亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        基因組編輯技術及在病毒基因治療的應用

        2017-04-09 00:39:01鐘艷君
        生物化工 2017年5期

        鐘艷君

        (上海泰因生物技術有限公司,上海 201400)

        基因組編輯技術及在病毒基因治療的應用

        鐘艷君

        (上海泰因生物技術有限公司,上海 201400)

        基因組編輯技術是對基因組進行切割、修飾的一種發(fā)展迅速的技術。隨著鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄激活效應因子核酸酶(TALEN)、CRISPR-Cas9系統(tǒng)三大基因組編輯技術的相繼開發(fā),基因組編輯技術得到飛速的發(fā)展,在基因治療方面開辟了一條新的道路。本文綜述了基因組編輯技術及在病毒基因療法的應用現(xiàn)狀。

        ZFN;TALEN;CRISPR-Cas9;病毒治療

        基因組編輯是一種精確修飾基因的技術,并在近年發(fā)展迅速,它可以對基因的多位點及小片段進行融合、突變及刪減等,可在基因組水平上進行精確的基因修改。在科研領域,對構建模式動物,可以節(jié)約大量人力和財力,在醫(yī)療領域,對疾病發(fā)病機理和基因功能的探索,可以通過基因組編輯技術更加準確、深入地了解,并且可以改造基因,達到基因治療的目的等。因此,基因組編輯技術的發(fā)展前景及應用價值非常廣泛。隨著鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄激活效應因子核酸酶(TALEN)、CRISPR-Cas9系統(tǒng)三大基因組編輯技術的相繼開發(fā),基因組編輯技術得到飛速的發(fā)展和廣泛的應用。

        1 三大基因編輯技術

        1.1 鋅指核酸酶ZFN

        鋅指蛋白最早在非洲爪蟾中發(fā)現(xiàn),是所有后生動物中最常見的DNA序列。鋅指蛋白有-個重復結構域,每個結構域由30個氨基酸組成,并具有Cys2-His2,它們通過Zn2+穩(wěn)定結合形成手指狀結構,因此成為“鋅指蛋白”。鋅指蛋白每個手指上都有三四個堿基,幾個手指串聯(lián)起來就成為具有高度特異性地識別DNA序列,因此,改造鋅指蛋白被廣泛引用到靶基因的DNA識別中。鋅指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)又稱鋅指蛋白核酸酶,是一種經過人工改造的核酸內切酶,鋅指蛋白作為DNA識別域結合到一個非特異性內切酶上,由一個DNA識別域和一個非特異性核酸內切酶構成,其中DNA識別域賦予特異性,在DNA特定位點結合,而非特異性核酸內切酶賦剪切功能,兩者結合就可在DNA特定位點進行定點斷裂。

        根據(jù)不同的靶序列,需要設計8~10個鋅指結構域,將這些鋅結構域連在DNA核酸酶上,便可實現(xiàn)靶序列的雙鏈斷裂。Kim等利用相對簡單的模塊化和結構的調整,設計了第一個鋅指蛋白核酸酶,該酶使用3個具有公式序列的鋅指結構域蛋白與鋅指結構域鏈接一個FokI核酸酶的催化活性功能域,結構表明人工合成的ZFN可以特異性地識別切割靶位點。

        1.2 TALEN

        TALE(Transcription Activator-like Effector) 由Jens等人在黃單胞菌中發(fā)現(xiàn)。轉錄激活因子(TAL)效應是一種新的DNA幾何蛋白,它直接調控宿主的基因表達,在經由細菌遞送到宿主細胞中,TAL效應器進入細胞核,綁定在宿主基因啟動子特異性效應序列和活化轉錄。TALEN由一個包含核定位信號(Nuclear localization signal,NLS)N端結構域、一個包含可識別特定DNA序列的典型串聯(lián)TALE重復序列的中央結構域,以及一個具有FokI核酸內切酶功能的C端結構域組成。不同類型的TALEN元件識別的特異性 DNA序列長度有很大區(qū)別。一般來說,天然的TALEN元件識別的特異性DNA序列長度一般為17~18bp,而人工TALEN元件識別的特異性DNA序列長度則一般為14~20bp。

