，腹腔注射環(huán)磷酰胺(CTX，80 mg/kg)，形成免疫抑制。

1.2.2 小鼠免疫器官臟器指數(shù)測(cè)定 末次給藥12 h后，眼球取血，離心機(jī)4 500 r/min分離血清，處理后的血清保存在-20℃冰箱，待用。將小鼠處死后進(jìn)行系統(tǒng)的解剖，取出脾臟和胸腺，用9%生理鹽水進(jìn)行漂洗，濾紙吸干后稱重，計(jì)算脾指數(shù)及胸腺指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器重量(g)× 100/體重(g)。

1.2.3 脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 給藥第21天后，每組隨機(jī)抽取10只小鼠，脫臼處死，置75%酒精中浸泡5 min,無菌取脾臟，加入RPMI1640，300目鋼網(wǎng)研磨，吸取脾細(xì)胞懸液于1.5 ml離心管中，離心10 min(1 500 r/min，4℃)，棄上清液。于上述離心管中加入ACK Lysis Buffer，再次離心10 min(1 500 r/min，4℃)，棄上清液。再加入RPMI1640，細(xì)胞計(jì)數(shù)，配成2×106ml-1脾細(xì)胞懸液。試驗(yàn)分為3組，第1組為對(duì)照組即脾淋巴自然轉(zhuǎn)化組；第2組加入ConA(5 μg/ml,100 μl)，刺激T細(xì)胞轉(zhuǎn)化；第3組加入LPS(10 μg/ml,100 μl)，刺激B細(xì)胞轉(zhuǎn)化。將各組細(xì)胞依次加到 96 孔板中，每孔加入100 μl脾細(xì)胞懸液，每孔設(shè)立3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)條件為：5%CO2培養(yǎng)箱，37℃，48 h。培養(yǎng)48 h后，每孔內(nèi)加入MTT(5 mg/ml)20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，離心(2 000 r/min，10 min)，吸取上清液，加入150 μl的DMSO充分溶解結(jié)晶，酶標(biāo)儀490nm條件下，測(cè)定各孔OD值。

1.2.4 體外脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) ICR小鼠，脫臼處死，取脾方法如1.2.3所述。試驗(yàn)分為空白組、陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組及AF加藥組(濃度分別為：1、2、4、6、8、10 μg/ml)。每組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，空白組加入培養(yǎng)基100 μl，其他組別加入細(xì)胞懸液100 μl于96孔板中。培養(yǎng)1 h后，于空白及陰性對(duì)照組各加入培養(yǎng)基100 μl，陽性對(duì)照組加入ConA(50 μg/ml，10 μl)，加藥組加入相應(yīng)濃度AF。培養(yǎng)條件與其余步驟，如1.2.3所述。

1.2.5 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的檢測(cè) ICR小鼠，脫臼處死，置75 %酒精中浸泡5 min，無菌條件下剪開腹部，使腹膜壁暴露，用75 %乙醇沖洗腹壁。之后無菌抽取1 ml消毒空氣及4 ml冷PBS注入腹腔，最后抽取腹腔懸液，離心2次(1 500 r/min 4℃，10 min)，每次離心后棄去上清液，用PBS洗滌。末次洗滌后，再加入RPMI1640，細(xì)胞計(jì)數(shù)，配成2×106ml-1脾細(xì)胞懸液。吸取100 μl細(xì)胞懸液于96孔板的各孔，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)(37℃、2 h)，貼壁細(xì)胞即為巨噬細(xì)胞，未貼壁用37℃PBS洗去。

試驗(yàn)設(shè)置AF加藥組(濃度分別為：1、2、4、6、8、10 μg/ml)與空白對(duì)照組。每組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，空白對(duì)照組加入培養(yǎng)基200 μl，其他分別加入不同濃度的AF 200 μl于96孔板中。5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)(37℃、24 h)，棄去上清液，用37℃ PBS 200 μl/孔洗3遍，加入0.075%中性紅溶液200 μl/孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min棄去上清液，用37℃ PBS 200 μl/孔洗3遍，每孔加200 μl細(xì)胞裂解液(1 mol/L醋酸∶無水乙醇=1∶1)培養(yǎng)1 h，540nm測(cè)其吸光度值。吞噬中性紅增加率(%)=(A給藥-A對(duì)照)/A對(duì)照×100%。

