賴國銀，伊雄海，吳 敏，張志剛，王傳現(xiàn)，徐敦明*，呂美玲

(1.廈門出入境檢驗檢疫局 檢驗檢疫技術(shù)中心，福建 廈門 361026；2.上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135；3.安捷倫科技(中國)有限公司，北京 100102)

固相萃取/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測多類食品中二甲基黃、二乙基黃含量

賴國銀1，伊雄海2，吳 敏1，張志剛1，王傳現(xiàn)2，徐敦明1*，呂美玲3

(1.廈門出入境檢驗檢疫局 檢驗檢疫技術(shù)中心，福建 廈門 361026；2.上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135；3.安捷倫科技(中國)有限公司，北京 100102)

建立了豆干、辣椒醬、豆腐乳、腐竹和餅干等樣品中二甲基黃和二乙基黃殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法?；诙谆S和二乙基黃的化學(xué)結(jié)構(gòu)特性，采用乙腈溶液提取。提取液酸化后經(jīng)Bond Elut Plexa PCX陽離子交換樹脂固相萃取凈化，吹干復(fù)溶后，使用反相C18色譜柱分離，電噴霧串聯(lián)四極桿質(zhì)譜正離子化多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式檢測。二甲基黃和二乙基黃的方法定量下限均為0.50 μg/kg。對5種不同基質(zhì)樣品進行二甲基黃和二乙基黃0.50，5.0，80 μg/kg 3個濃度水平的加標(biāo)回收實驗，得到二甲基黃和二乙基黃的平均回收率分別為76.4%～93.0%和76.1%～92.4%；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.7%～6.3%和1.9%～7.4%，可以滿足食品中二甲基黃和二乙基黃快速篩查和定量分析的要求。

二甲基黃；二乙基黃；固相萃??；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)

圖1 二甲基黃和二乙基黃的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structures of dimethyl yellow and diethyl yellow

偶氮染料(偶氮基兩端連接芳基的一類有機化合物)是紡織品服裝在印染工藝中應(yīng)用最廣泛的一類合成染料，用于多種天然和合成纖維的染色和印花，也用于油漆、塑料、橡膠等的著色。在特殊條件下，它能分解產(chǎn)生20多種致癌芳香胺，經(jīng)過活化作用改變?nèi)梭w的DNA結(jié)構(gòu)進而引起病變或誘發(fā)癌癥[1-4]。二甲基黃和二乙基黃屬于親脂性偶氮染料(分子結(jié)構(gòu)式見圖1)。國際癌癥研究機構(gòu)將二甲基黃染料歸類為2B致癌物。2009年，比利時聯(lián)邦食品安全機構(gòu)(CFSA)召回了含有4-(N，N-二甲氨基)-二甲基偶氮苯即二甲基黃的咖喱[2]。2014年臺灣的“毒豆干”事件將二甲基黃、二乙基黃推到了食品安全的風(fēng)口浪尖。2015年，香港食安中心從臺灣地區(qū)生產(chǎn)的“度小月麻油辣腐乳”中檢出非食用添加物質(zhì)“二甲基黃、二乙基黃”。這些非法添加事件給人們的食品安全敲響了警鐘。

目前有關(guān)二甲基黃、二乙基黃的檢測技術(shù)主要有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5-6]、高效液相色譜法[7-8]和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[2，4，9-14]。高效液相色譜法儀器較為普及，操作簡單，但靈敏度較低,且定性準(zhǔn)確性較差；而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS/MS)一般采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式，不但操作簡便、選擇性強，準(zhǔn)確度和靈敏度也高。雖然在不同基質(zhì)中檢測二甲基黃和二乙基黃的方法已有較多報道，但大多數(shù)方法能處理的樣品基質(zhì)種類較少，或者只檢測了二甲基黃或二乙基黃[7，10-12]。因此，開發(fā)可同時檢測二甲基黃和二乙基黃并適用于多種不同基質(zhì)食品的檢測方法很有必要。本研究針對當(dāng)前市場非法使用二甲基黃和二乙基黃頻率較高的的豆干、辣椒醬、豆腐乳、腐竹和餅干等多種食品基質(zhì)，建立了固相萃取/液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜分析方法，可同時準(zhǔn)確快速檢測食品中二甲基黃和二乙基黃的含量。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：Agilent Infinity 1290超高效液相色譜，Agilent 6460QQQ質(zhì)譜儀，配AJS ESI源(美國Agilent公司)；氮吹儀(瑞典Biotage公司)；渦旋混勻器(德國IKA公司)；離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