        1.3 CRISPR-Cas9系統(tǒng)

        CRISPR系統(tǒng)結構由一個Cas基因、一個前導序列、一個末端重復序列與CRISPR(捕獲的噬菌體或質粒核酸)組成。CRISPR序列能特異性識別外源核酸序列,作為向導RNA;CAS蛋白的非特異性核酸內切酶將外源核酸切斷,CAS9蛋白是一個分子質量很大的多功能蛋白,是一條雙鏈DNA酶,有兩個獨立的結構域,即HNH和RuvC,在剪切DNA鏈時,分別切割靶DNA的一條鏈。

        在CRISPR-Cas9系統(tǒng)中,酶Cas9在靶點DNA上進行切割。Cas9蛋白催化一種被稱作CRISPR RNA(crRNA)的RNA分子利用它的一部分序列與另一種被稱作tracr RNA的RNA分子通過堿基配對結合在一起,形成嵌合RNA(racrRNA/crRNA),Cas9蛋白在此過程中,起催化作用,促使crRNA成熟。借助crRNA的另一部分序列與靶DNA位點進行堿基配對,以這種形式來確定靶基因。這種嵌合RNA接著就能夠引導Cas9結合到這個靶點上進行切割,以降解入侵的噬菌體DNA或是外源質粒。

        1.4 三大基因編輯技術比較

        三大基因編輯技術工都是由兩部分組成,即DNA特異性識別結合域和核酸內切酶活性區(qū)域。ZNF和TALENS技術都是由一個二聚體與FokI核酸內切酶結構域相結合,而CRISPR-CAS9系統(tǒng)由一個單一的Cas9蛋白與嵌合RNA組成,序列特異性由RNA決定,裂解介導由Cas9蛋白完成。ZNF和TALEN在執(zhí)行基因編輯前,都需根據(jù)靶序列進行設計,ZFN的設計較為困難,因為鋅指蛋白與DNA之間的相互作用的復雜性質,以及特異性序列的進一步限制,使得設計良好的ZNF非常昂貴;而TALENS更易設計,因為有蛋白質之間的重復序列和核苷酸序列的一對一的識別規(guī)則,以及他們的結構已經能夠通過有效的。CRISPR-Cas9更為簡單,只需要修改識別RNA,便可識別不同的靶序列。

        理論上,ZFN可以針對任何序列,但在實踐中,ZFN對非特異性位點的切割的這一現(xiàn)象,會導致細胞毒性和基因毒性,因此ZFN的廣泛應用受到了制約。TALENS需要在第一位置有胸苷殘基,因此會有所限制,而且有時不能產生預期的突變,因此,每個TALEN都必須經過驗證。有研究表明,CRISPR-Cas9在高效靶向DNA編輯功能上,也會出現(xiàn)錯配、脫靶切割現(xiàn)象,目前已確認15個脫靶位點,并需繼續(xù)分析脫靶位點,以減少潛在的脫靶與錯配。盡管如此,相對于CRISPR-Cas9系統(tǒng),ZFN與TALENS有更多的脫靶活動,由此,CRISPR-Cas9系統(tǒng)還是具有絕對的優(yōu)勢。

        TALEN和CRISPR都是高效基因組編輯工具,但各有自身限制。TALEN對胞嘧啶甲基化敏感,而CRISPR對甲基化不敏感;TALEN的效率比CRISPR低,但TALEN導致脫靶突變的可能性更低,即使雙切口酶、截短了的guide RNAs和Cas9-Fok1融合體可提高CRISPR的特異性。

