葉錦雄，羅嘉琪，翟文澤

（1．廣東省廣州市東升醫(yī)院藥劑科，廣東 廣州 510140； 2．廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院·國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)重點(diǎn)研究室·廣東高校中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006）

·檢驗(yàn)檢測(cè)·

高效液相色譜法測(cè)定陽(yáng)和膏中雙酯型生物堿限量

葉錦雄1，羅嘉琪2，翟文澤2

（1．廣東省廣州市東升醫(yī)院藥劑科，廣東 廣州 510140； 2．廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院·國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)重點(diǎn)研究室·廣東高校中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006）

目的建立測(cè)定陽(yáng)和膏3種雙酯型生物堿限量的高效液相色譜（HPLC）法。方法色譜柱采用Inertsil ODS-3柱（250 mm×4．6mm，5 m）；流動(dòng)相為乙腈-四氫呋喃（25∶15）及以0．1mol／L醋酸銨溶液（每1000mL加冰醋酸0．5mL），梯度洗脫；體積流量為1．0mL／min；柱溫為20℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm。結(jié)果新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿分別在0．214 8～2．148 0 g，0．196 8～1．968 0 g，0．204 0～2．040 0 g范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，平均回收率分別為93．24%，98．49%，94．93%，RSD分別為2．12%，2．51%，2．65%(n＝6)。結(jié)論該方法可靠，重復(fù)性好，可用于陽(yáng)和膏的質(zhì)量控制。

陽(yáng)和膏；雙酯型生物堿；高效液相色譜法

陽(yáng)和解凝膏來(lái)源于清代王維德《外科證治全生集》，在此方劑基礎(chǔ)上經(jīng)我院名中醫(yī)藥專家多年的摸索并改良而得陽(yáng)和膏。陽(yáng)和膏具有溫經(jīng)和陽(yáng)、散結(jié)消腫等功效，用于陰疽流注、凍瘡、腫毒等屬陰證者，臨床上用于治療骨髓炎和乳腺增生[1]。該制劑由制川烏、制草烏、淡附片、牛蒡子、地龍、當(dāng)歸、肉桂、白芷、乳香、沒(méi)藥、赤芍、大黃等中藥組方。原標(biāo)準(zhǔn)中只有質(zhì)量差異和軟化點(diǎn)測(cè)定，不能較好地控制其質(zhì)量。烏頭類中藥為處方中的主藥，其中烏頭類生物堿具有抗炎止痛[2-3]和抑制腫瘤生長(zhǎng)[4]的作用，同時(shí)也有較強(qiáng)的毒性[5-8]，為了能更好地控制陽(yáng)和膏的質(zhì)量，參考文獻(xiàn)[9]，本研究中對(duì)該制劑中的雙酯型生物堿進(jìn)行高效液相色譜（HPLC）法限量測(cè)定，以期建立穩(wěn)定、可行的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

Waterse2695型高效液相色譜儀，包括四元低壓梯度泵，Waters2998PDA檢測(cè)器，Empower3色譜管理系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司）；AUW120D型電子天平（日本島津公司）。

1．2 試藥

乙腈、四氫呋喃為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純；新烏頭堿對(duì)照品（批號(hào)為150228），次烏頭堿對(duì)照品（批號(hào)為 141105），烏頭堿對(duì)照品（批號(hào)為141102)，均由廣州市齊云生物科技有限公司提供；陽(yáng)和膏（醫(yī)院制劑室，粵藥制字Z20071509）。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件[10]與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Inertsil ODS-3柱（250 mm×4．6 mm，5μm）；柱溫：20℃；流動(dòng)相：乙腈-四氫呋喃（25∶15，A），0．1mol／L醋酸銨溶液（B），梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表1；檢測(cè)波長(zhǎng)：235 nm；流速 1．0 m L／min。在此色譜條件下，各組分分離良好，陰性對(duì)照無(wú)干擾，詳見(jiàn)圖1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序表

2．2 溶液制備

混合對(duì)照品溶液：取新烏頭堿對(duì)照品、次烏頭堿對(duì)照品、烏頭堿對(duì)照品適量，精密稱定，加異丙醇-三氯甲烷（1∶1）混合溶液制成每1m L含新烏頭堿0．107 4mg，次烏頭堿0．098 4mg，烏頭堿0．102 0mg的混合溶液，即得。