1.2.6 血清TNF-α、IL-2含量測(cè)定 取分裝好的小鼠血清，常溫解凍，嚴(yán)格按照ELISA說明書操作，點(diǎn)入96孔板，酶標(biāo)儀測(cè)定后，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

1.2.7 特異性IgG抗體的檢測(cè) 取分裝好的小鼠血清，常溫解凍，ELISA法測(cè)定小鼠特異性IgG抗體水平。

1.2.8 熒光定量RT-PCR測(cè)定

1.2.8.1 組織中RNA提取 ①取出各組小鼠保存在液氮中的脾臟組織，在DEPC水處理后的研缽中充分研磨至粉末狀。②1 ml Trizol于1.5 ml離心管中，再加入少許脾臟粉末，振蕩器充分混勻后，靜置5 min；③加200 μl氯仿于上述離心管中，蓋緊，用手顛倒混勻后，室溫放置10 min，12 000 r/min離心15 min 4℃；④吸出上清液于新的1.5 ml離心管中，加500 μl異丙醇，混勻，室溫靜置10 min后，12 000 r/min 4℃離心10 min，保留沉淀。⑤加75%冷乙醇1 ml于上述沉淀離心管中，充分洗滌沉淀，7 500 r/min 4℃離心5 min，棄上清；⑥室溫干燥RNA至半透明狀；⑦向離心管中加20 μl DNase/RNase-Free Deionized Water溶解沉淀，-80℃凍存。RNA提取圖，見圖1。

1.2.8.2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA TNF-α、IL-2的基因序列從數(shù)據(jù)庫NCBI獲得，參照查詢的基因序列使用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)TNF-α 、IL-2定量引物，反轉(zhuǎn)錄引物使用試劑盒中的隨機(jī)引物，熒光定量引物序列見表1。

按照東洋紡試劑盒說明書步驟，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)，得到cDNA產(chǎn)物，于-80℃保存。反轉(zhuǎn)錄加樣體系見表2。

1.2.8.3 實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng) 以GAPDH為內(nèi)參引物，采用熒光染料SYBR-GreenⅠ檢測(cè)TNF-α 、 IL-2在小鼠脾臟組織中相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5 min；95℃反應(yīng)10 s，60℃反應(yīng)30 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，記錄溶解曲線和擴(kuò)增曲線，每孔樣本的Ct值，使用2-ΔΔCt方法計(jì)算。反應(yīng)體系見表3。

圖1 RNA提取圖Fig.1 Picture of RNA extraction

表1 熒光定量引物序列

Tab.1 Sequences of fluorescence quantitative primers

SymbolSequence(5'-3')m-qPCR-TNF-α-F2CTTCTCATTCCTGCTTGTGGCm-qPCR-TNF-α-R2CTTGGTGGTTTGCTACGACGm-IL-2-F1ACCGATTTCTGGCTAGTGAGGm-IL-2-R1GCAGTTGTTTCTGTGGGTTGTm-GAPDH-FCGGCAAATTCAACGGCACAm-GAPDH-RCACCAGTAGACTCCACGACAT

2 結(jié)果

2.1 AF對(duì)小鼠免疫器官臟器指數(shù)的影響 與M組比較，N、M-L、M-M組胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，M-H組無明顯變化，見表4。

2.2 AF對(duì)脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響 從圖2可知，T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化刺激劑為ConA，與M組比較，M-L組具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，M-M組存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，M-H組與M組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的刺激劑為L(zhǎng)PS，與M組比較，M-L組具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，M-M組存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，M-H組與M組差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 AF對(duì)體外脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 不同濃度AF對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響，如圖3所示。隨著AF濃度的增加，脾淋巴細(xì)胞的增殖活性逐漸增強(qiáng)。與陰性對(duì)照組比較，AF濃度為6、8、10 μg/ml時(shí)，呈現(xiàn)極顯著性(P<0.01)。

2.4 AF對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 如表5所示，AF能顯著促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅。與對(duì)照組比較，AF濃度為6、8、10 μg/ml時(shí)，呈現(xiàn)極顯著性(P<0.01)。AF濃度為4 μg/ml時(shí)，存在顯著性(P<0.05)。

