王 巍，付茂忠，唐 慧，甘 佳，方東輝，王 淮，易 軍

（四川省畜牧科學(xué)研究院，成都 610066）

綜述與專論

體細胞核移植技術(shù)的研究進展

王 巍，付茂忠，唐 慧，甘 佳，方東輝，王 淮，易 軍

（四川省畜牧科學(xué)研究院，成都 610066）

體細胞核移植轉(zhuǎn)基因法效率高、成本低，目前已經(jīng)成為構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物極為重要的方法。但該項技術(shù)的成功率較低，而且許多克隆動物會出現(xiàn)胎兒過度生長、出生前死亡、出生后生長異常等病理反應(yīng)。文章以核移植生物學(xué)理論為基礎(chǔ)，重點探討了改進型核移植技術(shù)（OSM）在操作方法方面的改進研究，分析了影響核移植成功率的影響因素，為核移植技術(shù)的進一步完善提供了理論基礎(chǔ)。

體細胞核移植；供體；受體；胚胎

經(jīng)歷了數(shù)十年的發(fā)展，體細胞核移植技術(shù)已經(jīng)成為一種較成熟的轉(zhuǎn)基因手段。1952年Briggs等［1］首次進行了細胞核移植試驗并獲得了成功，他們將青蛙囊胚期的細胞核移入去核卵中，經(jīng)過正常卵裂發(fā)育成蝌蚪。由此開辟了高等動物發(fā)育生物學(xué)研究的新思路。1983年，McGrath等［2］利用顯微操作技術(shù)與細胞融合技術(shù)成功培育出克隆小鼠。該技術(shù)基本避免了傳統(tǒng)移核針穿刺細胞膜時造成的損傷，開創(chuàng)了全新的哺乳動物核移植方法。此后，該技術(shù)被大量應(yīng)用于哺乳動物的胚胎克隆中。1997年，Wilmut等［3］利用綿羊乳腺細胞進行核移植試驗，并成功地獲得了世界上第一只體細胞克隆綿羊——多利（Doly）。這一成果證明高度分化的體細胞仍具有全能性，推動哺乳動物核移植技術(shù)邁向應(yīng)用領(lǐng)域?；蛐揎椗c核移植技術(shù)的結(jié)合為轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)提供了更加高效快捷的途徑，通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法將某基因整合到細胞核中，再將此類細胞篩選出來，把這些細胞核轉(zhuǎn)入到去核卵母細胞中，建立重組胚（見圖1），產(chǎn)生的胚胎中所有的細胞均攜帶這種基因。但該項技術(shù)的成功率較低，而且許多克隆動物會表現(xiàn)為胎兒過度生長、出生前死亡、出生后生長異常等病理反應(yīng)。為了探尋影響動物克隆效率的原因，研究者們不斷尋找更為簡便、有效的方法對細胞核移植技術(shù)的各個環(huán)節(jié)進行改善，并且加強對細胞核移植理論的關(guān)注度，在細胞分化、核質(zhì)互作、核重編程以及與動物生長發(fā)育有關(guān)的基因在克隆動物中的表達情況等相關(guān)基礎(chǔ)理論方面開展了大量的研究。

1 核移植的理論基礎(chǔ)

核移植所依賴的理論基礎(chǔ)是基于同一胚胎或細胞系的所有細胞核遺傳信息都與受精卵相同，應(yīng)該同樣具有指導(dǎo)個體發(fā)育的全部潛能。隨著胚胎的發(fā)育與細胞分化的發(fā)生，細胞核的某些基因組發(fā)生了變化，導(dǎo)致這些基因組不能再恢復(fù)到原有狀態(tài)，從而使得細胞核失去了全能性（見圖2）。目前的核移植程序可使初步分化的胚細胞核和已分化的體細胞核發(fā)生發(fā)育程序的去分化和發(fā)育程序再分化，使其恢復(fù)到受精時的狀態(tài)以重新指導(dǎo)胚胎發(fā)育至正常個體［5］。為了使供體核能夠完全的再程序化，關(guān)于重構(gòu)胚中去甲基化和再甲基化的規(guī)律及其在不同物種之間的差別，成熟的卵母細胞質(zhì)中生物活性分子的種類及其對于已分化的體細胞核再程序化的作用，核質(zhì)互作的原理及其對重構(gòu)胚發(fā)育的影響等方面的理論成為研究的重點。

