蘇帆，薛佳，楊曦，鄧紅，孟永宏，郭玉蓉

（陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，西安 710119）

酚酸對紅肉蘋果花色苷輔色效果及穩(wěn)定性的影響

蘇帆，薛佳，楊曦，鄧紅，孟永宏，郭玉蓉

（陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，西安 710119）

【目的】研究酚酸對‘紫紅1號’新疆紅肉蘋果花色苷的輔色效應(yīng)，以及輔色后花色苷的穩(wěn)定性，旨在為紅肉蘋果花色苷利用提供理論依據(jù)和參考?！痉椒ā坷贸曒o助法提取紅肉蘋果花色苷，采用pH示差法測定總花色苷含量，高效液相色譜法（HPLC）分析花色苷組分及含量。在pH 3.0緩沖液體系中，分別選用咖啡酸、阿魏酸、綠原酸、沒食子酸對紅肉蘋果花色苷進(jìn)行輔色，并將不同處理的樣品分別置于水浴加熱、光照、H2O2氧化和Fe3+4種不同條件下，研究4種酚酸對紅肉蘋果花色苷的輔色效果和穩(wěn)定性的影響。【結(jié)果】‘紫紅1號’紅肉蘋果中花色苷含量為268.6 mg·kg-1，主要成分為矢車菊-3-半乳糖苷、矢車菊-3-葡萄糖苷、矢車菊-3-阿拉伯糖苷，其中矢車菊-3-半乳糖苷占總花色苷含量的75.34%。在水體系中，紅肉蘋果花色苷的最大吸收波長為515 nm，花色苷的顏色和515 nm處吸光度（A515nm）隨pH變化而改變。濃度為0.01 mol·L-1的咖啡酸、阿魏酸、綠原酸、沒食子酸對紅肉蘋果花色苷均能產(chǎn)生明顯的輔色效應(yīng)，輔色后花色苷溶液產(chǎn)生了不同程度的增色及紅移效應(yīng)（5—11 nm），其中阿魏酸處理組的紅移效應(yīng)最為顯著，紅移幅度高達(dá)11 nm。各試驗(yàn)組樣品分別在60℃、80℃、100℃水浴中加熱1 h后，綠原酸和沒食子酸對紅肉蘋果花色苷的保護(hù)作用最好，其次是阿魏酸和咖啡酸。在室外自然光照條件下，紅肉蘋果花色苷溶液的半衰期少于7 d，酚酸輔色后，顯著增強(qiáng)了花色苷的光穩(wěn)定性（P＜0.05），其中綠原酸使紅肉蘋果花色苷半衰期延長了170.87%，咖啡酸、沒食子酸、阿魏酸分別使花色苷半衰期延長了142.68%、39.56%、23.05%。濃度為0.1%—0.6%的H2O2使紅肉蘋果花色苷的紅色迅速褪去，加入酚酸后花色苷的抗氧化性顯著提高，當(dāng)花色苷溶液中H2O2濃度為0.1%時(shí)，氧化1 h后，對照組花色苷保留率僅為38.39%，而阿魏酸、綠原酸、咖啡酸、沒食子酸處理組花色苷保留率分別為63.10%、59.95%、57.95%、48.81%，均顯著高于對照組（P＜0.05）。濃度為2.5×10-4—1.0×10-3mol·L-1的Fe3+對花色苷有不利影響，加入酚酸后花色苷穩(wěn)定性明顯增強(qiáng)，其中沒食子酸處理組紅肉蘋果花色苷穩(wěn)定性最強(qiáng)，綠原酸、咖啡酸次之，阿魏酸處理組花色苷穩(wěn)定性最弱，各處理組花色苷A515nm均顯著大于對照組花色苷（P＜0.05）?！窘Y(jié)論】紅肉蘋果花色苷顏色受pH影響較大，pH＜3.0時(shí)，色澤鮮紅且性質(zhì)穩(wěn)定?？Х人?、阿魏酸、綠原酸、沒食子酸使紅肉蘋果花色苷產(chǎn)生不同程度的增色及紅移效應(yīng)，且顯著增強(qiáng)了花色苷在加熱、光照、氧化、Fe3+條件下的穩(wěn)定性。