圖1 高效液相色譜圖

供試品溶液：取本品4張，4℃冷藏后對(duì)折剪碎，再置-20℃下冷凍，取出，除去蓋襯，置錐形瓶中，加入3 mol／L硫酸 100 m L，振搖 5 min，放置過(guò)夜。加乙醚30m L，轉(zhuǎn)移至布氏漏斗中減壓抽濾，用乙醚洗滌容器和濾渣2次，每次10m L，洗液分次轉(zhuǎn)移至布氏漏斗中減壓抽濾至無(wú)水滴時(shí)，棄去漏斗中的乙醚液。再用3mol／L硫酸溶液分次洗滌容器和濾渣，每次20mL，洗液分次轉(zhuǎn)移至布氏漏斗中減壓抽濾，濾液合并，再轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用3mol／L硫酸溶液洗滌容器2次，每次10m L，洗液并入同一分液漏斗中，用乙醚洗滌2次，每次10mL，棄去乙醚液。水層用氨水調(diào)節(jié)pH至9～10，再用乙醚振搖提取6次，每次120 mL，合并乙醚液，40℃以下減壓回收溶劑至干，殘?jiān)赢惐?三氯甲烷（1∶1）混合溶液使溶解，轉(zhuǎn)移至2m L容量瓶中，加異丙醇-三氯甲烷（1∶1）混合溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

陰性對(duì)照品溶液：取處方缺制川烏、制草烏、附片的其他藥味，照處方生產(chǎn)工藝制備陰性樣品，依法制得陰性對(duì)照品溶液。

2．3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密量取上述對(duì)照品溶液各0．02， 0．05，0．10，0．15，0．20mL，分別置2mL容量瓶中，加異丙醇-三氯甲烷（1∶1）混合溶液稀釋至刻度，搖勻，制成5種濃度的對(duì)照品溶液。分別精密吸取以上對(duì)照品溶液各20μL，注入高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，新烏頭堿 Y＝1．3 E+6X-34 954，r＝1．000 0；次烏頭堿 Y＝1．5 E+ 6X-38412，r＝0．9998；烏頭堿 Y＝1．2E+6X+1603．3，r＝0．999 8。結(jié)果表明，新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿進(jìn)樣量分別在 0．214 8～2．148 0，0．196 8～1．968 0，0．204 0～2．040 0μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密量取新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿混合對(duì)照品溶液各20μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6次。結(jié)果新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿峰面積積分值的 RSD分別為0．72%，0．81%，1．38%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為140101）樣品，依法制備6份供試品溶液，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣20μL，測(cè)定。結(jié)果供試品溶液均未檢出新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取新配制的新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿混合對(duì)照品溶液20μL，按擬訂色譜條件，分別于0，2，4，8，12 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿的峰面積。結(jié)果新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿峰面積的RSD分別為1．42%，2．86%，1．63%（n＝5），表明新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿混合對(duì)照品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

回收試驗(yàn)：精密稱取新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿對(duì)照品適量，加異丙醇-三氯甲烷（1∶1）混合溶液制成新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿混合對(duì)照品溶液。取同一供試品（批號(hào)為140101）共6份，分別精密加入上述新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿混合對(duì)照品溶液1m L，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件，分別進(jìn)樣20μL，測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2。

2．4 樣品限量測(cè)定

取陽(yáng)和膏3批（批號(hào)為131201，140101，140102），依法制備3個(gè)不同批次樣品的供試品溶液，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣20μL，測(cè)定。結(jié)果雙酯型生物堿以新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿的總量計(jì)，均未檢出。

2．5 檢出限

取已制備好的雙酯型生物堿對(duì)照品，其中新烏頭堿0．002 148 g／L，次烏頭堿0．001 968 g／L，烏頭堿0．002 040 g／L，分別進(jìn)樣5μL測(cè)定，檢出限設(shè)為信噪比為2～3∶1，確定新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿的檢測(cè)限分別為0．010 74，0．010 2，0．009 84μg。

