盧玉曦，張立紅，唐麗麗，張 爽，欒 鋒，劉惠濤

(煙臺大學 化學化工學院，山東 煙臺 264005)

在線衍生高效液相色譜法測定醬油中Pb2+和Ni2+的含量

盧玉曦，張立紅，唐麗麗，張 爽，欒 鋒*，劉惠濤

(煙臺大學 化學化工學院，山東 煙臺 264005)

建立了濕法消解處理樣品，反相高效液相色譜在線衍生同時測定醬油中Pb2+和Ni2+含量的方法。以二乙基二硫代氨基甲酸鈉(NaDDTC)為衍生試劑，Hypersil ODS2 C-18反相色譜柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)為固定相，甲醇-水-衍生劑(體積比63.5∶35∶1.5)為流動相進行檢測。結果顯示，Pb2+與Ni2+的線性范圍為0.5～50 μg/mL，相關系數(shù)(r2)分別為0.998 2和0.999 0，檢出限分別為0.3 μg/mL和0.2 μg/mL，樣品加標回收率為88.1%～91.8%。該方法操作簡單，準確度和精密度較好，可作為醬油樣品中重金屬離子測定的替代方法。

高效液相色譜(HPLC)；在線衍生；醬油；重金屬離子

醬油是由大豆、小麥、食鹽等原料經(jīng)過發(fā)酵工藝制成的液體調味品[1]。其成分除食鹽外，主要包括氨基酸、可溶性蛋白質、多糖類、香料以及添加劑等[2]。此外，醬油中還包括多種痕量金屬元素[3]，其中鉛、鎳等重金屬元素是潛在的有毒致癌物質[4]。由于重金屬在生物體中具有積聚性[5]，為了保證食用安全，控制人體對重金屬的攝入量,重金屬含量的測定成為醬油質量的重要監(jiān)測指標之一[6]。

目前，醬油中重金屬含量的檢測方法主要有火焰原子吸收法、原子熒光光譜法、石墨爐原子吸收法和雙硫腙比色法等[7]。由于醬油中重金屬的含量較低，同時又含有高濃度的氯化鈉[7],使得其共存元素多，在使用火焰原子吸收法和石墨爐原子吸收法進行檢測時，強大的背景吸收會掩蓋鉛等元素的信號[8-9],從而嚴重影響測定的靈敏度和準確度。而比色法由于原理限制，不能同時測定多種金屬離子。

隨著色譜技術的發(fā)展，高效液相色譜法(HPLC)因其較高的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，被大量應用于有機物的檢測[10-12]。同時，HPLC法也被證實可用于無機元素的檢測[13]。其主要原理是利用衍生劑與金屬離子絡合，然后由高效液相色譜儀進行檢測。目前對金屬離子的報道大部分集中于柱前衍生檢測[14-17]，而對金屬離子進行在線衍生檢測的方法鮮見報道。

本文以醬油中Pb2+和Ni2+為研究對象，采用二乙基二硫代氨基甲酸鈉(NaDDTC)為衍生試劑，用反相高效液相色譜法在線測定NaDDTC與金屬離子形成的衍生物，實現(xiàn)了醬油中Pb2+和Ni2+含量的同時測定。該方法既避免了重金屬檢測法以及柱前衍生法復雜的前處理過程，又避免了高濃度氯化鈉對實驗結果的影響，同時具有較好的準確度和精密度、方便易行。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters 1525型液相色譜儀配Waters 2487 紫外檢測器(美國Waters公司)；Breeze色譜工作站；色譜柱規(guī)格為Hypersil ODS2 C-18反相色譜柱(5 μm,250 mm×4.6 mm)；Pall CascadaTMLab超純水儀(美國Pall公司)。

重金屬鎳(Ni(NO3)2·6H2O)與鉛(Pb(NO3)2)標準品(分析純，上海晶純生化科技股份有限公司)；二乙基二硫代氨基甲酸鈉(NaDDTC,成都市科龍化工試劑廠)；甲醇(色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司)。3款醬油樣品購自當?shù)厥袌?山東，煙臺)。

1.2 標準溶液配制

1.2.1 標準儲備液 準確稱取一定量Ni(NO3)2·6H2O與Pb(NO3)2標準品，用超純水溶解，配成1.0 mg/mL標準儲備液，備用。

1.2.2 衍生劑溶液 準確稱取一定量NaDDTC，用甲醇定容于25 mL棕色容量瓶中，配成濃度為0.05 mol/L溶液，備用。

1.3 樣品前處理

分別準確移取2.0 mL醬油樣品于燒杯中，加入5 mL高純硝酸加熱消解至溶液澄清透明，定量轉移至10 mL容量瓶中，用超純水定容，作為樣品儲備液。樣品檢測前使用0.45 μm微孔濾膜過濾。

