朱葆華，常雅青，何文棟，楊官品，李 赟，潘克厚，3??

(1.海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國海洋大學(xué))，山東 青島 266003;2.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003;3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237)

RNA干擾UGP基因表達(dá)對三角褐指藻碳流分配的影響?

朱葆華1，常雅青1，何文棟1，楊官品2，李 赟1，潘克厚1，3??

(1.海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國海洋大學(xué))，山東 青島 266003;2.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003;3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237)

為深入研究RNA干擾尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)基因的表達(dá)對三角褐指藻(PhaeodactylumtricornutumBohlin)碳流分配的影響，本研究以RNA干擾UGP表達(dá)的三角褐指藻為對象，測定了野生和轉(zhuǎn)基因藻株的葉綠素?zé)晒鈪?shù)和生物量，分析了它們的脂肪酸組成和金藻昆布多糖、總脂及蛋白質(zhì)的含量。研究顯示，轉(zhuǎn)基因藻株的最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)從指數(shù)生長后期開始顯著低于野生型，但野生和轉(zhuǎn)基因藻株的終生物量無明顯差別。轉(zhuǎn)基因藻株(AS、IR)的C16與C18之和分別占總脂肪酸含量的66.90%和68.89%，比野生藻株分別提高了19.40%和22.97%，說明抑制UGP表達(dá)改變了三角褐指藻的脂肪酸組成。轉(zhuǎn)基因藻株的金藻昆布多糖、總脂及蛋白質(zhì)含量與野生型藻株差別明顯：藻株AS的金藻昆布多糖含量降低25.70%，蛋白質(zhì)含量上升3.80%，總脂含量提高了13.2%；藻株IR的金藻昆布多糖含量降低40.70%，蛋白質(zhì)含量上升8.30%，總脂含量增加了25.20%。研究結(jié)果表明，RNA干擾UGP的表達(dá)改變了三角褐指藻的脂肪酸組成，使得在最終生物量無明顯減少的情況下，光合作用固定的碳更多轉(zhuǎn)向油脂合成。本研究進(jìn)一步明確了RNA干擾UGP的表達(dá)對三角褐指藻碳流分配的影響機(jī)制，為通過基因工程改造藻種提高微藻的生物柴油生產(chǎn)潛力提供了新思路。

三角褐指藻；生物柴油；RNA干擾；UGPase；脂肪酸；碳流分配

生物柴油作為一種可再生、綠色環(huán)保的清潔能源日益受到關(guān)注，有望成為化石燃料的重要替代，緩解能源危機(jī)[1]。硅藻(Diatom)是一類單細(xì)胞、光合自養(yǎng)的真核微藻，在海洋生態(tài)系統(tǒng)及全球碳循環(huán)中發(fā)揮重要作用，它們固定的碳主要以脂質(zhì)和金藻昆布多糖存儲在藻細(xì)胞中。利用基因工程手段調(diào)控金藻昆布多糖的合成，不但有助于深入了解金藻昆布多糖的合成路徑，也是培育優(yōu)良能源微藻藻種的有效方法[2]。

三角褐指藻(PhaeodactylumtricornutumBohlin)是一種真核海洋單細(xì)胞硅藻,能夠大量合成并積累多不飽和脂肪酸(PUFAs)，特別是EPA，其含量可達(dá)總脂肪酸含量的30%以上，有望成為工業(yè)化生產(chǎn)EPA的原料[3]。此外，三角褐指藻具有適應(yīng)性強(qiáng)、繁殖快和培養(yǎng)方便等優(yōu)點(diǎn)，其油脂含量較高，可作為規(guī)模化生產(chǎn)生物柴油的優(yōu)良候選藻種[4]。

尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(Uridine diphosphoglucosepyrophosphorylase，簡稱UGPase), 催化葡萄糖-1-磷酸(Glc-1-P)和尿苷三磷酸(UTP)生成尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和焦磷酸(PPi)的可逆反應(yīng)，即Glc-1-P+ UTP←→UDPG+ PPi。UGPase在生物中普遍存在，在高等植物糖類代謝和細(xì)胞壁的生物合成中發(fā)揮重要作用[5-6]。關(guān)于UGPase在硅藻中的功能，我們前面的研究初步證明了該酶在三角褐指藻的碳流分配中發(fā)揮重要作用，但UGPase在碳流分配中如何發(fā)揮作用等需要進(jìn)一步深入研究[2]。