乙腈、甲醇(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，Sigma公司)；鹽酸、氨水、丙酮(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；SPE(固相萃取)小柱：CN柱、NH2柱(500 mg，美國Agela Technologies公司)，HLB(500 mg，美國Waters公司)，Bond Elut Plexa PCX柱(3 mL，60 mg，美國Agilent公司)，固相萃取柱使用前依次用3 mL甲醇、3 mL水、3 mL 0.1 mmol/L的鹽酸溶液活化；0.22 μm有機濾膜；實驗用水均為Milli-Q超純水。

二甲基黃(純度99.5%)、二乙基黃(純度99.0%)標(biāo)準(zhǔn)品購自德國Dr.Ehrenstorfer公司。準(zhǔn)確稱取適量二甲基黃、二乙基黃標(biāo)準(zhǔn)品，分別用乙腈配成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液并儲存在-18 ℃冰箱中。

1.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取1.00 g樣品于50 mL離心管中，加入5 mL水和10 mL乙腈，然后加入2.00 g 氯化鈉和2.00 g無水硫酸鎂，渦旋混勻2 min后，在7 500 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min。取5 mL上清液，加入1 mL 鹽酸溶液(0.1 mol/L)。得到的溶液分批加載至已活化的固相萃取柱，依次用3 mL水和3 mL 甲醇-水溶液(1∶1，體積比)淋洗，棄去淋洗液，加3 mL氨水-甲醇溶液(1∶1 000，體積比)洗脫。洗脫液用氮吹管收集，吹至近干，用流動相定容至1 mL，過0.22 μm有機濾膜，濾液待測。

1.3 儀器條件

色譜柱：Agilent Poroshell EC C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm);流動相(A∶B=30∶70)：A為含0.1%甲酸的水溶液，B為含0.1%甲酸的乙腈溶液；流速：0.3 mL/min;柱溫：35 ℃;進樣量：2.0 μL。采用電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)檢測。霧化氣壓力：45 psi；噴嘴電壓：500 V；毛細管電壓：3 000 V；干燥氣溫度：300 ℃；霧化氣流速：8 L/min；鞘氣溫度：300 ℃；鞘氣流速：9 L/min。兩種待測物的保留時間、定量離子、定性離子、碰撞能量和碎裂電壓等參數(shù)見表1。

表1 二甲基黃與二乙基黃的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 MS/MS parameters of dimethyl yellow and diethyl yellow

*quantitative ion

圖2 二甲基黃與二乙基黃標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.5 μg/L)的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖及總離子流圖Fig.2 MRM and TIC chromatograms for the standard solutions of dimethyl yellow and diethyl yellow(0.5 μg/L)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

根據(jù)二甲基黃和二乙基黃的化學(xué)結(jié)構(gòu)，它們均含有弱堿性的三級胺結(jié)構(gòu)，因此采用正離子MRM模式進行測定，且利用反相色譜柱進行分離。本文考察了乙腈-5 mmol/L醋酸銨的水溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液4種流動相的分離效果。結(jié)果表明，采用“1.2”所述的0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相的靈敏度最高、峰形最好。濃度為0.5 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)色譜圖及混標(biāo)總離子流圖見圖2，其保留時間見表1。

2.2 提取條件的選擇

基于參考文獻[10-14]，實驗分別采用丙酮-乙醇(9∶1)、乙酸乙酯、甲醇和乙腈作為提取液，比較提取效果。結(jié)果表明，丙酮-乙醇及甲醇作為提取溶液時，提取效果不佳；乙酸乙酯作為提取液時，提取雜質(zhì)較多，且后續(xù)凈化較難處理；乙腈提取效果較好，且提取雜質(zhì)少，可有效避免基質(zhì)干擾，因而后續(xù)實驗均采用乙腈作為提取液。