圖1 克隆胚胎的構(gòu)建過程［4］

圖2 胚胎細胞分化過程［4］

2 OSM核移植方法

通常在進行核移植時，影響核移植的主要因素為核重編程［6］、培養(yǎng)條件、卵母細胞的質(zhì)量［7］以及去除卵母細胞染色質(zhì)的技術(shù)［8］。傳統(tǒng)的體細胞核移植（SCNT）的技術(shù)難點在去核時，清空處于減數(shù)分裂階段卵母細胞的中心體蛋白和染色質(zhì)，并使其接受來自供體細胞的不完全的有絲分裂結(jié)構(gòu)，這使得大部分重構(gòu)胚因不能由母源控制過渡到胚胎控制階段而停止卵裂［9-11］。OSM一步微注射法在卵母細胞活化前將外源性有絲分裂細胞核注射到未激活的卵母細胞中，再用微操作儀去除減數(shù)分裂中期的卵母細胞核［12］。該技術(shù)避免了卵母胚胎暴露于Hoechst33342核染色劑和UV照射，減少了卵母胚胎的化學(xué)和物理損傷，其去除的卵母細胞胞質(zhì)極少，保證了胞質(zhì)內(nèi)參與核重編程因子的效應(yīng)［13］，該技術(shù)操作步驟少、時間短、降低了卵母細胞在移核時活化的可能性，提高了核移植成功率。Zhou等［14］比較了電融合法和一步微操作法，發(fā)現(xiàn)一步微操作法獲得的重組胚發(fā)育到囊胚的比例較電融合法高，且囊胚的發(fā)育更為正常。根據(jù)重組胚發(fā)育情況，不同核供體細胞優(yōu)先選擇的轉(zhuǎn)核方法各不相同。羊膜上皮細胞作為核供體細胞時用電融合方法建立的重組胚發(fā)育情況較好，而胚胎成纖維細胞作核供體細胞時用一步微注射方法建立的重組胚發(fā)育情況更好［15］。

3 重構(gòu)胚的激活

重構(gòu)胚最常見的激活方法為點激活，該方法能夠通過瞬間的高電壓刺激，迫使細胞膜形成大量微孔，從而極大程度地增大了Ca2+的通透性，使細胞內(nèi)Ca2+呈現(xiàn)脈沖式升高［16］。通過控制電刺激參數(shù)，產(chǎn)生正常受精過程Ca2+的節(jié)律性脈沖升高，可模擬出正常受精過程中一系列生理學(xué)和形態(tài)學(xué)變化，啟動MII期卵母細胞繼續(xù)成熟分裂，進入正常發(fā)育軌道。

乙醇激活法主要的作用通徑為水解細胞膜上4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）產(chǎn)生1，4，5-三磷酸肌醇（IP3），誘發(fā)細胞內(nèi)源Ca2+釋放到細胞質(zhì)中，提高了胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+濃度，模擬受精過程中Ca2+的變化模式［17］。通常情況下，哺乳動物MII期卵母細胞在含有7%乙醇的培養(yǎng)液中培養(yǎng)5～7 min，就能激活卵母細胞并形成原核，直至發(fā)育到囊胚。

離子霉素（ionomycin）是一種近年來發(fā)現(xiàn)的高效Ca2+載體，已被廣泛地應(yīng)用于哺乳動物卵母細胞的激活［18］。離子霉素可以動員細胞內(nèi)的Ca2+依次觸發(fā)Ca2+內(nèi)流。但離子霉素激活的卵母細胞無原核形成。

4 核移植的影響因素

4.1 供體與受體細胞周期的協(xié)調(diào)

