何強亮 劉元獻 楊龍 吳新風 連純利 胡鎮(zhèn) 劉媛媛 熊雅嵐

慢性咽炎動物模型的建立及相關(guān)指標觀察分析*

何強亮2劉元獻1楊龍1吳新風3連純利1胡鎮(zhèn)2劉媛媛2熊雅嵐2

目的 采用化學刺激法建立慢性咽炎動物模型，評價各指標與模型間的相關(guān)性。方法16只新西蘭兔隨機分為兩組，模型組在第1～15天予2.5%氨水噴咽，第8天于咽部注射松節(jié)油處理；空白組在第1～15天予蒸餾水局部處理。期間，觀察比較兩組動物行為學及體重變化。第16天，所有動物均從耳靜脈抽取血標本，然后用空氣注射法處死動物，立即取咽黏膜供病理組織學觀察。結(jié)果模型組行為學、病理形態(tài)學指標造模前后變化明顯，體重變化值具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），空白組各項指標無明顯變化。兩組血液各項生化指標差異比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論化學刺激法成功建立了慢性咽炎動物模型，行為學、體重及病理形態(tài)學指標評價模型有一定參考價值。

慢性咽炎；動物模型；制備方法；評價指標

慢性咽炎為咽部黏膜、黏膜下及其淋巴組織的慢性炎癥。彌漫性炎癥常為上呼吸道慢性炎癥的一部分；局限性炎癥則多為咽淋巴組織的炎癥；臨床上主要表現(xiàn)為咽部不適感（異物感、灼熱感、刺激感等），時有咽癢、咳嗽等，是一種常見病、多發(fā)病[1]。目前，對于慢性咽炎動物模型的評價指標的報道較少，缺乏規(guī)范性，結(jié)合臨床實際，考慮研究經(jīng)費等因素，筆者通過研究觀察分析兩組動物模型在行為學、血生化及病理形態(tài)學指標的變化，明確其對評價慢性咽炎動物模型的價值。

實驗過程

1 材料準備

普通級雌性新西蘭兔16只,體重2.0～2.5kg（廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供），25%～28%氨水（濟寧宏明化學試劑有限公司），蒸餾水（鄭州津北化工有限公司），25%～27%松節(jié)油（無錫市展望化工試劑有限公司，批號：150601）。

喉頭噴霧器（江蘇平安有限公司），XD-300冷光源（南京亞南特種照明電器廠）、0°硬性鼻內(nèi)鏡（日本制造BX43型生物顯微鏡），電子稱（廣東香山衡器集團有限公司）等。

2 實驗步驟

2.1 分組及處理

隨機將16只新西蘭兔平均分為兩組，模型組[2]：第1～15天，在兔子咽部噴以濃度為2.5%氨水，分上、下午各1次，每次3掀，第8天在其咽部注射0.5ml的松節(jié)油,第16天取于兔子耳部抽取靜脈血收集血樣本，再以空氣注射的方式處死并立即取下咽部黏膜及其組織作切片供病理觀察?？瞻捉M：第1～15天，在兔子咽部噴以蒸餾水，分上、下午各1次，每次3掀，第16天處理同模型組。

2.2 指標觀察

2.2.1 一般情況

通過觀察兔子口部抓痕情況，噴喉后半小時飲水情況，口咽部分泌物量的情況及每天的食量變化來評價兔子的精神狀態(tài)，于第15天在硬性鼻內(nèi)鏡下觀察造模組兔子的咽部黏膜情況。

2.2.2 血生化及病理形態(tài)學

在實驗第16天，于兔子耳緣靜脈處采用一次性采血針收取血樣本，分別置于血常規(guī)及肝腎功能試劑管中，存放于保溫箱中后立即送至廣東省醫(yī)學動物實驗中心檢測樣本指標的變化情況；用10%甲醛溶液固定取出的咽部黏膜及其組織，經(jīng)專業(yè)人員處理后，通過光學顯微鏡，觀察兩組兔子咽部組織各層的病理形態(tài)變化（由廣東省醫(yī)學實驗動物中心比較醫(yī)學實驗室承擔）。