紅肉蘋果；花色苷；酚酸；咖啡酸；阿魏酸；綠原酸；沒食子酸；輔色；穩(wěn)定性

0 引言

【研究意義】新疆紅肉蘋果（Malus sieversiif.neidzwetzkyana（Dieck）Langenf）是新疆野蘋果的變型，因富含花色苷，其枝、葉、花、果皮及果肉均為紅色[1]。花色苷（anthocyanin）是植物中廣泛存在的一類水溶性天然色素[2]，具有強(qiáng)抗氧化性、抗炎性，可以抑制癌癥、心血管疾病、糖尿病、肥胖等疾病[3-8]。植物花色苷作為一種天然食用色素，資源豐富、安全健康，在食品加工產(chǎn)業(yè)中有較好的應(yīng)用前景。但由于花色苷結(jié)構(gòu)特殊，極易受pH、氧氣、光照、溫度、酶等因素影響而降解褪色[9-12]，導(dǎo)致其應(yīng)用受到嚴(yán)重制約。輔色是一種常用的提高花色苷穩(wěn)定性的方法，探究不同酚酸對‘紫紅1號’紅肉蘋果花色苷的輔色作用，以及在加熱、光照、氧化和金屬離子環(huán)境中對花色苷穩(wěn)定性的影響，對紅肉蘋果花色苷的加工利用具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】目前，紅肉蘋果花色苷的組分已有報(bào)道，MAZZA等[13]鑒定了紅肉蘋果‘Scugog’花色苷組分，王燕等[14]鑒定了‘紫紅1號’紅肉蘋果果肉的花色苷成分，兩種紅肉蘋果中的主要花色苷均為矢車菊-3-半乳糖苷、矢車菊-3-葡萄糖苷、矢車菊-3-木糖苷、矢車菊-3-阿拉伯糖苷，但其含量不同。王延玲等[1]以新疆紅肉蘋果‘夏紅肉’為試材，證明了其果皮和果肉中花色苷的主要成分均為矢車菊-3-半乳糖苷，但其積累模式及調(diào)控基因的表達(dá)情況不同。WANG等[15]測定了4種紅肉蘋果和兩種非紅肉蘋果中的總酚、花色苷及抗氧化性。在花色苷輔色方面，國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量研究。EIRO等[16]研究了阿魏酸、咖啡酸、迷迭香酸、綠原酸、芥子酸對5種花色苷單體的輔色作用，5種酚酸使花色苷產(chǎn)生了不同程度的增色和紅移效果，且迷迭香酸可以使錦葵-3-葡萄糖苷的顏色增強(qiáng)260%，阿魏酸和咖啡酸可以顯著提高天竺葵-3-葡萄糖苷的儲藏穩(wěn)定性。BAKOWSKA等[17]的研究表明綠原酸、槲皮素等酚類均可以提高矢車菊-3-葡萄糖苷的光熱穩(wěn)定性，且黃芩黃酮效果最佳。董楠等[18]研究了咖啡酸對胭脂蘿卜紅色素輔色作用及其穩(wěn)定性的影響，試驗(yàn)表明酸性條件下咖啡酸可使花色苷的Aλmax顯著增大，并增加了其在光、熱及金屬離子環(huán)境下的穩(wěn)定性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】國內(nèi)外對紅肉蘋果花色苷的研究多集中于不同品種紅肉蘋果中花色苷含量、抗氧化性及其果皮果肉呈色機(jī)理等方面，迄今尚未見紅肉蘋果花色苷輔色及其應(yīng)用的相關(guān)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以‘紫紅1號’新疆紅肉蘋果為原材料，提取、純化得到紅肉蘋果花色苷提取物，研究加熱、光照、氧化及金屬離子對紅肉蘋果花色苷的影響，以及4種條件下不同酚酸對紅肉蘋果花色苷穩(wěn)定性的增強(qiáng)效果，選出最佳輔色劑，為紅肉蘋果的加工利用提供參考。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2016年5—6月在陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院進(jìn)行。

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 ‘紫紅1號’新疆紅肉蘋果于2015年8月下旬采摘于新疆伊犁，將成熟度相同、大小均一、無病蟲害、無機(jī)械損傷的果實(shí)帶柄采摘，采后將果實(shí)裝入泡沫箱中，低溫冷鏈運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，將果實(shí)置于-20℃冰箱貯藏，待用。