        2 基因組編輯技術在病毒基因治療的應用

        2.1 乙型肝炎病毒(HBV)治療

        乙型肝炎病毒(HBV)是一種DNA病毒,可導致肝硬化和肝癌的發(fā)生,給全球的人們帶來嚴重的疾病負擔,每年的感染人數(shù)也十分巨大。盡管現(xiàn)在有抗病毒藥物可以控制乙肝病毒,但不能完全清除,需要長期治療。由此通過徹底消除所有病毒復制中間體,特別是共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)成為一個新的治療方向[1]。2008年,kimberley等人第一個提出通過基因編輯方法來對付乙肝病毒復制。他們設計了6種不同的鋅指蛋白(ZFP)鎖定乙肝病毒增強子序列,在每個ZFP的存在下,病毒RNA被顯著降低,蛋白質水平顯著下降,細胞內病毒顆粒也顯著降低[2]。2013年,Kristie等人設計了4種TALEN針對病毒基因組內HBV特異性位點,首次證明介導有針對性的核酸酶可以是HBV中cccDNA中斷,表明,這些工程化核酸酶具有潛在的治療慢性HBV感染的用途[3]。世界各地的研究人員通過利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)來治療HBV感染,發(fā)現(xiàn)有非常大的可行性。Christoph Seeger等人發(fā)現(xiàn),90%以上的乙肝病毒DNA都能被Cas9切割,并證實CRISPR-Cas9系統(tǒng)在功能上讓HBV cccDNA失活,在慢性乙肝治療上是最好途徑[4]。在新研究中,研究人員利用CRISPR-Cas9系統(tǒng),對感染HBV病毒的哺乳動物肝細胞進行基因組編輯,他們靶向切割了HBV病毒cccDNA中的一些特異性位點,觀察到HBV總DNA和cccDNA下降了92%[5]。在相關研究中都表明,CRISPR-Cas9系統(tǒng)可以有效地去除感染者體內的HBV cccDNA,能用于乙肝的治療[6-7],是否能在未來體現(xiàn)實際的價值,還有待研究人員的繼續(xù)探索。

        2.2 HIV病毒治療

        另一種至今讓人無從下手的病毒就是HIV病毒,作為一種RNA病毒,HIV是一種逆轉錄病毒。當感染人細胞時,它會將自身的RNA逆轉錄為DNA后插入宿主基因組中以便復制和合成新的病毒顆粒。CCR5在病毒感染過程中起到重要的作用,ZFN和TALEN都是通過下調CCR5表達量阻斷病毒的感染。研究人員利用腺病毒載體攜帶針對人源CCR5的ZFN在體外敲除HIV-1感染所需的供受體CCR5,通過構建新型的重組核酸酶TALEN并將其靶向內源性的人類CCR5基因是,也同樣證實了其可行性[8]。CRISRP/Cas系統(tǒng)則最為直接的切除病毒基因。Ebian等人發(fā)現(xiàn)利用CRISPR-Cas9系統(tǒng),能夠破壞HIV-1原病毒,使HIV-1 LTR表達休眠,并能夠去除宿主細胞染色體內的病毒基因[9]。利用基因編輯技術首次成功地從活的動物基因組中切除HIV-1 DNA中的一端序列由美國天普大學劉易斯-卡茨醫(yī)學院的研究人員獲得。利用rAAV載體運送系統(tǒng)將CRISPR/Cas9分子運送到動物的血液后,HIV-1的特定DNA片段都被從病毒基因組中切除[10]。這一治療策略給治療HIV感染開辟了一條新的道路。

        3 結語

        基因編輯技術的應用非常廣泛,除了疾病的治療,在建立病毒基因庫、特異性位點標記都可以進行基因水平的研究。三大基因編輯技術都對生物研究及醫(yī)療領域有潛在的革新意義。為了發(fā)掘出這些技術的潛力,仍有許多重要的問題及挑戰(zhàn),如解決錯配、脫靶等現(xiàn)象,更快速、高效地進行基因編輯,以及更加深入的了解基因編輯技術都是未來需要研究的?;蚪M編輯技術在各個領域已占有相當重要的地位,在人類疾病研究中也已有出色的表現(xiàn),雖然現(xiàn)在仍在研究階段,但相信通過研究者們的不懈努力,會切實的應用到疾病的常規(guī)治療中,尤其是遺傳疾病及病毒治療。同時,對于現(xiàn)在發(fā)病率很高的癌癥,是否可以敲除人類的致癌基因,使人們遠離癌癥,都是值得研究和期望的。

        [1]Maepa MB,Roelofse I,Ely A,et al.Progress and Prospects of Anti-HBV Gene Therapy Development[J].Int J Mol Sci,2015,16(8):17589-17610.

        [2]Zimmerman KA,Fischer KP,Joyce MA,et al.Zinc Finger Proteins Designed to Specifically Target Duck Hepatitis B Virus Covalently Closed Circular DNA Inhibit Viral Transcription in Tissue Culture[J].J Virol 2008,82(16):8013-8021.