3 統(tǒng)計學處理

實驗結(jié)果

1 一般情況

模型組：兔子整體精神狀態(tài)變化明顯；前7天，兔子整體的精神狀態(tài)較好，與空白組無明顯差異，但每次噴完氨水后，飲水量及頻次明顯增多，食量未見明顯變化，口腔可見少量分泌物；在注射松節(jié)油處理后，兔子整體精神狀態(tài)發(fā)生明顯變化，自主活動減少，表情淡漠，搔抓口部頻繁，飲水量及頻次明顯下降，食量明顯減少，口腔分泌物逐漸增多；松節(jié)油處理后的第4天各項情況表現(xiàn)最明顯，部分兔子口腔分泌物粘稠。第15天，通過硬性鼻內(nèi)鏡，觀察到兔子咽部黏膜呈暗紅色，光澤度欠佳，黏膜分泌物增多。

空白組：兔子整體精神狀態(tài)未發(fā)生明顯改變，實驗第1～15天，兔子整體精神狀態(tài)良好，自主活動正常，無搔抓口部等動作，飲水、食量前后無變化。第15天，通過硬性鼻內(nèi)鏡，觀察到兔子咽部黏膜淡紅、濕潤，表面光滑，無明顯充血、腫脹。

通過對比模型組兔子體重前后改變明顯，數(shù)據(jù)結(jié)果顯示模型組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），空白組兔子體重前后無明顯改變（P＞0.05）如表1。

表1 兩組兔子體重的對比（）

2 血生化指標

兩組兔子血常規(guī)結(jié)果中均有部分兔子各項指標接近正常、部分兔子結(jié)果中白細胞、中性粒細胞等高于正常值；兩組結(jié)果統(tǒng)計學檢測無明顯差異（P＞0.05），見表2；兩組兔子肝、腎功能結(jié)果基本均在正常值范圍，無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見表3。

表2 兩組兔子的血常規(guī)指標比較（）

表3 兩組兔子的肝、腎功能指標比較（）

3 病理表現(xiàn)

空白組：通過顯微鏡觀察，可見咽部組織各層分界清晰，由外到內(nèi)可見，黏膜下層為疏松結(jié)締組織，內(nèi)含豐富的腺體，腺體無增生和萎縮，黏膜層中的上皮層為未角化復(fù)層扁平上皮，固有層為致密結(jié)締組織，內(nèi)含少量血管，可見分泌腺導管（圖1）。

圖1 空白組

討論

慢性咽炎發(fā)病率高，病程長，易反復(fù)，難治愈，發(fā)病率占到咽喉部疾病的10%～12%，占耳鼻咽喉疾病的1%～4%；病毒、細菌感染及理化刺激等均可致??；其癥狀多種多樣，主要為咽不適感，咯痰、咳嗽等，影響患者的工作和生活，嚴重者可導致心理障礙,特別是抑郁、焦慮尤為突出[1]。目前，關(guān)于慢性咽炎的研究大多集中在臨床觀察等領(lǐng)域，對于相關(guān)的動物實驗等基礎(chǔ)研究較少；另一方面，對于慢性咽炎的診斷及治療，尚缺乏有效的藥物及治療方法，尤其在檢測手段上，相關(guān)文獻較少，且尚無明確統(tǒng)一的檢測標準。為此，開展慢性咽炎動物模型的相關(guān)研究是非常有必要的，通過動物建模的建立及相關(guān)指標的分析，明確這些指標與模型間的相關(guān)性，為后期實驗提供必要的數(shù)據(jù)支持。

在此之前，最早有成都中醫(yī)藥大學彭順林教授團隊開展的慢性咽炎動物模型及病理學的研究，為慢性咽炎的建模提供了理論依據(jù)[2]；之后，深圳市中醫(yī)院劉元獻教授在此基礎(chǔ)上開展了中藥噴喉治療慢性咽炎動物模型的研究[3]，進一步拓展了此領(lǐng)域的研究。但在模型的指標的評價及標準，尚未在醫(yī)學領(lǐng)域達成統(tǒng)一的共識，為此進一步開展相關(guān)的基礎(chǔ)研究十分有必要。

