秦偉瀚，劉 翔，陽 勇，張小梅，郭延壘，劉 飛

(重慶市中藥研究院，重慶 400065)

基于UPLC-Q-TOF-MS法分析涼山蟲草化學成分

秦偉瀚，劉 翔，陽 勇，張小梅，郭延壘，劉 飛*

(重慶市中藥研究院，重慶 400065)

應用超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)飛行時間質譜法(UPLC-Q-TOF-MS)對涼山蟲草提取物的主要化學成分進行定性分析。采用Agilent SB-C18(50 mm×4.6 mm，1.8 μm)色譜柱，以0.1%甲酸水-乙腈溶液為流動相，梯度洗脫，流速0.25 mL/min，柱溫30 ℃；質譜分析采用信息關聯(lián)模式(IDA)正、負離子分別采集。應用PeakView軟件的Formula Finder等功能、各色譜峰的質譜數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫匹配結合各色譜峰的二級碎片裂解規(guī)律，共鑒定出27個化合物，其中8個為蟲草中未曾報道物質；主要化學成分包括生物堿、糖苷、核苷、氨基酸等成分。該方法精確、可靠、高效，適用于涼山蟲草成分的快速鑒定，為涼山蟲草的開發(fā)利用以及闡明其藥效物質基礎提供了參考。

涼山蟲草；UPLC-Q-TOF-MS；裂解規(guī)律；化學成分

蟲草屬(Cordyceps(Fr.)Link)為真菌寄生于昆蟲，并從其頭部或體表長出子實體的蟲菌復合體[1-3]。在我國該屬共有139個名稱，分布于29個省區(qū)[4]。涼山蟲草(Cordycepsliangshanensis)始載于《四川通志》，為麥角菌科真菌寄生在鱗翅目昆蟲幼蟲的子座和幼蟲尸體的干燥物，產(chǎn)于四川、云南等省區(qū)，生長海拔較低。其性甘、味平，歸腎、肺經(jīng)，具有補肺益腎之功效，主治虛喘勞嗽等癥?；诠π系南嗨菩栽谒拇ú糠值貐^(qū)已作為冬蟲夏草的替代品種使用，并于1987年載入《四川省中藥材標準》[5-10]。近年來對涼山蟲草的研究逐漸成為熱點，有不少關于其藥理、毒理及化學成分方面的研究報道[11-20]。本研究首次采用超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)飛行時間質譜法(UPLC-Q-TOF-MS)分析涼山蟲草的主要化學成分，以電噴霧離子源正、負離子模式分別對色譜流出物進行檢測，并通過高分辨質譜分析結合數(shù)據(jù)庫及相關文獻共鑒定出27個化合物，其中有8個為蟲草中未曾報道物質，鑒定成分中主要包括生物堿、糖苷、核苷、氨基酸類等。該研究為涼山蟲草的藥效學物質基礎和質量評價提供了科學依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥

LC-30A型超高效液相色譜儀(日本島津公司)：二元高壓泵、自動進樣器、柱溫箱；TripleTOFTM 4600型四極桿串聯(lián)飛行時間高分辨質譜儀(美國AB公司)：Analyst 1.6工作站、PeakView 1.2.0.3 數(shù)據(jù)處理軟件；JY92-ⅡD型超聲波細胞粉碎機(寧波新藝超聲設備有限公司)；超低溫冷凍儲存箱(中科美菱公司)；CPA225D型十萬分之一分析天平(德國賽多利斯公司)。

乙腈、水(色譜級，德國Merck公司)；甲酸(色譜級，美國ACS公司)；甲醇(分析純，重慶川東化工公司)。

蟲草樣品經(jīng)重慶市中藥研究院生藥研究所研究員鑒定為麥角菌科蟲草菌屬真菌子座與幼蟲尸體復合體涼山蟲草(Cordycepsliangshanensis)。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 采用Agilent SB-C18(50 mm×4.6 mm，1.8 μm)色譜柱，柱溫：30 ℃，流動相為0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫程序：0～12 min，10%～95% B；12～16 min，95% B；16～16.5 min，95%～10% B，16.5～20 min，10% B；進樣量2 μL，流速0.25 mL/min。