2.3 凈化條件的優(yōu)化

食品中通常含有油脂、天然色素等雜質(zhì)，這些雜質(zhì)會對色譜分析形成顯著抑制干擾，從而導(dǎo)致目標(biāo)化合物的檢測靈敏度降低。本實驗采用乙腈提取只能去除部分油脂和水溶性雜質(zhì)，如未經(jīng)SPE小柱凈化則會產(chǎn)生較強的基質(zhì)效應(yīng)。通過實驗對比了CN柱、NH2柱、HLB、Bond Elut Plexa PCX柱等幾種固相萃取柱的凈化效果，結(jié)果表明采用Bond Elut Plexa PCX(3 mL，60 mg)固相萃取柱得到的目標(biāo)物回收率較高。這是由于Bond Elut Plexa PCX為陽離子固相萃取柱，對二甲基黃和二乙基黃酸化后形成的有機銨鹽具有較強的保留能力，再利用堿性的洗脫溶劑與有機銨鹽反應(yīng)形成弱堿性的化合物，從而可得到高回收率的洗脫。由于目標(biāo)化合物二甲基黃和二乙基黃均為有機胺類化合物，利用其弱堿性，本實驗通過酸化待測物形成陽離子，再用水及甲醇-水(1∶1)的淋洗液洗脫除去水溶性及中性干擾物，最后用氨水甲醇溶液洗脫，從而獲得最佳的凈化效果和回收率。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)、線性范圍與定量下限

基質(zhì)效應(yīng)指在提取基質(zhì)中目標(biāo)物時，基質(zhì)中其他組分也被共同洗脫出，這些組分會影響ESI源并對目標(biāo)物的離子化產(chǎn)生一定的增強或抑制作用，從而影響方法的檢出限、定量下限和準(zhǔn)確度[3,10,15]?；|(zhì)效應(yīng)是Paul和Tang[16]在1993年研究電噴霧質(zhì)譜原理時發(fā)現(xiàn)的。當(dāng)前評價基質(zhì)效應(yīng)的主要方法有：①相對響應(yīng)值法：基質(zhì)效應(yīng)=基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)值/溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)值×100%；②標(biāo)準(zhǔn)曲線法：基質(zhì)效應(yīng)=基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液在線性范圍內(nèi)的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液在線性范圍內(nèi)的斜率×100%[17]。本研究采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，考察了二甲基黃、二乙基黃在豆干、辣椒醬、豆腐乳、腐竹和餅干中的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，二甲基黃和二乙基黃在豆干、腐乳和腐竹中有基質(zhì)增強效應(yīng)；而在辣椒醬和餅干中則有基質(zhì)抑制效應(yīng)(見表2)。為了有效消除樣品基質(zhì)效應(yīng)，本文采用基質(zhì)匹配方法進行校準(zhǔn)：即采用空白樣品的提取液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋溶液，使標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品具有同樣的離子化條件。

在已優(yōu)化的色譜-質(zhì)譜條件下，分別在豆干、辣椒醬、豆腐乳、腐竹和餅干空白提取液中，配制系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.50，1.0，2.0，5.0，15，50 μg/L)進行測定，以濃度(x，μg/L)為橫坐標(biāo)，定量離子的峰面積(y)為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到2種物質(zhì)的線性方程、相關(guān)系數(shù)和基質(zhì)效應(yīng)(見表2)。結(jié)果表明在0.50～50 μg/L濃度范圍內(nèi)，二甲基黃和二乙基黃均具有良好的線性關(guān)系。各種基質(zhì)中，兩種非法添加物的定量下限(信噪比S/N=10)均為0.50 μg/kg；檢出限(信噪比S/N=3)均為0.20 μg/kg。

表2 分析物的線性方程、相關(guān)系數(shù)及基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Regression equations，correlation coefficients(r2) and matrix effects of the analytes