本文以RNA干擾UGP表達(dá)的三角褐指藻為對象，測定其生長、脂肪酸組成和金藻昆布多糖、總脂和蛋白質(zhì)含量，試圖回答以下問題：(1)UGPase對金藻昆布多糖合成的影響，碳流分配有幾個去向？(2)碳流分配中有多大比例轉(zhuǎn)向脂類，多大比重轉(zhuǎn)向蛋白? 以便深入探究三角褐指藻UGPase影響碳流分配的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藻種來源及培養(yǎng)

野生型三角揭指藻(PhaeodactylumtricornutumBohlin)從中國海洋大學(xué)微藻種質(zhì)庫獲得,轉(zhuǎn)基因三角褐指藻為RNA干擾UGP表達(dá)藻株，編號分別為AS和IR。AS代表轉(zhuǎn)化了反義干擾載體的藻株，IR代表轉(zhuǎn)化了反向重復(fù)干擾載體的藻株，WT代表野生型藻株。

在(20±2)℃、光照強(qiáng)度為27.5～37.5 μmol photons·m-2·s-1(光照周期12D∶12D)條件下用f/2培養(yǎng)基不通氣培養(yǎng)，每種藻株設(shè)置3個平行。接種時的細(xì)胞密度相同，均為25×104/mL，培養(yǎng)液的體積為350 mL，置于500 mL的三角瓶中培養(yǎng)，每日隨機(jī)調(diào)換三角瓶并搖晃2～3次，每隔1天定時取樣，進(jìn)行細(xì)胞密度、葉綠素?zé)晒飧黜?xiàng)參數(shù)的測定，培養(yǎng)至指數(shù)生長末期，收集藻液。

1.2 轉(zhuǎn)基因藻株的鑒定

1.2.1 PCR鑒定 用CTAB法[7]分別提取野生型和轉(zhuǎn)基因三角褐指藻的基因組DNA，根據(jù)遺傳轉(zhuǎn)化體系中的抗Shble基因序列用Primer5軟件設(shè)計(jì)引物、進(jìn)行PCR擴(kuò)增,對保存的轉(zhuǎn)基因藻株進(jìn)行鑒定,引物見表1。

PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，63 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)后，72 ℃延伸5 min。

1.2.2 實(shí)時熒光定量PCR 實(shí)時熒光定量采用相對定量的方法，以編碼組蛋白的H4基因(Histone H4)為內(nèi)參[8], 本研究所用引物見表1。離心(4 000g，5 min)收集指數(shù)生長末期的藻細(xì)胞，滅菌雙蒸水洗滌2次，用于提取RNA。總RNA的提取使用OMEGATotal RNA Kit I試劑盒，按照說明書操作。RNA反轉(zhuǎn)錄使用全式金的TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒，用Roche Applied Science的LightCycler 480 Real-Time PCR System 進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測。最后采用2-ΔΔCT算法[9]計(jì)算UGP的相對轉(zhuǎn)錄量。

表1 引物信息

1.3 生長曲線繪制及生物量測定

每隔10 d，在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板對3組藻進(jìn)行計(jì)數(shù)，繪制生長曲線。

離心收集指數(shù)生長末期的藻液各260 mL，通過Christ真空冷凍干燥機(jī)(ALPHA 1-4 LD，Germany)進(jìn)行冷凍干燥，稱量藻粉質(zhì)量，計(jì)算生物量。

1.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定

利用Water-PAM水樣葉綠素?zé)晒鈨x(Walz, Germany)測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)。測定前對待測藻液進(jìn)行暗適應(yīng)15 min。葉綠素?zé)晒鈪?shù)PSⅡ的最大光能轉(zhuǎn)化效率Fv/Fm，PSⅡ的實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率Yield，光化學(xué)淬滅qP和非光化學(xué)淬滅NPQ可由自帶程序直接讀出,其中Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm，F(xiàn)0為基礎(chǔ)熒光，F(xiàn)m為飽和脈沖(4 000 μmol·m-2·s-1，持續(xù)時間為0.8 s)激發(fā)獲得的最大熒光。