1.2.2 質譜條件 采用電噴霧離子源(ESI)，正/負離子模式，噴霧電壓(IS)分別為+5 500 V，-4 500 V；霧化氣壓力(GS1)為45 psi；氣簾氣壓力(CUR)為25 psi；輔助氣壓力(GS2)為50 psi；離子源溫度(TEMP)為500 ℃；簇裂解電壓(DP)為64 V；碰撞能量(CE)為47 V；碰撞能量滾動區(qū)間(CES)為15 V；檢測模式為信息關聯(lián)采集模式(IDA)，多重質量虧損(MMDF)和動態(tài)背景扣除(DBS)為觸發(fā)二級掃描的條件，滿足該條件優(yōu)先進行二級掃描。

1.2.3 樣品制備 將蟲草樣品切段后置于-80 ℃冰箱冷凍1 h，迅速取出于研缽中研成細末，精密稱定蟲草樣品粉末0.1 g，置于5 mL試管中，加入75%甲醇2 mL，精密稱定，于超聲波細胞破碎儀中超聲處理(功率：600 W) 30 min，取出，放冷，再次稱定重量，用75%甲醇補足減失的重量，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2 結果與討論

2.1 實驗條件的優(yōu)化

2.1.1 提取方法的優(yōu)化 考察了不同提取溶劑(甲醇、乙醇、乙酸乙酯、水)；不同提取方法(冷浸、超聲、回流、細胞破碎)；不同溶劑比例(65%，70%，75%，80%，85%)及不同提取時間(10，20，30，40 min)，最終確定以75%的甲醇細胞破碎30 min為最佳的提取方案。

2.1.2 色譜-質譜條件的優(yōu)化 考察了不同流動相(甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-5 mmol/L乙酸銨水溶液)以及不同色譜柱(Agilent SB-C18,Waters BEH-C18,Phenomenex NUNA-C18柱)，根據(jù)主要化合物的TIC響應值及分離效果，最終確定乙腈-0.1%甲酸水溶液為樣品分析的流動相，Agilent SB-C18為樣品分析色譜柱。在TOF MS模式下，以樣品TIC響應值大小為參考，逐個微調Gas1,Gas2,CUR,IS,TEM及噴霧針位置等離子源參數(shù)(如“1.2.2”所述)，以使總離子流響應達到最佳。

2.2 化學成分的分析鑒定

采用上述色譜質譜條件，對涼山蟲草樣品進行正、負離子模式采集，全掃描總離子流圖見圖1，所得結果導入Peak View軟件，將滿足質量誤差小于5 ppm、同位素分布正確且含有二級碎片的化合物確認為目標物質，結合Peak View軟件Formula Finder功能、數(shù)據(jù)庫及二級碎片裂解規(guī)律，從涼山蟲草醇提樣品中找到5類共27個化合物(表1)，通過對照文獻，發(fā)現(xiàn)其中有8個成分未曾報道，課題組對成分做了進一步研究，研究顯示其主要化學成分包括以下5種類型：

表1 涼山蟲草的UPLC-Q/TOF分析結果Table 1 Analysis results for Cordyceps liangshanensis by UPLC-Q/TOF

*compounds not reported in the literature of Cordyceps sinensis(蟲草中未報道成分)

2.2.1 生物堿類 生物堿是蟲草類藥材的有效成分之一，但已知種類較少。在正離子模式下，保留時間為3.36 min獲得m/z195.076 2[M+H]+的質譜信號，二級質譜出現(xiàn)m/z177.065 6,135.054 1,80.049 3質譜峰，根據(jù)數(shù)據(jù)庫匹配出分子式為C9H10N2O3，推測該化合物為Pyridylacetylglycine，二級碎片離子為[M+H-OH]+,[M+H-C2H4O2]+,[M+H-C4H4NO3]+，其MS/MS圖譜見圖2；保留時間為9.95 min獲得m/z146.165 3[M+H]+的質譜信號，二級質譜出現(xiàn)m/z72.079 9質譜峰，根據(jù)數(shù)據(jù)庫匹配出分子式為C7H19N3，推測該化合物為精瞇，二級碎片離子為[M+H-C3H9N2]+，據(jù)文獻報道冬蟲夏草中含有此物質[21]。