2.5 方法的回收率與精密度

用豆干、辣椒醬、豆腐乳、腐竹和餅干樣品為基質(zhì)做添加回收和精密度試驗，添加3個濃度水平(若濃度高于線性范圍上限，增加2個濃度的添加水平，通過稀釋至線性范圍內(nèi)進行檢測)[18]，每個濃度水平進行6次重復(fù)實驗，根據(jù)這個原則，本研究選取的添加回收濃度水平為0.50，5.0，80 μg/kg(按照前述檢測方法得到的待測液，稀釋1倍后進行檢測)，其平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。從表3看出，二甲基黃在3個添加水平的平均回收率為76.4%～93.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%～6.3%；二乙基黃的平均回收率為76.1%～92.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%～7.4%，方法回收率和精密度良好。

表3 空白基質(zhì)中二甲基黃和二乙基黃的加標(biāo)回收率與精密度(n=6)Table 3 Recoveries and precisions of dimethyl yellow and diethyl yellow spiked in blank matrices(n=6)

2.6 實際樣品的檢測

使用本文建立的方法，對25個市售樣品(豆干、辣椒醬、豆腐乳、腐竹和餅干樣品各5份)中的二甲基黃和二乙基黃含量進行測定，結(jié)果在1份辣椒醬樣品中檢出二甲基黃，在1份豆干樣品中檢出二甲基黃和二乙基黃，但其含量均低于定量下限；其余樣品中均未檢出目標(biāo)物。

3 結(jié) 論

本文建立了基于陽離子交換固相萃取方法結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定豆干、辣椒醬、豆腐乳、腐竹和餅干等樣品中二甲基黃和二乙基黃的方法。本研究利用二甲基黃和二乙基黃的化學(xué)結(jié)構(gòu)特性，酸化提取物后，選取Bond Elut Plexa PCX固相萃取凈化，采用LC-MS/MS測定樣品。二甲基黃和二乙基黃的方法定量下限均為0.50 μg/kg。對5種不同樣品進行3個濃度水平的二甲基黃和二乙基黃的添加回收實驗，平均回收率分別為76.4%～93.0%和76.1%～92.4%；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.7%～6.3%和1.9%～7.4%。該方法具有前處理簡單、靈敏度高及重復(fù)性好等特點，雖選取的基質(zhì)油脂、色素等干擾大，但優(yōu)化后的前處理方法凈化效果好，回收率高，適用于豆干、辣椒醬、豆腐乳、腐竹和餅干等食品中二甲基黃和二乙基黃的同時檢測。

[1] He L M，Su Y J，F(xiàn)ang B H，Shen S G，Zeng Z L，Liu Y H.Anal.Chim.Acta，2007，594(1)：139-146.

[2] Tateo F，Bononi M，Gallone F.CzechJ.FoodSci.，2010，28(5)：427-432.

[3] Yi X H，Deng X J，Yang H Q，Guo D H，Zhu J.Chin.J.Chromatogr.(伊雄海，鄧曉軍，楊惠琴，郭德華，朱堅.色譜)，2011，29(11)：1062-1069.

[4] Tsai C F，Kuo C H，Shih D Y C.J.FoodDrugAnal.，2015，23(3)：453-462.

[5] Li G S，Chen G Q，Yang G，Xiong H L.Chin.J.Anal.Lab.(李桂生，陳桂琴，楊戈，熊華亮.分析試驗室)，2015，34(12)：1399-1402.

[6] Xia D，Ding A B，Shi Z H，Lu L X，Shi X P，Xiong X H.CerealsandOilsProcessing(夏棟，丁安幫，施祖灝，陸利霞，史昕平，熊曉輝.糧油加工)，2015，8：56-58.

[7] Ding A B，Shi Z H，Lu L X，Zhong B Y，Shi X P，Wang K Y，Xiong X H.CerealsandOilsProcessing(丁安幫，施祖灝，陸利霞，鐘寶瑜，史昕平，汪開銀，熊曉輝.糧油加工)，2015，11：53-55.

[8] Zhang D F，Zhu A L，Tao H X，Deng W W，Zhang J S.Mod.Prevent.Med.(張大芬，朱敖蘭，陶紅霞，鄧文偉，張家樹.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué))，2015，42(7)：1202-1204，1219.

[9] Walker M J，Colwell，Biesenbruch S，Stuart B，Burns D T.FoodAnal.Methods，2013，6(2)：395-405.