供體與受體細胞的細胞周期發(fā)育同步化是影響核移植成敗的一個重要因素。一個處于正常分裂周期的細胞包括分為間期與分裂期（M期）兩個階段，間期又分為3期，即G1期、S期與G2期（見圖3）。從有絲分裂到DNA復(fù)制前的一段時期，稱為G1期，此期主要合成RNA和核糖體為下階段S期的DNA復(fù)制作好物質(zhì)和能量的準(zhǔn)備。S期為DNA合成期，在此期，除了合成DNA外，同時還要合成組蛋白。G2期為DNA合成后期，為M期做準(zhǔn)備。M期則進行細胞分裂。此外，體細胞還可以暫時離開細胞周期，停止細胞分裂進入靜止期（G0期）。G0期供體細胞處于細胞的靜止期，移入卵細胞質(zhì)后能夠與卵母細胞的DNA復(fù)制同步，減少了核移植細胞發(fā)育過程中染色體畸變的可能性。同時G0期細胞的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)更容易發(fā)生調(diào)整和改變，以適應(yīng)基因表達程序重編的需要，并且G0期細胞的染色質(zhì)由于濃縮而使原來的轉(zhuǎn)錄因子脫落，在去濃縮時卵母細胞中控制基因表達的胞質(zhì)信號分子更容易與供體細胞DNA結(jié)合。另外，G0期細胞含有二倍體的染色體，G0期核重構(gòu)胚胎的染色體倍性能維持正常。因此誕生的多種克隆動物其供體細胞都在體外進行培養(yǎng)，使其進入G0期。但是，1998年Cibelli等［19］使用牛胎兒非靜止期成纖維細胞進行核移植并獲得了成功，表明讓細胞處于靜止期并不是必須的。1998年，Wakayama等［20］用處于G0/G1期的鼠卵丘細胞也獲得了成功。Kasinathan等［21-22］通過研究發(fā)現(xiàn)，G0期細胞不如G1期作供體效果好。目前，關(guān)于G0期對供體細胞核移植的必要性仍不能給予有利證明。

圖3 細胞分裂周期

在核移植研究中普遍采用去核的MⅡ期卵母細胞作為受體胞質(zhì)，從細胞周期角度來看，MⅡ期卵母細胞含有高水平的M期促進因子（MPF）。該細胞因子主要由周期素B（cyclin）和p34cdc2組成的復(fù)合物。MPF作為一個蛋白激酶，MPF的活性受自身磷酸化/去磷酸化的狀態(tài)所調(diào)控，其含量水平在細胞周期和成熟的不同階段也會發(fā)生變化。在所有動物中，MPF水平在G2期過渡到M期時升高，而在后期和末期降低。MPF水平在第二次減數(shù)分裂中期顯著增高，使成熟的卵母細胞靜止于MⅡ期，在受精或卵細胞激活時，MPF活性急劇下降，導(dǎo)致細胞減數(shù)分裂，第二極體排出。高水平的MPF，可以誘導(dǎo)移入核的核膜破裂和早熟染色體凝集的發(fā)生，從而保證供體核DNA的正確復(fù)制和重編程。Manandhar等［23］通過比較體細胞分別移入去核的MⅠ和MⅡ期卵細胞后形成的豬重構(gòu)胚胎在體外的發(fā)育能力，發(fā)現(xiàn)MⅠ期卵細胞同樣可以作為核移植的受體，這可能與MⅠ期是卵細胞成熟過程中MPF的高峰期有關(guān)。然而欲使核移植后細胞正?；顒?，核移植過后必須降低MPF水平，否則染色體損壞或異倍體化率將會很高［24-25］。協(xié)調(diào)供體細胞與受體細胞的周期對維持重構(gòu)胚胎的正確染色體倍數(shù)和阻止DNA損傷是必要的。不同周期階段的供體與受體細胞組合能夠阻止DNA損壞以及不協(xié)調(diào)復(fù)制導(dǎo)致的假原核現(xiàn)象。另外，研究發(fā)現(xiàn)用M期卵細胞能促進供體遺傳物質(zhì)的重編程，因為核膜破裂，早期染色體凝聚的出現(xiàn)，將供體染色質(zhì)暴露在與早期發(fā)育有關(guān)的受體細胞質(zhì)因子之中［26］。