2.5 AF對(duì)小鼠血清中細(xì)胞因子TNF-α、IL-2的影響 如圖4所示，與M組比較，N組血清中TNF-α含量顯著上升(P<0.01)，呈極顯著性，M-L、M-M組血清中TNF-α含量升高(P<0.05)，M-H組TNF-α含量與M組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與M組相比，M、M-L組血清中IL-2含量明顯升高(P<0.05)，M-M組IL-2含量升高(P<0.05)，M-H組IL-2 含量與M組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6 AF對(duì)小鼠特異性IgG抗體的影響 結(jié)果顯示，M、M-L、M-M組小鼠獲得的免疫應(yīng)答良好，與M組小鼠比較，抗體水平極顯著性提高(P<0.01)，M-H組無明顯變化，見圖5。

表2 反轉(zhuǎn)錄加樣體系

Tab.2 Reverse transcription reaction system

ReagentSampleadditionTotalRNA7.0μlPrimermix0.5μlRTenzymemix0.5μl5×RTbuffer2.0μlTotal10.0μl

表3 RT-PCR反應(yīng)體系

Tab.3 Real-time PCR reaction system

ReagentSampleadditionSYBRgreenmix12.5μlH2O9.5μlF0.5μlR0.5μlTotal25.0μl

GroupsDose(mg/kg)nThymusweight(mg)Thymusindex(mg/g,%)Spleenweight(g)Spleenindex(mg/g,%)Normalgroup-1555.42±0.012)0.18±0.012)0.18±0.062)0.65±0.052)Modelgroup801522.63±0.010.10±0.020.13±0.020.40±0.02M-Lgroup201552.95±0.012)0.16±0.022)0.16±0.171)0.52±0.092)M-Mgroup401541.72±0.022)0.14±0.022)0.15±0.030.64±0.062)M-Hgroup801531.15±0.020.11±0.020.13±0.040.44±0.10

Note：1)P<0.05,2)P<0.01,compared with model.

圖2 AF對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響Fig.2 Effect of AF on transformation of mouse spleen cellsNote: *.P<0.05,**.P<0.01,compared with model.

圖4 AF對(duì)小鼠血清中細(xì)胞因子TNF-α 、IL-2的影響Fig.4 Effects of AF on serum TNF-α and IL-2 in miceNote: *.P<0.05,**.P<0.01,compared with model.

GroupsDosage(μg/ml)A540Increasingrate(%)Control-0.343±0.02-AF10.343±0.020.087AF20.343±0.030.117AF40.349±0.031)1.672AF60.405±0.052)18.17AF80.435±0.022)26.82AF100.472±0.032)37.52

Note：1)P<0.05,2)P<0.01,compared with normal.

圖3 AF對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effect of AF on proliferation of mouse spleen cellsNote: **.P<0.01,compared with normal.

圖5 AF對(duì)小鼠特異性IgG抗體的影響Fig.5 Effects of AF on serum IgG in miceNote: *.P<0.05,**.P<0.01,compared with model.

2.7 AF對(duì)小鼠脾臟組織中TNF-α、IL-2 mRNA表達(dá)的影響 熒光定量PCR結(jié)果顯示，TNF-α、IL-2熔解曲線為單一峰,擴(kuò)增曲線均為典型S型,基線平整。M-L組TNF-α、IL-2 mRNA表達(dá)分別為(7.73±0.16)、(10.63±0.34)，M-M組TNF-α、IL-2 mRNA表達(dá)分別為(2.6±0.03),(5.43±0.23)，顯著高于M組[(1.83±0.72)、(2.45±0.02)](P<0.01、P<0.05)，如圖6。

圖6 AF對(duì)小鼠脾臟組織中TNF-α 、IL-2 mRNA表達(dá)的影響Fig.6 Effects of AF on TNF-α,IL-2 mRNA expression in miceNote: *.P<0.05,**.P<0.01,compared with model.