[10] Fan S F，Li Q，Ma J M，Li H，Zhang Y.Chin.J.Chromatogr.(范素芳，李強，馬俊美，李揮，張巖.色譜)，2015，33(6)：657-661.

[11] Yan H，Yu T T，Jiang L P，Zhang L，Wang H X，Zhu X L，Li X.J.FoodSaf.Qual.(嚴(yán)恒，余婷婷，蔣麗萍，張莉，王會霞，朱曉玲，黎星.食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報)，2015，6(4)：1459-1463.

[12] Lin Z H，Zhou Q Q，Zeng X，Zheng C H，Huang S M，Ouyang G F，Qi P.FoodSci.(林子豪，周慶瓊，曾羲，鄭春浩，黃思銘，歐陽鋼鋒，戚平.食品科學(xué))，2016，37(8)：217-221.

[13] Zhang S.J.FoodSaf.Qual.(張杉.食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報)，2016，7(3)：921-926.

[14] Zhao S，Zhang J，Ding X J，Yang Y J，Shao B.J.Instrum.Anal.(趙珊，張晶，丁曉靜，楊蘊嘉，邵兵.分析測試學(xué)報)，2016，35(4)：432-437.

[15] Huang H H，Xu D M，Zhou Y，Luo J，Lü M L，Chen S B，Wang L Z.J.FoodSaf.Qual.(黃何何，徐敦明，周昱，羅佳，呂美玲，陳樹賓，王連珠.食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報)，2014，5(4)：1133-1141.

[16] Paul K，Tang L.Anal.Chem.，1993，65(22)：972A.

[17] Huang B Y，Xiao Z Y，Chen D，Yan X N，Zhao Y L，Sun J.Pestic.Sci.Admin.(黃寶勇，肖志勇，陳丹，顏小寧，趙玉樂，孫江.農(nóng)藥科學(xué)管理)，2010，31(3)：39-43.

[18] Li B B，Zhang H X.Chin.J.HealthLab.Technol.(李必斌，張海霞.中國衛(wèi)生檢驗雜志)，2000，10(5)：618-619.

Determination of Dimethyl Yellow and Diethyl Yellow in Variety of Foods by Solid Phase Extraction/Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

LAI Guo-yin1，YI Xiong-hai2，WU Min1，ZHANG Zhi-gang1，WANG Chuan-xian2，XU Dun-ming1*，Lü Mei-ling3

(1.Technical Center of Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Xiamen 361026，China；2.Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shanghai 200135，China；3.Agilent Technologies(China) Company Limited，Beijing 100102，China)

A liquid chromatography-tandem mass spectrometric(LC-MS/MS) method was developed for the determination of dimethyl yellow and diethyl yellow in dried bean curd，chili sauce，tofuru，dried beancurd sticks and biscuit.In this study，based on the chemical structures of dimethyl yellow and diethyl yellow，the sample was first extracted using acetonitrile solution，and the extract was then acidified and purified with a Bond Elut Plexa PCX cation anion exchange cartridge.After drying and re-dissolvation，the analytes were separated by reverse phase LC using a C18column,followed by detection using triple quadrupole mass spectrometry with positive electrospray ionization in multiple reaction monitoring(MRM) mode.The limits of quantitation were both 0.50 μg/kg.The recoveries of dimethyl yellow and diethyl yellow in food samples at three spiked levels of 0.50，5.0，80 μg/kg were in the range of 76.1%-93.0% with relative standard deviations(RSDs) of 1.7%-7.4%.The method could meet the requirement for rapid screening and quantitative analysis of dimethyl yellow and diethyl yellow in foods.

dimethyl yellow；diethyl yellow；solid phase extraction；liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.03.017

2016-09-29；

2016-11-20

福建省自然科學(xué)基金項目(2014J01057,2016J05045)；國家質(zhì)檢總局科技計劃項目(2016IK186)；上海市技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)專項(14DZ0501001，15DZ0503201)

O657.63；TQ613.1

A

1004-4957(2017)03-0393-05

*通訊作者：徐敦明，博士，研究員，研究方向：食品安全，Tel：0592-6803438，E-mail：xudm@xmciq.gov.cn