4.2 卵母細胞和胚胎的質(zhì)量

卵母細胞是核供體細胞重編程的場所，為克隆胚胎發(fā)育提供了充足的物質(zhì)基礎(chǔ)，它的來源以及成熟質(zhì)量直接影響到克隆效率的高低。近年來，為提高卵母細胞與克隆胚胎的質(zhì)量，研究人員進行了大量的嘗試。有研究表明，在克隆豬胚胎的培養(yǎng)中添加一定劑量的維生素C可以顯著提高克隆胚的質(zhì)量，一些干細胞因子（Oct4、Klfl4、Sox2）的mRNA表達量明顯上升，其表達量可達到IVF胚胎水平，使用維他命C處理過的胚胎進行胚移后，其產(chǎn)仔率明顯升高［27］。使用CBHA（一種去組蛋白乙?；种苿┨幚硇∈蟮目寺∨咛ズ?，胚胎克隆效率明顯提高，并且還源于克隆胚胎的干細胞質(zhì)量也明顯提升［28］。

4.3 胚胎移植方法與動物后期管理

根據(jù)不同動物的特點選擇配套的胚胎移植方法，通常豬、羊選擇腹腔鏡微創(chuàng)手術(shù)方法進行移植，移植的部位為子宮和輸卵管；牛、馬選擇非手術(shù)的方式進行胚胎移植，移植部位為子宮。妊娠的受體動物的后期管理非常重要，因為轉(zhuǎn)基因克隆動物會存在很大比例的發(fā)育異常，極有可能導(dǎo)致無故流產(chǎn)、胎兒巨大難產(chǎn)、出生動物存活率低等現(xiàn)象。

［1］Briggs R，King T J Proc.Transplantation of living nuclei from blastula cells into enucleated frogs’eggs［J］.Natl Acad Sci USA，1952，38：455-463.

［2］McGrath J，Solter D.Structure and organization of the human Ki-ras proto-oncogeneandarelated processed pseudogene［J］.Science，1983，220：1300-1302.

［3］Wilmut I，Beaujean N.Somatic cell nuclear transfer［J］.Nature，2002，419：583-585.

［4］J B Gurdon，D A Melton.Nuclear reprogramming in cells［J］.Science，2008，322（5909）：1811.

［5］Welts D N，Mislca P M，Day A M J，et al.Production of cloned lambs from an established embryonic cell line：a comparison between in vivo and in vitro-matured cytoplasts［J］.Biol of Reprod，1997，57（2）：385-393.

［6］Mitalipov S M，Yeoman R R，Nusser K D，et al.Rhesus monkey embryos produced by nuclear transfer from embryonic blastomeres or somatic cells［J］.Biol Reprod，2002，66：1367-1373.

［7］Gao S，McGarry M，Priddle H，et al.Effects of donor oocytes and culture conditions on development of cloned mice embryos［J］.Mol Reprod Dev，2003，66：126-133.

［8］Wakayama T，Yanagimachi R.Mouse cloning with nucleus donor cells ofdifferent age and type［J］.Mol Reprod Dev，2001，58：376-383.

［9］Simerly C，Dominko T，Navara C，et al.Molecular correlates of primate nuclear transfer failures［J］.Science，2003，300：297.

［10］Simerly C，Navara C，Hwan Hyun S，et al.Embryogenesis and blastocyst development after somatic cell nuclear transfer in nonhuman primates：overcoming defects caused by meiotic spindle extraction［J］. DevBiol，2004，276：237-252.

［11］Ng S C，Chen N，Yip W Y，et al.The first cell cycle after transfer of somatic cell nuclei in a non-human primate［J］.Development，2004，131：2475-2484.

［12］Zhou Q，Renard J P，F(xiàn)riec G L，et a1.Generation of fertile cloned rats byregulatingocyte activation［J］.Science，302（5648）：l179.

［13］Wolf D P.Assisted reproductive technologies in rhesus macaques［J］. Reprod Biol Endocrinol，2004，2：37.