圖2 正離子模式下Pyridylacetylglycine 的MS/MS圖譜Fig.2 MS/MS spectrum of pyridylacetylglycine in negative ion mode

2.2.2 糖苷類 蟲草中含有多種糖苷類成分，且主要含于子座。在負離子模式下共找到3種糖苷類物質，保留時間為2.09 min獲得m/z341.108 62[M-H]-的質譜信號，二級質譜出現(xiàn)179.057 1,119.035 9,89.025 3質譜峰，根據(jù)數(shù)據(jù)庫匹配出分子式為C12H22O11，推測該化合物為蕈糖，二級碎片離子為[M-H-C6H11O5]-,[M-H-C8H15O7]-,[M-H-C9H17O8]-，蕈糖的MS/MS圖譜見圖3；保留時間為2.11 min獲得m/z181.071 9[M-H]-的質譜信號，二級質譜出現(xiàn)163.062 4,119.036 1,89.025 7質譜峰，根據(jù)數(shù)據(jù)庫匹配出分子式為C6H14O6，推測該化合物為D-甘露醇，二級碎片離子為[M-H-H2O]-,[M-H-C2H6O2]-,[M-H-C3H8O3]-；保留時間為2.16 min獲得m/z179.056 2[M-H]-的質譜信號，二級質譜出現(xiàn)161.045 9,131.034 6,89.025 7質譜峰，根據(jù)數(shù)據(jù)庫匹配出分子式為C6H12O6，推測該化合物為D-塔格糖，二級碎片離子為[M-H-H2O]-,[M-H-H2O-CH2O]-,[M-H-C3H6O3]-。據(jù)查證蟲草相關文獻，除D-塔格糖外上述糖苷類物質均有報道[22-25]。

圖3 正離子模式下蕈糖的MS/MS圖譜Fig.3 MS/MS spectra of trehalose in negative ion mode

2.2.3 氨基酸類 蟲草中氨基酸種類豐富，本實驗在正離子模式下共找到8種，分別是賴氨酸、精氨酸、纈氨酸、酪氨酸、Pyroglutamic acid、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸，其保留時間分別為1.89，2.21，2.19，2.98，3.02，3.05，4.15，5.55 min，[M+H]+精確分子質量分別為147.112 9，175.119 0，118.086 2，182.081 2，130.050 0，132.101 9，166.086 4，205.097 2，二級質譜中均出現(xiàn)[M+H-COOH]+或[M+H-NH3]+的碎片離子。

在負離子模式下找到3種氨基酸，分別是組氨酸、L-4-Hydroxyglutamate semialdehyde、天門冬氨酸，保留時間分別為1.95，2.12，2.13 min；獲得m/z為154.062 4，146.046 0，132.030 3[M-H]-的質譜信號，二級質譜中均出現(xiàn)[M-H-NH3]-及[M-H-COO]-的碎片離子。

2.2.4 核苷類 核苷類是蟲草屬藥材的重要有效成分，腺苷、蟲草素等常作為定量分析的檢測指標。在正離子模式下共找到4種核苷類物質，保留時間為2.22 min獲得m/z136.061 8[M+H]+的質譜信號，二級質譜出現(xiàn)119.034 4,92.023 1質譜峰，根據(jù)數(shù)據(jù)庫匹配出分子式為C5H5N5，推測該化合物為腺嘌呤，二級碎片離子為[M+H-NH3]+和[M+H-NH3-CNH]+；保留時間為2.97 min獲得m/z268.103 9[M+H]+的質譜信號，二級質譜出現(xiàn)136.060 7，119.033 3質譜峰，根據(jù)數(shù)據(jù)庫匹配出分子式為C10H13N5O4，推測該化合物為腺嘌呤核苷，二級碎片離子為[M+H-C5H8O4]+和[M+H-C5H8O4-NH3]+；保留時間為3.01 min獲得m/z284.098 9[M+H]+的質譜信號，二級質譜出現(xiàn)152.055 5，135.029 0質譜峰，根據(jù)數(shù)據(jù)庫匹配出分子式為C10H13N5O5，推測該化合物為鳥苷，二級碎片離子為[M+H-C5H9O4]+和[M+H-C5H9O4-NH3]+；保留時間為3.02 min獲得m/z152.056 6[M+H]+的質譜信號，二級質譜出現(xiàn)135.029 1，110.034 9質譜峰，根據(jù)數(shù)據(jù)庫匹配出分子式為C5H5N5O，推測該化合物為鳥嘌呤，二級碎片離子為[M+H-NH3]+和[M+H-CH2N2]+。