表2 回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

3 討論

膏藥遵循中醫(yī)辨證論治及中藥的功效、主治原則，充分調(diào)動(dòng)藥物相互作用的效能，多由多味藥物組方，以發(fā)揮藥物的良好效果。膏藥直接敷貼于體表，藥物通過(guò)滲入皮膚，內(nèi)傳經(jīng)絡(luò)、臟腑，起到通經(jīng)絡(luò)、調(diào)氣血、祛寒濕、散瘀、消腫止痛等作用。由于黑膏藥的制作工藝較復(fù)雜，基質(zhì)處方往往要根據(jù)天氣的冷暖來(lái)調(diào)整，以避免成品太硬或太軟等問(wèn)題，且成品黏度較大，輔料的量較大，不易進(jìn)行質(zhì)量分析。

陽(yáng)和膏主要由中藥飲片、花生油與紅丹（鉛丹）煉制而成。本試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)牛皮紙對(duì)回收率有明顯影響，且牛皮紙具有一定的體積，需增加提取溶劑的用量，不利于試驗(yàn)，但經(jīng)低溫冷凍后，牛皮紙與制劑較易剝離，制劑變碎，可較好地去除牛皮紙襯蓋，避免牛皮紙對(duì)測(cè)定的影響。

考察了三氯甲烷、二氯甲烷、乙醚和鹽酸等[11-15]提取溶劑，雖可溶解樣品，但較難將基質(zhì)完全除去，同時(shí)也存在陰性對(duì)照干擾或提取不完全等問(wèn)題。本試驗(yàn)以不同濃度硫酸溶液進(jìn)行提取，分別考察了0．05，0．10，0．20，0．50，1．50，2．00，2．50，3．00 mol／L的硫酸溶液，結(jié)果顯示硫酸溶液濃度達(dá)到3mol／L能較好地溶解樣品，且對(duì)雙酯型生物堿的影響較小，達(dá)到較高提取效率，故選擇3mol／L硫酸作為提取溶劑。采用硫酸溶液冷浸的方式對(duì)樣品進(jìn)行處理，不僅能避免雙酯型烏頭堿加熱分解，實(shí)現(xiàn)制劑基質(zhì)與被檢物質(zhì)的分離，提高提取效率，減少有機(jī)溶劑的使用量，利于環(huán)境保護(hù)。

處方中制川烏、制草烏和淡附片均含有苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿，故考察同時(shí)缺制川烏、制草烏和淡附片的陰性樣品。

綜上所述，本方法結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于陽(yáng)和膏的限量測(cè)定。由于生產(chǎn)工藝溫度較高，可達(dá)320℃，烏頭堿類成分可能已被破壞，故本試驗(yàn)中3批樣品均未檢出烏頭堿類成分，在日常檢驗(yàn)工作中，發(fā)現(xiàn)部分樣品可檢出雙酯型烏頭堿，含量均不超過(guò)每張3μg，遠(yuǎn)低于標(biāo)準(zhǔn)中不超過(guò)80μg含量的要求。出于制劑安全性的考察，本研究仍具有重要意義。

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Lim it Detection of Douber-Ester A lkaloids from Yanghe Plaster by HPLC

Ye Jinxiong1,Luo Jiaqi2,Zhai Wenze2
(1．Guangzhou Dongsheng Hospital,Guangzhou,Guangdong,China 510140; 2．Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou,Guangdong,China 510006)

Objective To establish an HPLC limit detection method for douber-ester alkaloids in Yanghe plaster．M ethods The separation was performed on Inertsil ODS-3 column(250 mm×4．6 mm,5μm)．The mobile phase were acetonitrile-tetrahydrofuran(25∶15) and 0．1 mol／L ammonium acetate-water with gradient elution．The flow rate was 1 m L／min with column temperature 20℃ and detection wavelength at 235 nm．Resu lts The calibration curves were within the ranges of 0．214 8-2．148 0μg for hypaconitine,0．196 8～1．968 0μg for mesacontitine and 0．204 0-2．040 0μg for aconitine．The average recoveries were 93．24%,98．49% and 94．93%, RSD were 2．12%,2．51% and 2．65%(n＝6),respectively．Conclusion This method is reliable,reproducible,which can be applied to quantitative analysis of this preparation．

Yanghe Plaster;douber-ester alkaloids;HPLC

R284.1；R286.0

A

1006-4931(2017)03-0022-03

2016-10-18；

2016-11-24)

10．3969／j．issn．1006-4931．2017．03．007

葉錦雄（1977-），男，碩士研究生，副主任中藥師，研究方向?yàn)獒t(yī)院制劑和臨床藥學(xué)，（電話）020-81911115-8901（電子信箱）yaehi＠126．com。