1.4 高效液相色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS2 C-18反相色譜柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流動相：甲醇-水-衍生劑(體積比63.5∶35∶1.5)；流速：1.2 mL/min；進樣量：20 μL；紫外檢測波長：308 nm；柱溫：25 ℃。

圖1 兩種重金屬離子衍生物的紫外光譜圖Fig.1 UV-spectra of two metal-diethyldithiocarbamate complexes

圖2 不同流動相比例下重金屬離子衍生物的色譜圖Fig.2 Chromatograms of two metal-diethyldithiocarbamate complexes with different rate of mobile phases sample concentration：5.0 μg/mL；1：Pb-NaDDTC，2：Ni-NaDDTC；a.methanol-water-derivatizing agent(a-c):68.5∶30∶1.5,63.5∶35∶1.5,58.5∶40∶1.5

2 結果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測波長的選擇 用紫外分光光度計分別掃描Pb-NaDDTC(1.0 μg/mL)與Ni-NaDDTC(1.0 μg/mL)的紫外光譜圖。Ni-NaDDTC的最大吸收波長為348 nm，Pb-NaDDTC的最大吸收波長為308 nm(如圖1所示)。分別在兩種波長下對金屬離子混合標準溶液進行HPLC檢測后發(fā)現(xiàn)，在308 nm處兩種金屬離子衍生物的峰形最佳。因此，本實驗選取308 nm為最佳檢測波長。

2.1.2 流動相比例的優(yōu)化 固定衍生劑在流動相中的比例為1.5%，調節(jié)水的比例從40%降低至30%，測定兩種金屬離子絡合物的譜圖(圖2所示)。結果表明，隨著水的比例逐漸降低，衍生物的保留時間逐漸減小，當水的比例小于35%時，兩種金屬離子衍生物組分峰發(fā)生重疊；當水的比例為40%時，兩種金屬離子衍生物的保留時間過長，且峰形不佳。所以選擇流動相中水的比例為35%。

固定水在流動相中的比例為35%，將衍生劑的比例從0.5%增加至2.5%，對兩種金屬離子絡合物進行檢測。結果表明，當衍生劑的體積比增至1.5%時，峰面積達到最大值；隨著衍生劑體積比的繼續(xù)增加，峰面積逐漸減小，且基線波動逐漸變大，不利于檢測結果的準確性。這是由于衍生劑本身有一定紫外吸收，隨著衍生劑濃度的逐漸增大，基線吸收逐漸增強，從而部分掩蓋了衍生物的吸收。因此將衍生劑在流動相中的體積比確定為1.5%。

2.1.3 流動相流速的優(yōu)化 考察了不同流動相流速(1.0，1.1，1.2，1.3 mL/min)對Pb2+和Ni2+分離的影響。結果表明，隨著流動相流速增大，被測組分的保留時間逐漸減小，當流速為1.1 mL/min時，兩種衍生物的峰完全分離，分離度R=1.9，拖尾因子為0.90和1.04；當流速為1.3 mL/min時，兩種衍生物的峰出現(xiàn)重疊，分離度降低(分離度R=1.4，拖尾因子為0.92和1.02)。因此，綜合考慮，選用1.2 mL/min(分離度R=1.6，拖尾因子為0.94和1.00)為流動相流速。

綜上所述，最優(yōu)分離條件為：檢測波長為308 nm；甲醇-水-衍生劑(63.5∶35∶1.5)為流動相，流速為1.2 mL/min。

2.1.4 干擾實驗 在優(yōu)化實驗條件下，向兩種金屬離子混標液中加入K+，Na+，F(xiàn)e3+，Co2+，Cu2+，Zn2+，Mn2+，Hg2+等離子進行在線檢測，各干擾離子的最大允許量為Hg2+：50 μg/mL；Fe3+，Co2+，Cu2+，Zn2+，Mn2+：2 μg/mL；K+，Na+則無影響。因此，在實際樣品檢測時應采用適當方式降低各干擾離子的影響。

2.2 線性關系、檢出限與定量下限

在最優(yōu)色譜條件下對金屬離子混標液進行測定，以峰面積(y，mAU)對濃度(x，μg/mL)作圖，繪制標準曲線。結果顯示，Pb2+與Ni2+在0.5～50 μg/mL范圍內峰面積與濃度的線性關系良好，兩種衍生物的相關系數(shù)(r2)均大于0.99，線性方程分別為Pb2+：y=17 248x+144 901，Ni2+：y=38 023x+61 076。將金屬標準液稀釋至合適濃度，在最優(yōu)色譜條件下進行檢測。分別按照信噪比S/N=3和S/N=10計算檢出限(LOD)與定量下限(LOQ)。得Pb2+的LOD與LOQ分別為0.3 μg/mL與1.0 μg/mL，Ni2+的LOD與LOQ分別為0.2 μg/mL與0.6 μg/mL。

