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        驗(yàn)證活細(xì)胞膜選擇透過(guò)性的簡(jiǎn)易方法

        2017-04-09 01:31:22崔榮榮何奕騉郭琪琦
        生物學(xué)通報(bào) 2017年12期
        關(guān)鍵詞:實(shí)驗(yàn)

        崔榮榮 何奕騉 郭琪琦

        (1首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 北京 100048 2深圳市第二實(shí)驗(yàn)學(xué)校 廣東深圳 518021)

        細(xì)胞膜又稱細(xì)胞質(zhì)膜,是指圍繞在細(xì)胞最外層,主要由脂類和蛋白質(zhì)組成的一層極薄的膜。細(xì)胞膜不僅是細(xì)胞結(jié)構(gòu)的邊界,使細(xì)胞具有一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)部環(huán)境,同時(shí)在細(xì)胞與環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)換,以及信息傳遞過(guò)程中也起著決定性的作用。細(xì)胞膜是細(xì)胞與周圍環(huán)境進(jìn)行選擇性物質(zhì)交換的屏障與通路[1]。可以說(shuō)認(rèn)識(shí)整個(gè)細(xì)胞乃至生命體從細(xì)胞膜開始。

        細(xì)胞膜是選擇透過(guò)性膜,大分子物質(zhì)不能通過(guò)活細(xì)胞膜。細(xì)胞膜控制物質(zhì)進(jìn)出這一重要功能,在高中生物學(xué)概念體系中非常關(guān)鍵,有利于學(xué)生理解細(xì)胞膜的選擇透過(guò)性這一重要概念,同時(shí)幫助學(xué)生理解細(xì)胞膜是系統(tǒng)的邊界。中學(xué)教師和學(xué)生對(duì)于臺(tái)盼藍(lán)試劑有所耳聞,“臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)”也多次作為高中試題的考查材料,但具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程和實(shí)驗(yàn)結(jié)果并未見相關(guān)報(bào)道。同時(shí)實(shí)驗(yàn)中需要運(yùn)用活細(xì)胞系,由于一般學(xué)校沒有細(xì)胞培養(yǎng)室,單個(gè)的動(dòng)物活細(xì)胞不便于培養(yǎng)和獲取。筆者運(yùn)用高校資源,根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康母倪M(jìn)了大學(xué)教材中 “臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)”,通過(guò)實(shí)證研究設(shè)計(jì)并記錄實(shí)驗(yàn)過(guò)程,展示具體直觀的過(guò)程與結(jié)果,填補(bǔ)了高中教材中大分子物質(zhì)不能隨意進(jìn)出細(xì)胞膜的實(shí)驗(yàn)空缺,為細(xì)胞膜控制物質(zhì)尤其是大分子物質(zhì)進(jìn)出提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),驗(yàn)證了活細(xì)胞膜具有控制物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞的功能,為高中教師開展教學(xué)提供教學(xué)參考資料。

        1 實(shí)驗(yàn)材料

        1.1 主要試劑 濃度0.4%臺(tái)盼藍(lán)50 mL。臺(tái)盼藍(lán)(Trypan Blue)或稱臺(tái)盼蘭、錐蟲藍(lán)、曲利苯藍(lán)。分子式:C34H24N6O14S4Na4,分子量:960.82,屬于大分子物質(zhì),無(wú)法隨意進(jìn)出活細(xì)胞膜。因此它可以作為細(xì)胞活性染料,常用于檢測(cè)細(xì)胞膜的完整性[3]。一般細(xì)胞膜完整性發(fā)生改變,會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此臺(tái)盼藍(lán)也常用于檢測(cè)細(xì)胞是否存活?;罴?xì)胞不會(huì)被染成藍(lán)色,而死細(xì)胞會(huì)被染成淡藍(lán)色。冰甲醇:-20℃預(yù)冷的濃度100%的甲醇,常被用作細(xì)胞固定液。通過(guò)結(jié)合蛋白質(zhì)形成沉淀,使得蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)變性,從而改變細(xì)胞膜的通透性,同時(shí)固定保持細(xì)胞形態(tài),便于染色觀察。由于蒸餾水不能調(diào)節(jié)鹽平衡,會(huì)破壞生物蛋白的結(jié)構(gòu)及生物特性,生理鹽水不能調(diào)整pH,對(duì)完整的、具有活性的物質(zhì)不能保證其在最適條件下參與生物反應(yīng),而磷酸緩沖鹽溶液(PBS)具有鹽平衡、可調(diào)整的適宜pH緩沖作用,一般用PBS稀釋有活性的生物制劑。本實(shí)驗(yàn)用PBS作為沖洗液。

        1.2 細(xì)胞株及常規(guī)培養(yǎng) 骨肉瘤細(xì)胞株 (U-2OS),由首都師范大學(xué)生科學(xué)動(dòng)物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室提供。該細(xì)胞的特點(diǎn)是細(xì)胞核大,細(xì)胞形態(tài)圓潤(rùn),實(shí)驗(yàn)效果明顯。接種細(xì)胞之前在培養(yǎng)孔里加入蓋玻片,將細(xì)胞接種于蓋玻片上,使細(xì)胞在蓋玻片上貼壁培養(yǎng),這樣設(shè)計(jì)便于實(shí)驗(yàn)處理之后,直接將蓋玻片扣在載玻片上進(jìn)行制片觀察。在培養(yǎng)孔中加入血清和雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基,37℃,CO2培養(yǎng)濃度為5%,培養(yǎng)密度 5×105,培養(yǎng)24 h。單層細(xì)胞均勻覆蓋在蓋玻片表面,細(xì)胞狀態(tài)健康。