模型組：通過顯微鏡觀察，可見咽部黏膜上皮呈釘狀突增生，部分上皮脫落、壞死，黏膜下層和固有層黏膜水腫，炎性細胞浸潤明顯，其中主要以淋巴細胞、嗜酸性粒細胞為主，部分小血管增生擴張，黏膜下層內(nèi)黏液腺分泌活躍（圖2）。

圖2 模型組

炎癥根據(jù)病因可分為感染性炎癥、非特異性炎癥及變態(tài)反應(yīng)性炎癥，慢性咽炎屬于非特異性炎癥。因此，在確立觀察指標上，我們依據(jù)非特異性炎癥反應(yīng)的3個時相（即以局部血管擴張、毛細血管通透性增加為特征的急性時相；以白細胞、巨噬細胞浸潤為特征的亞急性時相；以組織變性和纖維化為特征的慢性增殖相），以期確立了慢性咽炎動物模型相關(guān)評價指標，更加系統(tǒng)化、規(guī)范化；同時，在觀察方法上，我們采用臨床使用的硬性鼻內(nèi)鏡直接觀察咽部情況，更加接近臨床，為本實驗的一大亮點。在查閱近20年相關(guān)資料，慢性咽炎實驗動物多為大鼠及兔子，造模方法主要有氨水直接噴霧法、氨水定點定量涂抹法、氨水+松節(jié)油法等以化學物質(zhì)刺激致炎。參考以往的實驗研究，我們選取兔子作為實驗對象，采取氨水+松節(jié)油化學物質(zhì)刺激的方法確保了實驗的可行性。

根據(jù)咽炎的發(fā)病機制，通常在化學刺激的一周內(nèi)會產(chǎn)生急性咽炎的表現(xiàn)，如不加以干涉，部分兔子會在一周內(nèi)自行恢復(fù)正常，因此我們將造模時間確定在2周，反復(fù)刺激確保慢性咽炎模型的成功。急性期（通常1周內(nèi)）可見：黏液分泌逐漸增多、咽部黏膜充血、腫脹呈鮮紅色等現(xiàn)象；咽部組織炎性變化明顯，黏膜下彌漫性炎癥細胞浸潤、局部潰瘍、鱗狀上皮明顯增生。之后反復(fù)刺激，進展成為慢性咽炎，可見咽部黏膜炎性細胞浸潤、水腫，上皮層發(fā)生輕度增生性改變，釘狀突延長，固有膜內(nèi)見散在彌漫性炎細胞浸潤，血管擴張明顯，黏膜下層內(nèi)黏液腺分泌較多，漿內(nèi)含大量分泌顆粒[4]。

筆者通過實驗觀察發(fā)現(xiàn)，與體積小、敏感性強的大鼠比較，具有體積大、性格溫順等優(yōu)點的兔子模型在日常管理、標本采集及病理形態(tài)改變等方面，都優(yōu)于以往的大鼠模型。經(jīng)有效化學刺激使之產(chǎn)生炎癥，炎癥反應(yīng)會產(chǎn)生一系列的炎癥因子，模型組兔子在行為學方面產(chǎn)生一系列的改變：體重減輕，飲水量、自發(fā)活動、搔抓口部活動、口腔分泌物均明顯增多，與空白組產(chǎn)生對照；病理學表現(xiàn)為咽部黏膜上皮呈釘狀突增生，部分上皮脫落、壞死，黏膜下層和固有層黏膜水腫，炎性細胞浸潤明顯，其中主要以淋巴細胞、嗜酸性粒細胞為主，部分小血管增生擴張，黏膜下層內(nèi)黏液腺分泌活躍，這些陽性指征對于評價造模的成功具有參考價值。從血生化結(jié)果分析，兩組兔子在血常規(guī)及肝、腎功能結(jié)果無明顯差異，對于臨床診斷無明顯參考意義，這可能與慢性咽炎的發(fā)病機制及個體自身免疫功能相關(guān)[5]，在炎癥刺激的急性期及亞急性期，主要改變表現(xiàn)為局部血管擴張、毛細血管通透性改變；同時血液中白細胞等炎細胞浸潤為主，肝功能無明顯變化[6]，反復(fù)刺激后發(fā)展成為慢性炎癥，加之自身的免疫機制，血液學改邊恢復(fù)正常，具有一定的自限性。