在負離子模式下共找到3種核苷類物質，保留時間為2.12 min獲得m/z250.094 2[M-H]-的質譜信號，二級質譜出現(xiàn)134.046 1質譜峰，根據(jù)數(shù)據(jù)庫匹配出分子式為C10H13N5O3，推測該化合物為蟲草素，二級碎片離子為[M-H-C5H8O3]；保留時間為2.39 min獲得m/z243.062 4[M-H]-的質譜信號，二級質譜出現(xiàn)200.056 5，110.025 0質譜峰，根據(jù)數(shù)據(jù)庫匹配出分子式為C9H12N2O6，推測該化合物為尿苷，二級碎片離子為[M-H-CHNO]-和[M-H-C5H9O4]-。根據(jù)上述分析可知，該類物質多有脫去五元呋喃糖基的二級碎片離子，符合核苷類化合物的裂解規(guī)律。

2.2.5 其 它 結合數(shù)據(jù)庫、相關文獻及二級碎片，本實驗從涼山蟲草醇提物中還鑒定出香草扁桃酸、磷脂酸、4-羥基苯甲醛、6-Succinoaminopurine及gamma-L-Glutamyl-S-(2-carboxy-1-propyl)cysteinylglycine。

2.3 裂解規(guī)律分析

2.3.1D-塔格糖裂解規(guī)律 保留時間為2.16 min化合物[M-H]-的實際測量值為179.056 2，理論值為179.056 1，偏差為0.4 ppm。由二級質譜圖可知m/z為179.056 9[M-H]-的母離子脫去18.011 3 Da生成161.046 0的離子碎片，通過PeakView軟件的Mass Calculators功能計算出H2O的精確質量數(shù)為18.010 02 Da，差值小于0.01 Da，表明該化合物可能會先脫去一分子水。譜庫檢索得到的分子式均為C6H12O6，但僅有D-塔格糖最符合上述二級碎片裂解規(guī)律且各碎片的理論值與實測值之差均小于0.01 Da。該化合物的提取離子流圖及MS/MS圖譜見圖4。

圖4 負離子模式下D-塔格糖的提取離子流圖(A)及MS/MS圖譜(B)Fig.4 XIC(A) and MS/MS(B) spectra of D-tagatose in negative ion mode

2.3.2 腺嘌呤裂解規(guī)律 保留時間為2.22 min化合物[M+H]+的實際測量值為136.061 8，理論值為136.061 8，偏差為0.1 ppm。由二級質譜圖可知m/z為136.061 8[M+H]+的母離子脫去17.026 4 Da生成119.034 4的離子碎片，通過PeakView軟件的Mass Calculators功能計算NH3的精確質量為17.026 00 Da，差值小于0.01 Da，表明該化合物可能先脫去NH3碎片；119.034 4離子再脫去27.011 3 Da生成92.023 1，通過軟件計算出HCN的精確質量數(shù)為27.010 35 Da，相差亦小于0.01 Da，表明該化合物可能又脫掉1個HCN碎片。分析譜庫中檢索得到分子結構與上述二級碎片相印證，僅腺嘌呤最為符合。該化合物的提取離子流圖及MS/MS圖譜見圖5。