        2 實(shí)驗(yàn)步驟

        2.1 冰甲醇固定壞死處理 用壓力泵吸除骨肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)基后,PBS清洗殘留培養(yǎng)基。將載有細(xì)胞的蓋玻片分為左、右2個(gè)部分,左邊細(xì)胞作為對(duì)照組,保持活性;右邊作為實(shí)驗(yàn)組,用一小滴冰甲醇處死并固定細(xì)胞,時(shí)間控制在5 s即可,用PBS沖洗2~3遍,盡量不污染活細(xì)胞。

        2.2 貼壁細(xì)胞的原位臺(tái)盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn) 吸除培養(yǎng)盤中多余的PBS,在蓋玻片左右2個(gè)部分都滴加臺(tái)盼藍(lán),完全覆蓋細(xì)胞,同時(shí)進(jìn)行染色,室溫染色約3 min即可,吸除臺(tái)盼藍(lán),用PBS沖洗染料2~3次。立即制作裝片觀察并拍照。

        3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

        3.1 結(jié)果 未經(jīng)冰甲醇處理的細(xì)胞,細(xì)胞膜完整,不能被臺(tái)盼藍(lán)染色(見圖1,本文附圖見插頁(yè)2);經(jīng)過(guò)冰甲醇處理的細(xì)胞,細(xì)胞膜喪失完整性,被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色(見圖2)。圖3則顯示了實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組對(duì)照實(shí)驗(yàn)交界處,對(duì)比明顯(圖1~圖3均為物鏡40倍下觀察,圖片比例尺20 μm)。

        3.2 討論 經(jīng)過(guò)冰甲醇處理,細(xì)胞膜的通透性變大,失去控制物質(zhì)進(jìn)出的能力,大分子物質(zhì)臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)入細(xì)胞,使得細(xì)胞染上藍(lán)色。未經(jīng)冰甲醇處理的細(xì)胞,細(xì)胞膜完整,臺(tái)盼藍(lán)分子不能進(jìn)入染色。

        此次動(dòng)物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新之處在于借鑒了傳統(tǒng)的臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)中試劑的使用,但在此基礎(chǔ)上大膽進(jìn)行了改進(jìn),尤其是在實(shí)驗(yàn)操作和新試劑的使用方面。實(shí)驗(yàn)試劑濃度和實(shí)驗(yàn)時(shí)間經(jīng)過(guò)多次摸索得出,可重復(fù)。實(shí)驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)在于:

        1)未將貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞用胰蛋白酶消化下來(lái),直接在細(xì)胞貼壁原位進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。原實(shí)驗(yàn)胰蛋白酶消化細(xì)胞會(huì)對(duì)細(xì)胞的活性有很大影響,酶反應(yīng)的時(shí)間不可控,時(shí)間過(guò)短消化出的細(xì)胞較少。時(shí)間較長(zhǎng),對(duì)細(xì)胞有毒性作用,會(huì)破壞細(xì)胞膜上的糖蛋白,導(dǎo)致細(xì)胞死亡過(guò)多,影響實(shí)驗(yàn)效果。

        2)創(chuàng)造性地運(yùn)用冰甲醇固定液,破碎細(xì)胞膜同時(shí)固定死細(xì)胞。原臺(tái)盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn),破膜嚴(yán)重的細(xì)胞多次沖洗后會(huì)飄走,原位實(shí)驗(yàn)不改變細(xì)胞的位置,直接處理,操作簡(jiǎn)便,效果明顯。

        3)將細(xì)胞直接種植在蓋玻片上,并根據(jù)對(duì)照原則將蓋玻片上長(zhǎng)勢(shì)相同的細(xì)胞分為左、右2個(gè)部分,一部分做破膜處理,一部分保持活性,同時(shí)染色,顯微鏡下直接對(duì)比,結(jié)果更明顯。

        4)在細(xì)胞染色后用重懸液PBS進(jìn)行漂洗,洗去浮色后,在顯微鏡下觀察,這個(gè)步驟優(yōu)化了臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)。原實(shí)驗(yàn)在觀察細(xì)胞染色情況時(shí),直接吸取混有臺(tái)盼藍(lán)溶液的細(xì)胞液,直接觀察,視野整體藍(lán)色,不利于觀察細(xì)胞染色情況。

        實(shí)驗(yàn)的不足在于實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞材料不易獲得;同時(shí)細(xì)胞在脫離了適宜的培養(yǎng)環(huán)境時(shí),死亡較快,因此對(duì)實(shí)驗(yàn)者的操縱技能要求較高。鑒于實(shí)驗(yàn)結(jié)果明顯,可以為中學(xué)教師教學(xué)提供參考。

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