1.5 葉綠素和類胡蘿卜素含量測定

取指數(shù)生長末期的藻液2 mL,離心收集(2 000g,4 ℃,8 min)藻細(xì)胞，用滅菌雙蒸水洗滌2次，加入2 mL無水甲醇，用渦旋儀震蕩15 s使藻細(xì)胞懸浮，黑暗條件下室溫放置24 h，離心(3 000g，10 min)，取上清液于470和666 nm測定OD值[10]。

葉綠素a和類胡蘿卜素質(zhì)量濃度(μg/mL),按照下面的公式計(jì)算[11,12]：

CChla=15.65A666;

CCaro=(1 000A470—4.476A666)/221。

其中:A470和A666分別表示葉綠素溶液在波長470和666 nm處的吸光度;CChla和CCaro分別表示葉綠素a和類胡蘿卜素的濃度。

1.6 UGPase活性測定

UGPase活性測定使用GENMED植物尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性光譜法定量檢測試劑盒(Genmed Scientifics Inc., Shanghai, China)。蛋白質(zhì)濃度測定使用GENMEDBradford蛋白濃度定量試劑盒(Genmed Scientifics Inc., Shanghai, China)。酶活性通過SynergyScie多功能酶標(biāo)儀(Bio-Tek，USA)監(jiān)測37 ℃，0與30 min時波長340 nm處的吸光值進(jìn)行測定。UGPase單位活性定義為：在37 ℃，pH=7.5條件下，每分鐘還原1 μmol的NADP+所需的酶量。

1.7 氣相色譜法測定脂肪酸組成

參照文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行：取30 mg藻粉于15 mL試管中，加入1 mL 2 mol/L的KOH-CH3OH溶液，渦旋混勻，75 ℃水浴皂化30 min；冷卻至室溫，加入2 mL 3 mol/L的HCL-CH3OH溶液，75 ℃水浴中甲酯化15 min；冷卻至室溫，加入1 mL正己烷，振蕩后加入2 mL蒸餾水萃?。蝗∩蠈诱和閷佑贓P管中，離心(1 000g,4 ℃,10 min)。氣相色譜(GC)分析采用AgiLent 6890 Series GC Systerm (US10251016,USA)；氫火焰離子化檢測器(FID)；實(shí)驗(yàn)參數(shù)：氣化室溫度250 ℃，空氣流量450 mL/min，分流比10∶1，程序升溫170 ℃(1 min)升至210 ℃(25 min)，每分鐘3 ℃，每個樣品取5，每進(jìn)行GC分析。

1.8 金藻昆布多糖、總脂和蛋白質(zhì)含量測定

金藻昆布多糖含量測定：按照Granum 和Myklestad[14]的方法萃取金藻昆布多糖，用苯酚-硫酸法測定其含量[15]。稱取約2 mg藻粉，置于10 mL螺口玻璃管中，加入5 mL 0.05 mol/L H2SO4，旋緊管蓋，快速渦旋混勻。60 ℃水浴10 min；反應(yīng)液用Whatman的GF/C膜過濾至螺口管中，取2 mL濾液依次加入0.5 mL 3%的液化苯酚和5 mL的濃H2SO4。快速渦旋混勻，靜至30 min后用流水冷卻。用分光光度計(jì)(U-3310)測定其485 nm處的吸光值。

總脂含量測定：采用氯仿-甲醇法[16-17]。取50 mg藻粉，懸浮于氯仿∶甲醇(2∶1，V/V)中，震蕩萃取15 min，離心(條件)取上清，將下層(沉淀物)進(jìn)行第二次抽提。2次抽提的上清混合，加入0.9%的NaCl，形成氯仿∶甲醇∶水(2∶1∶0.6，V/V/V)的萃取體系，抽出下層(氯仿層)轉(zhuǎn)移到螺口玻璃管中。65 ℃水浴揮發(fā)掉氯仿，放入烘箱中80 ℃烘干并稱重。

蛋白質(zhì)含量測定[18]：稱取10 mg藻粉于1.5 mL離心管中，加入100 μL 1 mol/L NaOH混勻，80 ℃水浴10 min，加入900 μL蒸餾水混勻，離心(4 ℃,9 000g,30 min)，取上清于5mL離心管中，重復(fù)上述抽提步驟2次，合并所有上清。利用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS軟件進(jìn)行單因子方差分析，以P<0.05作為差異顯著性水平。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)基因三角褐指藻的鑒定