3 討論

本研究顯示，ICR小鼠給藥28 d后，顯著提高了免疫抑制小鼠脾臟及胸腺指數(shù)；M-L組顯著促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，體外脾淋巴細(xì)胞增殖，顯著促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能；M-L、M-M組小鼠特異性IgG抗體明顯高于M組；免疫抑制小鼠血清中，腫瘤壞死因子TNF-α及IL-2的含量顯著提高。且通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，TNF-α及IL-2 mRNA水平明顯增高。

本試驗(yàn)以體內(nèi)給藥研究方式結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR等體外試驗(yàn)進(jìn)行研究，結(jié)果表明，AF可減輕CTX造成的免疫器官萎縮現(xiàn)象。從免疫應(yīng)答來看，本試驗(yàn)中免疫抑制AF低劑量組、免疫抑制AF中劑量組小鼠特異性IgG抗體水平明顯高于免疫抑制模型組小鼠，Guy等[11]研究表明，特異性IgG抗體是血清主要的抗體成分，可清除有害補(bǔ)體片段，抑制炎癥反應(yīng)在機(jī)體免疫中起保護(hù)作用。本研究的IgG水平表明，AF能提高免疫抑制小鼠免疫應(yīng)答能力。劉佳[12]和趙定亮[13]報(bào)道，IL-2能促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞的增殖與分化，可誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞(LAK)的產(chǎn)生?？梢栽鰪?qiáng)機(jī)體免疫監(jiān)視功能。譚兵[14]和李衛(wèi)[15]報(bào)道，TNF-α能夠抵抗微生物入侵和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的功能。此次試驗(yàn)，用ELISA試劑法，檢測(cè)出AF免疫抑制組小鼠血清中IL-2、TNF-α含量顯著提高。同時(shí)，采用熒光定量PCR，檢測(cè)TNF-α及IL-2 mRNA水平。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，AF具有較強(qiáng)的免疫增強(qiáng)能力，能拮抗CTX免疫功能低下小鼠的免疫抑制作用。但本次試驗(yàn)，只是免疫研究中的一部分，應(yīng)進(jìn)一步探討研究，以充分證實(shí)試驗(yàn)結(jié)果。

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[收稿2016-02-23 修回2016-04-25]

(編輯 許四平)

Protective effect of Aginyl-fructose immunosuppression in mice

SONGMing-Ming,WANGJia-Qi,HUANGBao-Liang,GAOMing-Tong,LIJing-Yu,DINGChuan-Bo,ZHENGYi-Nan,LIUWen-Cong，XUXiao-Hua.

JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China

Objective:To study the effect of AF on mice induced by cyclophosphamide.Methods: 100 ICR mice were divided into 5 groups randomly,the normal contral group(N),immunosuppressive model group(M)，AF low-dose group(M-L,20 mg/kg)，AF middle-dose group(M-M,40 mg/kg)，AF high-dose group(M-H,80 mg/kg).Drugs were chronically administered to mice for 28 days,dosage of administration was 10 ml/kg of the mice′s weight.The groups of M，M-L，M-M，M-H received an injection of cyclophosphamide (CTX,80 mg/kg) three times a week to cause immunosuppressive.Organ idex，splenic lymphocyte transformation，phagocytic function，IgG，IL-2，TNF-α were conducted 12 hours after the last administration in mice of each group.Results: AF could improve the thymus index and spleen index in mice significantly，promoting the natural transformation and proliferation of splenic lymph-ocytes,adding phagocytic function,AF could improve the content of IgG，IL-2，TNF-α in serum significantly.The result of Real-time fluorescence quantitative PCR show that TNF-α mRNA，IL-2 could be well expressed.Conclusion: AF can inhibit hypoimmunologic mice induced by CTX.

Arginyl-fructosyl；ICR mice；Immune；Fluorogenic quantitative PCR

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.006

①本文受吉林省自然科學(xué)基金(20160101017JC)、吉林大學(xué)生創(chuàng)業(yè)資金項(xiàng)目(20160521011HJ)和延邊州科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2015JH01)資助。

宋明銘(1991年-),女,碩士,主要從事為中藥新藥研究與開發(fā)方面的研究，E-mail：15144090081@163.com。

及指導(dǎo)教師：劉文叢(1968年-),男,博士,教授,主要從事中藥新藥研究與開發(fā)方面的研究，E-mail:jwlw6803@126.com。 徐曉華(1968年-)，女，副主治醫(yī)師，主要從事糖尿病腎病方面的研究，E-mail：xuxiaohua681002@qq.com。

R151.3

A

1000-484X(2017)03-0347-05