        [3]Bloom K,Ely A,Mussolino C,et al.Inactivation of Hepatitis B Virus Replication in Cultured Cells and in Vivo with Engineered Transcription Activator-like Effector Nucleases[J].Mol Ther,2013,21(10):1889-1897.

        [4]Seeger C,Sohn JA.Complete Spectrum of CRISPR/Cas9-induced Mutations on HBV cccDNA[J].Mol Ther,2016,24(7):1258-1266.

        [5]Ramanan V,Shlomai A,Cox DB,et al.CRISPR/Cas9 Cleavage of Viral DNA Efficiently Suppresses Hepatitis B Virus[J].Sci Rep,2015,5:10833-10841.

        [6]Zhen S,Hua L,Liu YH,et al.Harnessing the Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/CRISPR-associated Cas9 System to Disrupt the Hepatitis B Virus[J].Gene Ther,2015,22(5):404-412.

        [7]Zhu W,Xie K,Xu Y,et al.CRISPR/Cas9 produces anti-hepatitis B virus effect in hepatoma cells and transgenic mouse[J].Virus Res,2016,217:125-132.

        [8]季海艷,夏海濱.基于趨化因子受體CCR5阻斷HIV-1感染的方法[J].生命的化學,2013(1):34-40.

        [9]Ebina H,Misawa N,Kanemura Y,et al.Harnessing the CRISPR/Cas9 System to Disrupt Latent HIV-1 Provirus[J].Sci Rep,2013,3(8):2510-2516.

        [10]Kaminski R,Bella R,Yin C,et al.Excision of HIV-1 DNA by Gene Editing:a Proof-of-Concept in vivo Study[J].Gene Ther,2016,23(8-9):690-695.

        Genome Editing Technology and its Application in Gene Knockout and Viral Gene Therapy

        Zhong Yan-jun
        (Shanghai Taiyin Biotechnology Co.,Ltd ,Shanghai 201400)

        Gene editing technology is a technology of cutting and modifing the genome,which developed in recent years.With the zinc finger nuclease (ZFN),transcriptional activation of effector nucleases (TALEN) and CRISPRCas9 system,three genome editing technology developed in succession,genome editing technology has been rapid development.Open up a new path for gene therapy.

        ZFN;TALEN;CRISPR-Cas9;Gene knockout

        Q789

        A

        2096-0387(2017)05-0095-04

        鐘艷君(1987—),女,上海人,本科,目前在職攻讀上海交通大學生物工程領域工程碩士專業(yè)學位,研究方向:生物工程。

        怡红院av一区二区三区| 亚洲综合偷拍一区二区| 国产交换精品一区二区三区| 国内精品久久久久久99| 久久99热只有频精品8国语| 日本最新免费二区三区| 亚洲一区二区观看播放| 99日本亚洲黄色三级高清网站| 国产一区二区三区蜜桃av| 国产亚洲精品av一区| gv天堂gv无码男同在线观看| 又白又嫩毛又多15p| 国产亚洲精品日韩综合网| 日韩精品一区二区三区中文9| 少妇又紧又爽丰满在线视频| 国产激情视频免费在线观看| 一本一道波多野结衣av中文| 2019年92午夜视频福利| 亚洲人成网站18男男| 成人高清在线播放视频| 久久久精品午夜免费不卡| 欧洲极品少妇| 国产精品黑色丝袜在线播放| 男女羞羞的视频免费网站| 麻豆视频在线播放观看| 国产免费av片在线观看| 亚洲欧洲精品成人久久曰不卡| 北岛玲亚洲一区二区三区 | 一本一道vs无码中文字幕| 国产乱理伦片在线观看| 漂亮的小少妇诱惑内射系列| 日韩一区二区三区久久精品| 国产av天堂亚洲国产av天堂| 男人边吻奶边挵进去视频| 蜜臀aⅴ永久无码一区二区| 亚洲国产女性内射第一区二区| 国产精品美女久久久久久| 国产午夜影视大全免费观看| 亚洲又黄又大又爽毛片| 国产尤物自拍视频在线观看| 国产黄大片在线观看|