2.3.3 香草扁桃酸解規(guī)律 保留時間為4.04 min化合物[M-H]-的實際測量值為197.045 5，理論值為197.045 6，偏差為0.5 ppm。由二級質譜圖可知m/z為197.047 0[M-H]-的母離子脫去30.011 Da生成167.036 0的離子碎片，通過PeakView軟件的Mass Calculators功能計算出CH2O的精確質量數(shù)為30.010 02 Da，差值小于0.01 Da，表明該化合物可能先脫去CH2O碎片；167.036 0離子再脫去18.010 7 Da生成149.025 3，通過軟件計算H2O的精確質量數(shù)為18.010 02，差值同樣小于0.01 Da，表明該化合物可能又脫掉一分子水。167.036 0離子也可脫去46.006 3 Da生成121.029 7，通過軟件計算出HCOOH的精確質量數(shù)為46.004 93 Da，差值為0.001 37 Da，表明該化合物可能含有羧基。將譜庫中檢索得到分子結構與上述二級碎片相互印證，僅香草扁桃酸最為符合。該化合物的提取離子流圖及MS/MS圖譜見圖6。

圖5 負離子模式下腺嘌呤的提取離子流圖(A)及MS/MS圖譜(B)Fig.5 XIC(A) and MS/MS(B) spectra of adenine in negative ion mode

圖6 負離子模式下香草扁桃酸的提取離子流圖(A)及MS/MS圖譜(B)Fig.6 XIC(A) and MS/MS(B) spectra of vanillylmandelic acid in negative ion mode

3 結 論

本文采用信息關聯(lián)(IDA)正、負離子模式分別進行數(shù)據(jù)采集。研究顯示，正離子模式下的質譜響應及峰數(shù)明顯高于負離子，正、負離子分開采集在最大程度上提高了檢測物質的靈敏度，有助于獲得更多化合物信息。文中首次采用超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)飛行時間質譜法(UPLC-Q-TOF-MS)分析涼山蟲草的主要化學成分，并通過PeakView軟件的Formula Finder，Mass Calculators，F(xiàn)ragment Matching等功能結合數(shù)據(jù)庫及二級碎片裂解規(guī)律共鑒定出27個化合物，其中有8個為蟲草中未曾報道物質，鑒定成分中主要包括生物堿、糖苷、氨基酸、核苷類等。該研究結果為涼山蟲草藥效學、毒理學研究，以及后續(xù)質量標準制定提供了科學依據(jù)。

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Analysis of Chemical Constituents inCordycepsliangshanensisby UPLC-Q-TOF-MS

QIN Wei-han，LIU Xiang，YANG Yong，ZHANG Xiao-mei，GUO Yan-lei，LIU Fei*

(Chongqing Academy of Chinese Materia Medica，Chongqing 400065,China)

A UPLC-Q-TOF-MS method was developed for the analysis and identification of main chemical constituents in the extract ofCordycepsliangshanensis，by an Agilent SB-C18(50 mm×4.6 mm，1.8 μm) column with gradient elution using of 0.1% formic acid in water and acetonitrile as mobile phase at a flow rate of 0.25 mL/min.The column temperature was set at 30 ℃.MS analysis was based on information associated mode(IDA) with positive and negative ions collection.By using feature of PeakView such as Formula Finder，matching the mass spectrometry data of each chromatographic peak in the database and the cleavage law of each peak′s level two fragment，total of 27 compounds inCordycepsliangshanensiswere identified，in which 8 compounds in Cordyceps substance had never been reported before.The main chemical constituents include alkaloids，glycosides，nucleosides，amino acids，etc.The method is accurate，reliable and efficient，and is suitable for the rapid identification of ingredients inCordycepsliangshanensis.It provides a reference for the development and utilization ofCordycepsliangshanensisand clarification of its efficacy and material basis.

Cordycepsliangshanensis；UPLC-Q-TOF-MS；cleavage law；chemical constituents

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.03.003

2016-09-09；

2016-10-20

國家自然科學基金資助項目(30901964,81072997)；國家重大新藥創(chuàng)制重大新藥專項項目(2013ZX0101108)

O657.63；TQ460.72

A

1004-4957(2017)03-0312-07

*通訊作者：劉 飛，研究員，研究方向：冬蟲夏草人工培植，Tel:023-89029026，E-mail：lfei1976@126.com