2.1.1 PCR鑒定 由圖1可以看出，以轉(zhuǎn)基因三角褐指藻基因組DNA為模板得到了長度約為400bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，說明本實(shí)驗(yàn)使用的轉(zhuǎn)基因藻株確實(shí)為含有RNA干擾載體的三角褐指藻。

2.1.2 UGP相對表達(dá)量及酶活測定 由圖2可以看出，轉(zhuǎn)基因藻株AS和IR的UGP相對表達(dá)量明顯低于野生藻株WT，由圖3可以看出，轉(zhuǎn)基因藻株AS對應(yīng)的UGPase活性下降22%，轉(zhuǎn)基因藻株IR對應(yīng)的UGPase活性下降59%，說明轉(zhuǎn)基因藻株中UGP的表達(dá)受到不同程度的抑制，與野生藻株相比差異顯著。

(1.DNA MarkerDL2000；2.轉(zhuǎn)基因藻株AS；3.轉(zhuǎn)基因藻株IR；4.野生藻株WT。Lane 1.DNA Marker DL2000；lane 2.transgenic AS；lane 3.transgenic IR；lane 4.wild type WT.)

(WT:野生藻株；AS：轉(zhuǎn)基因株AS；IR：轉(zhuǎn)基因株IR。WT：Wild type；AS：Transgenic AS；IR：Transgenic IR.)

2.2 轉(zhuǎn)基因與野生型三角褐指藻生長曲線

由圖4可以看出，轉(zhuǎn)基因和野生藻株的細(xì)胞密度均隨培養(yǎng)時間的延長逐漸增加，在培養(yǎng)周期內(nèi)最大細(xì)胞密度分別為670×104/mL(IR)，600×104/mL (AS)，550×104/mL (WT)，差異顯著性分析表明三者之間沒有顯著性差異，說明轉(zhuǎn)基因沒有影響三角褐指藻的生長。

(WT:野生藻株；AS：轉(zhuǎn)基因株AS；IR：轉(zhuǎn)基因株IR。WT：Wild type；AS：Transgenic AS；IR：Transgenic IR.)

2.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)

由圖5可以看出，在培養(yǎng)周期內(nèi)，野生與轉(zhuǎn)基因藻株的最大光能轉(zhuǎn)化效率Fv/Fm、實(shí)際量子產(chǎn)量Yield在第8天之前差別不大，但第8天之后野生藻株顯著高于轉(zhuǎn)基因藻株。野生與轉(zhuǎn)基因藻株的光化學(xué)淬滅qP沒有顯著差異，而非光化學(xué)淬滅NPQ轉(zhuǎn)基因藻株在第4～9天顯著低于野生藻株，但第10天開始恢復(fù)與野生藻株沒有顯著差別。總體來講，在培養(yǎng)周期內(nèi)，轉(zhuǎn)基因藻株的光合作用能力與野生藻株并沒有顯著差別(P>0.05)。

圖4 轉(zhuǎn)基因和野生型三角褐指藻生長曲線Fig.4 Comparisons of growth curves of the transgenic Phaeodactylum tricornutum and the wild type

(A:最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)；B：PSⅡ的實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率Yield；C：光化學(xué)淬滅qP；D：非光化學(xué)淬滅NPQ。A：Photochemical efficiency(Fv/Fm)；B：Actual photochemical efficiency of PSⅡYield；C：Photochemical quenching qP；D：Non-photochemical quenching NPQ.)

2.4 葉綠素和類胡蘿卜素含量

由圖6和7可以看出，轉(zhuǎn)基因藻株的葉綠素a和類胡蘿卜素含量均顯著高于野生藻株，說明轉(zhuǎn)基因改變了三角褐指藻的色素含量。

2.5 脂肪酸組成分析

由表2可以看出，3株藻的脂肪酸組成和含量差異顯著，轉(zhuǎn)基因藻株的C14∶0和C16∶3相對含量顯著低于野生藻株, 而C16∶0、C16∶1相對含量顯著高于野生藻株。其中，轉(zhuǎn)基因藻株AS和 IR的C16與C18之和分別占到了總脂肪酸的66.9%和68.89%，較對照組分別提高了19.4%和22.97%，說明轉(zhuǎn)基因改變了三角褐指藻的脂肪酸組成。