1.1.2 試劑 矢車菊-3-半乳糖苷、矢車菊-3-阿拉伯糖苷、矢車菊-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純），上海Sigma公司；阿魏酸、咖啡酸、綠原酸、沒食子酸（分析純），上海源葉生物科技有限公司；三氯化鐵（分析純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；過氧化氫（分析純），天津市興復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 試驗(yàn)儀器

真空冷凍干燥機(jī)（LGJ-18C），北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；高效液相色譜（Dionex UPLC），Dionex公司（美國）；紫外可見分光光度計(jì)（UV—2100），Unico公司（美國）；全波長酶標(biāo)儀（Multiskan Go），Thermo公司（美國）；層析柱（內(nèi)徑4 cm，長60 cm），西安市碑林區(qū)宏業(yè)儀器化玻采供站。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.3.1 提取紅肉蘋果花色苷 將冷藏的紅肉蘋果在室溫下解凍30 min后，去除果核、果梗，用打漿機(jī)破碎3 min，按料液比1∶4（m/V），用60%乙醇溶液（含0.01% HCl）提取。利用超聲波輔助提取2 h，超聲功率為300 W，溫度40℃，抽濾后收集濾液，再次超聲提取濾渣，將兩次濾液合并，40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積1/4。將濃縮液于4℃冰箱靜置12 h，以4 000 r/min為轉(zhuǎn)速，離心10 min，收集上清液。用AB-8大孔樹脂進(jìn)行洗脫，洗脫溶劑為70%乙醇溶液（含0.01% HCl），收集洗脫液于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，-60℃真空冷凍干燥24 h后得到花色苷提取物。

1.3.2 測定紅肉蘋果總花色苷含量 參照GIUSTI等[19]的方法，使用分光光度計(jì)，采用pH示差法測定紅肉蘋果中總花色苷含量。

1.3.3 鑒定紅肉蘋果花色苷成分及含量 參照陳磊[20]的方法，將花色苷樣品溶于70%甲醇溶液（pH 3.0），經(jīng)0.22 μm的有機(jī)系濾膜過濾。使用Dionex UPLC液相分析系統(tǒng)（Dionex，美國）和Dikma HPLC柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相溶液A為乙腈（色譜純），流動相溶液B為1‰三氟乙酸。柱溫：30℃；流動相速度：1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量：20.0 μL，按表1程序進(jìn)行梯度洗脫，在500 nm波長下進(jìn)行紅肉蘋果花色苷成分的檢測。重復(fù)3次進(jìn)樣。

表1 花色苷HPLC梯度洗脫程序Table 1 The HPLC gradient elution procedure of anthocyanin

1.3.4 不同pH對紅肉蘋果花色苷吸收光譜的影響配制pH 1.0—7.0的紅肉蘋果花色苷溶液（1.0 mg·mL-1），用全波長酶標(biāo)儀對其進(jìn)行波長掃描（400—700 nm），繪制特征吸收光譜。

1.3.5 不同酚酸對紅肉蘋果花色苷吸收光譜的影響稱取0.2500 g紅肉蘋果花色苷粉末于250 mL容量瓶中，用pH 3.0磷酸緩沖液（0.2 mol·L-1）定容，使花色苷濃度為1.0 mg·mL-1。將一定量咖啡酸、阿魏酸、綠原酸和沒食酸溶于0.5 mL無水乙醇后，分別加入9.5 mL花色苷溶液中混勻，使樣品溶液中輔色劑濃度為0.01 mol·L-1。配制5種溶液：對照組花色苷溶液、咖啡酸處理溶液、阿魏酸處理溶液、綠原酸處理溶液、沒食子酸處理溶液，用全波長酶標(biāo)儀對紅肉蘋果花色苷溶液進(jìn)行波長掃描（450—650 nm），繪制特征吸收光譜。

1.3.6不同酚酸對紅肉蘋果花色苷穩(wěn)定性影響

（1）熱穩(wěn)定性

配制1.3.5所述5種溶液，測定其在λmax處吸光度后，分別倒入10 mL旋蓋離心管中，擰緊旋蓋，做好標(biāo)記。將各試驗(yàn)組樣品分別置于60℃、80℃、100℃水浴加熱1 h，迅速冷卻后，用酶標(biāo)儀測定其吸光度。每個樣品進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

（2）光照穩(wěn)定性

配制1.3.5所述5種溶液，測定其在λmax處吸光度后，分別倒入10 mL旋蓋離心管中，擰緊旋蓋，做好標(biāo)記。將各試驗(yàn)組樣品置于實(shí)驗(yàn)室窗臺自然光下（白天室外平均氣溫30℃），每4天取一次樣，用酶標(biāo)儀測定其吸光度。每個樣品進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