2.3 精密度與回收率

在最優(yōu)色譜條件下，選取1個批次(樣品1，老抽)實際樣品日內和日間連續(xù)進樣5次，計算兩種金屬離子衍生物的保留時間與峰面積的相對標準偏差(RSD)，分別作為日內精密度與日間精密度。結果顯示，保留時間的RSD不大于2.6%，峰面積的RSD不大于 8.6%，數(shù)據(jù)顯示該方法可以滿足分析檢測的要求。

選擇其中1個批次樣品(樣品1，老抽)進行加標回收率檢測，將3個已知濃度(0.3，0.5，2.0 μg/mL)的金屬離子混合標準溶液分別添加到實驗樣品中，在優(yōu)化色譜條件下進行檢測，每種濃度平行實驗5次。結果表明，兩種金屬離子的加標回收率為88.1%～91.8%，RSD為4.6 %～8.8%，表明該方法可以滿足重金屬的檢測要求。

表1 樣品的分析結果Table 1 Determination of the samples ρ/(μg·mL-1)

*no detected

圖3 混標的色譜圖以及樣品的色譜圖Fig.3 Typical chromatograms of the mixed standards and real samplesa：standard(1.0 μg/mL)，b：sample 1，c：sample 2，d：sample 3；1：Pb-NaDDTC，2：Ni-NaDDTC

2.4 實際樣品的檢測

在優(yōu)化色譜條件下分別對3組醬油樣品(1和2號為老抽醬油，3號為生抽醬油)中Pb2+與Ni2+的含量進行檢測，連續(xù)進樣3次取平均值，結果見表1。標準品與樣品的色譜圖見圖3(樣品圖中兩組分色譜峰的對稱因子為0.84～1.15，理論塔板數(shù)為19 000～34 000)。

結果表明，1號樣品(老抽)中Pb2+與Ni2+含量在3個樣品中最高，3號樣品(生抽)中Ni2+含量略高于2號樣品。1和2號樣品中雖含有一定濃度的Pb2+，但其含量低于國家標準，即調味品≤1.0 mg/kg，食用鹽≤2.0 mg/kg[18]。目前國家尚未對各類調味品中Ni2+含量做出明確規(guī)定，因此該含量是否符合食品安全規(guī)定尚不明確。

由于醬油中組分來源復雜，大豆、水、鹽、微生物以及生產(chǎn)工藝、儲存、運輸?shù)纫蛩鼐绊戓u油中重金屬的含量。其具體來源有待進一步分析。本方法相較于已有重金屬檢測方法，其前處理時間短于GB/T 500912-2010的30 min[5]，又避免了三氯甲烷等有毒萃取劑的應用[12]。同時，檢出限(0.2～0.3 mg/mL)與國標基本一致[5](0.1～0.3 mg/kg)，對兩種物質的檢測時間短于17 min，可以滿足快速檢測的需求。

3 結 論

本文以NaDDTC為柱上衍生劑，Hypersil ODS2 C-18反相色譜柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)為固定相，甲醇-水-衍生劑(63.5∶35∶1.5)為流動相，對Pb2+和Ni2+進行了在線同時檢測。與柱前衍生反相高效液相色譜法、原子熒光光譜法相比，該方法簡單、快速，避免了復雜的前處理過程，同時測定結果準確度高、重現(xiàn)性好。該方法為醬油樣品中微量金屬元素的檢測提供了可行的方法。

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Determination of Pb2+and Ni2+in Soy Sauce by Online Derivation with High Performance Liquid Chromatography

LU Yu-xi，ZHANG Li-hong，TANG Li-li，ZHANG Shuang，LUAN Feng*，LIU Hui-tao

(College of Chemistry and Chemical Engineering，Yantai University，Yantai 264005,China)

Contents of Pb2+and Ni2+in soy sauce were determined by the online derivation and HPLC method with wet digestion.Sodium diethyldithiocarbamate(NaDDTC) was used as the derivtive agent for heavy metal ions.The experimental conditions were as follows：chromatography column:a Hypersil ODS2 C-18(5 μm,250 mm×4.6 mm) column，mobile phase：MeOH-H2O-sodium diethyldithiocarbamate(63.5∶35∶1.5).The calibration curves for Pb2+and Ni2+were linear in the range of 0.5-50 μg/mL with correlation coefficients of 0.998 2 and 0.999 0，respectively.The limits of detection were 0.3 μg/mL and 0.2 μg/mL，respectively，with recoveries of 88.1%-91.8%.The method has the advantages of simplicity，good accuracy and precision，and could be used as an alternative method for the determination of heavy metal ions in real soy sauce samples.

high performance liquid chromatography(HPLC)；online derivation；soy sauce；heavy metal ions

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.03.022

2016-09-30；

2016-10-20

國家自然科學基金項目(21675138)

O657.63；O614.433

A

1004-4957(2017)03-0418-04

*通訊作者：欒 鋒,博士，副教授，研究方向:色譜與電泳分析，Tel：0535-6902063，E-mail:fluan@sina.com