圖6 轉(zhuǎn)基因和野生型三角褐指藻葉綠素a相對含量Fig.6 Chlorophylla contents in the transgenic Phaeodactylum tricornutum and the wild type

圖7 轉(zhuǎn)基因和野生型三角褐指藻類胡蘿卜素相對含量Fig.7 Carotenoids contents in the transgenic Phaeodactylum tricornutum and the wild type

表2 RNA干擾對三角褐指藻脂肪酸組成的影響 /%Table 2 The influence of RNA interference on the fatty acid composition of Phaeodactylum tricornutum

注：a、b、c分別表示方差分析差異程度，同一列中有相同字母的組之間差異不顯著(P>0.05)。NT：未檢測到；Others：其他未標(biāo)定的脂肪酸。

Note:Values in the same row with the same superscripts are not significantly different(P>0.05). NT：Not detected. Others：Other fatty acids without calibration.

2.6 金藻昆布多糖，蛋白質(zhì)，總脂含量和生物量

由表3可以看出，轉(zhuǎn)基因和野生藻株的金藻昆布多糖，蛋白質(zhì)，總脂含量有顯著的差異，而生物量并沒有明顯差別。

3 討論

金藻昆布多糖是硅藻的主要能量儲存性多糖，其生化合成路徑目前仍沒有被闡明[19]。我們前面的研究表明，UGPase是三角褐指藻金藻昆布多糖合成的限速酶，在其生物合成及碳流分配中發(fā)揮重要作用[2]，但碳流如何分配，碳流分配的去向等并沒有深入研究。本文以RNA干擾UGP表達(dá)的三角褐指藻為對象，研究表明，UGPase在金藻昆布多糖合成中發(fā)揮非常重要的作用，在碳流分配中主要引導(dǎo)碳流轉(zhuǎn)向脂類合成，還有一部分碳流合成了蛋白和色素，同時，脂肪酸的組成也發(fā)生了明顯改變。

表3 轉(zhuǎn)基因和野生藻株的金藻昆布多糖、蛋白質(zhì)、總脂含量和生物量Table 3 Chrysolaminarin,protein,total lipids and biomass in the transformantsand the wild type

注：a、b、c分別表示方差分析差異程度，同一列中有相同字母的組之間差異不顯著(P>0.05)。

Note: Values in the same row with the same superscripts are not significantly different(P>0.05).

由圖2和3可以看出，轉(zhuǎn)基因藻株(AS和IR)UGP相對表達(dá)量降低伴隨著UGPase活性下降，酶活性下降伴隨著金藻昆布多糖合成的減少，而且，酶活性下降的越多，金藻昆布多糖合成越少，二者呈明顯的正相關(guān)(見表2)。上述結(jié)果進(jìn)一步表明，UGPase是三角褐指藻金藻昆布多糖合成的限速酶，在其生物合成中發(fā)揮非常重要的作用，這與我們前面的研究結(jié)果是一致的[2]。

到目前為止，微藻和油料作物針對提高甘油三酯(TAG)的基因工程，主要集中在調(diào)控脂類合成路徑中的關(guān)鍵酶基因，很少見到通過改變碳流分配提高油脂合成能力的相關(guān)研究。Li等[20]報(bào)道，由于抑制了萊茵衣藻(Chlamydomonas)淀粉合成缺陷突變體腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)的活性，導(dǎo)致TAG的合成量較野生藻株提高了10倍，這說明為了提高油脂含量，將碳流由淀粉引向脂類合成是比直接調(diào)控脂類合成路徑更加有效的策略。本研究中，由于抑制了UGPase的活性，藻株AS金藻昆布多糖含量下降25.7%，總脂含量上升13.2%；藻株IR金藻昆布多糖含量下降40.7%，總脂含量上升25.2%，進(jìn)一步說明調(diào)控三角褐指藻金藻昆布多糖合成是提高油脂含量的有效方法，這與我們前面的研究也是一致的[2]。