本研究依據(jù)慢性咽炎的發(fā)病機制，以期確定評價慢性咽炎動物模型相關(guān)指標，結(jié)合臨床內(nèi)鏡觀察發(fā)現(xiàn)：在慢性咽炎動物模型研究中，行為學、體重及病理學形態(tài)學相關(guān)指標具有一定的參考價值；相關(guān)血生化結(jié)果（血常規(guī)、肝腎功能）無明顯差異性，進一步明確了相關(guān)實驗數(shù)據(jù)的價值，為后期藥物實驗提供可靠的實驗?zāi)Ｐ图坝行У臄?shù)據(jù)支撐。

1 黃兆選,等.實用耳鼻咽喉頭頸外科學[M].2版.北京：人民衛(wèi)生出版社,北京：2007:317-319.

2 彭順林,鐘渠,熊大經(jīng).慢性咽炎動物模型研究[J].成都中醫(yī)藥大學學報,1999,22(1):51-53.

3 劉元獻,李許娜,吳新風,等.天竺霧化劑對慢性咽炎動物模型的行為學及病理形態(tài)學觀察[J].中國中西醫(yī)結(jié)合耳鼻咽喉科雜志,2016,24(3):164-167.

4 薛淑媛,朱丹,姚興鳳,等.急、慢性咽炎動物實驗研究概況[J].北方藥學,2016,13(10):121-122.

5 阮巖,陳蔚.清咽噴霧劑改善免疫功能的實驗研究[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學雜志,2006,12(3):185-186.

6 梁璐,樸晉華,馬建麗.急性和慢性咽炎的發(fā)病機制與動物模型建立的研究現(xiàn)狀[J].臨床醫(yī)藥實踐,2012,21 (7)：540-543.

（收稿：2016-10-12 修回：2016-11-02）

Establishment of animalmodelw ith chronic pharyngitis and indexes analysis associated with model evaluation

HE Qiangliang，LIU Yuanxian,YANG Long,WU Xinfeng,LIAN Chunli,HU Zhen,LIU Yuanyuan,XIONG Yalan
Departmentof Otolaryngology,Shenzhen Municipal TCM Hospital Affiliated to Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangdong,518033,China

ObjectiveTo establish?an animalmodel of chronic pharyngitis?via chemical stimulus to investigate the correlation of associated indexes with the model evaluation based on an experimental study.MethodsSixteen New Zealand rabbits were randomly divided into two groups.Animals inmodel group(MG)were treated by 2.5%ammonia spraying into pharyngeal cavity from the first day to the fifteenth day,twice one day,and with turpentine oil injected into the submucous tissue of the pharynx by the 8th day,while those animals in blank group(BG)were treated only by distilled water sprayed into pharyngeal cavity in the same way. Then,observed comparatively were the changes in behavior and body weight during the whole experimental period.By the 16th day, blood sampleswere collected from auricular vein among all animals of the two groups through at first,and then,these rabbitswere put into death by air injection method to take tissue samples from pharyngeal mucosa for pathohistological observation.ResultsThe changes in the indexes of behavior and pathohistology were very significant among the animals of MG,when compared thosemeasured by the end of experimentwith thatbefore treating,particularly for that of body weight(P＜0.05).However,these indexes showed little changes among animals of BG,with no significantly statistical significance(P＞0.05).Moreover,no significant differences were seen in the changes of serum biochemical indexes in the two groups of animals during the whole period of experiment(P＞0.05).ConclusionAnimalmodel of chronic pharyngitis is successfully established?through chemical stimulus to pharyngealmucosa.Such indexes as changes taking place in behavior,body weight and pathohistology hold certain reference value for evaluating the effectiveness of the model.

Chronic pharyngitis;Animalmodel;Model establishingmethods;Effectiveness evaluating indexes

10.16542/j.cnki.issn.1007-4856.2017.01.005

廣東省中醫(yī)藥管理局面上項目（20132025）

1 廣州中醫(yī)藥大學附屬深圳市中醫(yī)院耳鼻咽喉科（）

2 廣州中醫(yī)藥大學在讀碩士研究生

3 深圳市羅湖區(qū)中醫(yī)院耳鼻咽喉科

劉元獻,主任醫(yī)師.Email:Liuyx2011@126.com