［14］Zhou Q，YangS H，DingC H，et a1.A comparative approach tosomatic cel1nucleartransferintherhesusmonkey［J］.HumReprod，2006，21（10）：2564-2571.

［15］Okahara Narita J，Tsuchiya H，Takada T，et a1.Cloned blastocysts produced by nuclear transfer from somatic ceils in cynomolgus monkeys（Macaca fascicularis）［J］.Primates，2007，48（3）：232-240.

［16］Styliani M，Alexander M，Rudolf J.Somatic cell nuclear transplantation and derivation ofembryonic stemcells in the mouse［J］.Methods，2008，45：101-114.

［17］Devreker F，Harey K.Effects of glutamine and taurine on preimplantation development and cleavage of mouse embryos in vitro［J］. BiologyofReproduction，1997，57：921-928.

［18］Campbell K D，Reed W A，White K L.Ability of integrins to mediate fertilization，intracellular calcium release，and parthenogenetic development in bovine oocytes［J］.Biology of Reproduction，2000，62（6）：1702-1709.

［19］Cibelli J B，Stice SL，Golucke P J，et a1.Cloned transgenic calyes produced from nonquiescent fetal fibroblasts［J］.Science，1998，280：l256-1258.

［20］Wakayama T，Perry A C，Zuccotti M，et a1.Full term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei［J］. Nature，1998，394：369-374.

［21］Kasinathan P，Knott J G，Moreira P N，et a1.Effect of fibroblast donor cell age and cell cycle on development of bovine nuclear transfer embryos in vitro［J］.Biol Reprod，2001，64（5）：1487-1490.

［22］Kasinathan P，Knott J G，Wang Z，et a1.Production of calves from G1 fibroblasts［J］.Nat Biotech，2001，19（12）：1176-1178.

［23］Manandhar G，Simerly C，Schatten G.Centrosome reduction during mammalian spermiogenesis［J］.Curr Top DevBiol，2000，49：343-363.

［24］Campbell K H，Loi P，Otaegui P J，et a1.Cell cycle co-ordination in embryocloningbynuclear transfer［J］.Rev Reprod，1996，1：40-46.

［25］Campbe U K H.Nuclear equivalence，nuclear transfer and the cell cycle［J］.Cloning，1999，1：3-15.

［26］Polejaeva I A，Chen S H，Vaught T D，et a1.Cloned pigs produced by nucleartransferfromadultsomaticcells［J］.Nature，2000，407：86-90.

［27］HuangY，TangX，Xie W，et al.Vitamin Cenhances in vitro and in vivo development of porcine somatic cell nuclear transfer embryos［J］. BiochemBiophys Res Comun，2011，411（2）：397-401.

［28］Dai X，HaoJ.Somatic nucleus reprogrammingis significantlyimproved by m-carboxycinnamic acid bishydroxamide，a histone deacetylase inhibitor［J］.J Biol Chem，2010，285（40）：31002-31010.

Progress in Somatic Cell Nuclear Transfer

WangWei，F(xiàn)u Maozhong，Yi Jun，et al
（Sichuan Animal Science Academy，Chengdu 610066，China）

The somatic cell nuclear transfer（SCNT）has been widely applied in production of transgenic animal due to the high performance and the lowcost.However，cloningbysomatic cell nuclear transfer（SCNT）is still inefficient.This paper summarized some important aspects ofOSM，and alsoanalyzed the factor that related tothe OSM.

somatic cell nuclear transfer；donor cell；receptor cell；embryo

Q813.7

A

2095-3887（2017）02-0044-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.02.015

2017-01-17

四川省基本科研項目（2015JY0181）；“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃課題（2015BAD03B04-3）；四川省科技支撐項目（2015NZ0020）；四川省育種攻關(guān)項目（2016NYZ0050）；四川省公益類科研院所基本科研項目（SASA2014A05）

王?。?984-），男，蒙古族，副研究員，博士。

易軍（1971-），男，研究員，本科。研究方向：動物營養(yǎng)與飼料加工。