微藻的脂肪酸組成是衡量生物柴油質(zhì)量的重要指標(biāo)，C16與C18之和已經(jīng)用來評價(jià)生物柴油的質(zhì)量[21]。本研究中，由于抑制了UGPase的活性，不但油脂含量明顯提高，也改變了脂肪酸的組成和含量，特別需要指出的是，轉(zhuǎn)基因藻株AS和IR的C16與C18之和分別占到了總脂肪酸含量的66.9%和68.89%，較對照組分別提高了19.4%和22.97%，而EPA的含量卻顯著降低(見表3)，因此，抑制UGP表達(dá)的轉(zhuǎn)基因藻株的脂肪酸組成更適合生物柴油的生產(chǎn)。本文首次報(bào)道，抑制UGP表達(dá)改變了三角褐指藻的脂肪酸組成，可能是由于碳流轉(zhuǎn)向脂類合成，刺激了脂肪酸合成相關(guān)酶的活性，但具體的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

UGPase是否在碳流分配中發(fā)揮作用，一些研究者在不同物種中進(jìn)行了相關(guān)研究。Coleman等[22]報(bào)道，在小黑楊(Hybridpoplar)中過表達(dá)UGP，改變了淀粉和纖維素之間的碳流分配；Wang等[23]在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中表達(dá)了來自棉花的UGP，發(fā)現(xiàn)UGPase在碳流分配，特別是在纖維素的生物合成過程中發(fā)揮重要作用；Weselake等[24]提出，有關(guān)油脂積累的實(shí)驗(yàn)，應(yīng)考慮碳流分配對蛋白質(zhì)合成的影響；我們前面的研究也表明，UGPase在三角褐指藻的碳流分配中發(fā)揮重要作用[2]。但是，碳流如何分配，碳流分配的去向等上述研究并沒有涉及。本研究中，抑制UGP的表達(dá)，金藻昆布多糖的合成顯著降低，碳流轉(zhuǎn)向脂類、蛋白及色素的合成(見表3，圖6和7)，藻株AS金藻昆布多糖含量降低25.70%，蛋白質(zhì)含量上升3.80%，總脂含量提高了13.2%；藻株IR的金藻昆布多糖含量降低40.70%，蛋白質(zhì)含量上升8.30%，總脂含量增加了25.20%，這些結(jié)果表明，在終生物量沒有明顯減少的情況下，抑制UGP的表達(dá)，導(dǎo)致三角褐指藻光合作用固定的碳更多轉(zhuǎn)向油脂的合成，其次是蛋白和色素。由于在藻類中，色素種類很多，本研究只測定了葉綠素a和類胡蘿卜素的含量變化，因此，碳流到底有多大比重轉(zhuǎn)向色素的合成還需要進(jìn)行系統(tǒng)研究。

葉綠素?zé)晒馐枪夂献饔玫牧己弥笜?biāo)和探針，通過對各種熒光參數(shù)的分析，可以得到有關(guān)光能利用的信息[25]。為了檢測轉(zhuǎn)基因?qū)υ寮?xì)胞生長及光合作用的影響，本研究測定了各項(xiàng)葉綠素?zé)晒鈪?shù)和終生物量。由圖5可以看出，最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)、實(shí)際量子產(chǎn)量(Yield)在第8天之前沒有顯著差別，但第8天之后野生藻株顯著高于轉(zhuǎn)基因藻株；qP(光化學(xué)淬滅，反映光合活性高低)沒有顯著差別，轉(zhuǎn)基因藻株的NPQ(非光化學(xué)淬滅，反映植物的光保護(hù)能力)在第4至第9天顯著低于野生藻株，但第10天開始恢復(fù)與野生藻株沒有顯著差別?？傮w來講，在培養(yǎng)周期內(nèi)，轉(zhuǎn)基因藻株的光合作用能力與野生藻株并沒有顯著差別，體現(xiàn)在生長方面，它們之間的細(xì)胞密度和終生物量也沒有顯著差別(見圖4，表3)，說明金藻昆布多糖合成減少沒有影響三角褐指藻的生長，這與一些學(xué)者的報(bào)道不同，他們認(rèn)為轉(zhuǎn)基因影響生長，生長速率降低[20,26]，但到目前為止，具體的機(jī)制還有待深入研究。

4 結(jié)語

本研究進(jìn)一步闡明了UGPase在三角褐指藻金藻昆布多糖合成中的重要作用，在光合固碳沒有明顯減少的情況下，抑制UGP的表達(dá)，三角褐指藻光合作用固定的碳更多轉(zhuǎn)向油脂的合成，其次是蛋白和色素，為通過基因工程提高油脂含量提供了一條新的思路。

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責(zé)任編輯 朱寶象

Effectof RNA Interference ofUGP-Glucose Pyrophosphorylase Gene Expression Oncarbon Allocation inPhaeodactylumtricornutum

ZHU Bao-Hua1, CHANG Ya-Qing1, HE Wen-Dong1, YANG Guan-Pin2, LI Yun1, PAN Ke-Hou1,3

(1.Key Laboratory of Mariculture (Ocean University of China), Ministry of Education, Qingdao 266003, China;2.College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003, China;3.Laboratory for Marine Fisheries and Aquaculture,Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266237, China)

Diatom are unicellular, photosynthetic and eukaryotic microalgae, which are responsible for around 40% of the total carbon fixation in oceans. Chrysolaminaran is the main energy storage polysaccharide of diatom. To date, the biosynthetic pathway of chrysolaminaran has not been fully elucidated inPhaeodactylumtricornutum. This species has a fully sequenced genome and a perfect transgenic platform, making it feasible to exogenously trigger RNA-mediated silencing in this alga. UDP-glucose pyrophosphorylase (UGPase) catalyzes the reversible production of UDP-glucose and pyrophosphate (PPi) from glucose-1-phosphate (G-1-P) and UTP. It is a key enzyme in carbohydrate metabolism, playing an important role in carbon partitioning. In order to study the mechanism of UGPase in regulating carbon partitioning, the contents of chrysolaminarin, protein and total lipid were measured in transgenicP.tricornutumwith the expression UGP genesuppressed, and compared with those of the wild. The measured and compared included also chlorophyll fluorescence parameter and fatty acid composition. Our results showed that maximal photochemical efficiency (Fv/Fm) of transgenicP.tricornutumwas significantly lower than that of the wild after the eighth day of cultivation, but their biomass was not significantly different. The C16 and C18 series contents of the two transgenic strains (AS and IR) accounted for 66.9% and 68.89% of the total, increased by 19.40% and 22.97% in comparison with those of the wild, respectively. Our findings indicated that suppression of UGP gene changed the fatty acid metabolism ofP.tricornutum.Chrysolaminarin, protein and total lipid of transgenic strains (AS and IR) were significantly different from those of the wild. The content of chrysolaminarin decreased by 25.70%, and the contents of protein and total lipid increased by 3.80% and 13.20% in transgenic strain AS. Nevertheless, the content of chrysolaminarin decreased by 40.70%, the contents of protein and total lipid increased by 8.30% and 25.2% in IR. The results of the study showed that RNA interference on UGPgene expression had altered carbon allocation and fatty acid composition ofP.tricornutum.Biomass changed little; however more carbon captured during photosynthesis had turned to lipid synthesis. This study has further revealed the carbon allocation mechanism of RNA interference on UGP gene expression inP.tricornutum, which will provide a novel avenue for improving the total lipid in microalgal cellsand lay the foundation for a complete understanding of the chrysolaminarin biosynthesis pathway.

P.tricornutum; biodiesel; RNA interference; UGPase; fatty acid; carbon allocation

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013AA065801；2014AA022001)資助 Supported by National High Technology Research and Development Projects (2013AA065801；2014AA022001)

2016-09-09；

2016-11-23

朱葆華(1971-)，男，副教授，主要從事微藻生理、生化與分子生物學(xué)方面的研究。E-mail：zhubaohua@ouc.edu.cn

?? 通訊作者：E-mail：qdkhpan@126.com

Q756；S917

A

1672-5174(2017)05-042-08

10.16441/j.cnki.hdxb.20160316

朱葆華，常雅青，何文棟，等.RNA干擾UGP基因表達(dá)對三角褐指藻碳流分配的影響[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2017, 47(5): 42-49.

ZHU Bao-Hua, CHANG Ya-Qing, HE Wen-Dong, et al.Effectof RNA interference ofUGP-glucose pyrophosphorylase gene expression oncarbon allocation inPhaeodactylumtricornutum[J].Periodical of Ocean University of China, 2017, 47(5): 42-49.