（3）氧化穩(wěn)定性

配制1.3.5所述5種溶液，測定其在λmax處吸光度后，分別倒入10 mL旋蓋離心管中，加入一定體積的H2O2（30%），使樣品溶液中H2O2濃度分別為0.1%、0.3%、0.6%。用酶標(biāo)儀測定各試驗(yàn)組樣品在1 h內(nèi)吸光度變化（每10 min測一次），室溫25℃。每個樣品進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

（4）金屬離子穩(wěn)定性

稱取0.1250 g紅肉蘋果花色苷粉末于250 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，使花色苷濃度為0.5 mg·mL-1。將一定量咖啡酸、阿魏酸、綠原酸和沒食子酸溶于0.5 mL無水乙醇后，分別加入9.5 mL花色苷溶液中混勻，使樣品溶液中輔色劑濃度為0.01 mol·L-1。隨后加入硫酸亞鐵、三氯化鐵、硫酸銅、三氯化鋁溶液，由于Fe2+、Cu2+、Al3+對紅肉蘋果花色苷顏色影響不明顯，故選用Fe3+對花色苷進(jìn)行處理。在各組花色苷中加入三氯化鐵溶液，使Fe3+濃度為2.5×10-4、5.0×10-4、1.0 ×10-3mol·L-1，并用HCl調(diào)至pH 3.0，于室溫（25℃）下靜置3 h后，用酶標(biāo)儀測定各試驗(yàn)組吸光度。每個樣品進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

1.3.7 紅肉蘋果花色苷保留率[18]及半衰期[21]計(jì)算

式中：A1表示處理后溶液在λmax處吸光度；A0表示原始吸光度；R表示花色苷保留率；k表示一級反應(yīng)速率；t1/2表示半衰期，即花色苷降解一半所用時(shí)間。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)與分析 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析采用DPS 7.05軟件，多重比較采用Duncan新復(fù)極差法（P＜0.05為差異顯著）。采用Origin 8.0軟件繪制圖表。

2 結(jié)果

2.1 紅肉蘋果花色苷含量分析結(jié)果

紅肉蘋果花色苷的最大吸收波長為515 nm，通過pH示差法測得紅肉蘋果中花色苷含量為268.6 mg·kg-1，與王燕[14]測定‘紫紅1號’紅肉蘋果花色苷的含量228.3 mg·kg-1相近。

圖1 紅肉蘋果花色苷組成分析Fig. 1 Analysis of constituents in red-fleshed apple anthocyanins

由圖1可知，紅肉蘋果花色苷中主要成分為矢車菊-3-半乳糖苷、矢車菊-3-葡萄糖苷、矢車菊-3-阿拉伯糖苷。矢車菊-3-半乳糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=52984x+ 2003.6，R2=0.9998，計(jì)算可得紅肉蘋果中矢車菊-3-半乳糖苷含量為202.4 mg·kg-1，占總花色苷含量的75.34%，與王燕[14]測定的73.37%基本一致。

2.2 pH對紅肉蘋果花色苷吸收光譜的影響

紅肉蘋果花色苷的顏色受pH影響較大，在pH＜3.0的酸性溶液中，花色苷呈深紅色；當(dāng)pH逐漸升高時(shí)，花色苷的顏色由紅色變?yōu)榈凵?；?dāng)pH＞5.0時(shí)，花色苷溶液變成黃褐色。如圖2，在pH 1.0—5.0磷酸緩沖溶液中，紅肉蘋果花色苷的最大吸收波長均為515 nm。隨著pH增大，花色苷溶液在515nm處的吸光度顯著減?。≒＜0.05）；當(dāng)pH＞5.0時(shí)，花色苷特征吸收峰消失。

圖2 不同pH對紅肉蘋果花色苷吸收光譜影響Fig. 2 The absorption spectra of red-fleshed apple anthocyanins at different pH values

2.3 不同酚酸對紅肉蘋果花色苷吸收光譜的影響

在紅肉蘋果花色苷溶液（pH 3.0）中加入4種酚酸后溶液pH保持穩(wěn)定，紅肉蘋果花色苷產(chǎn)生了明顯的增色效應(yīng)和紅移現(xiàn)象。如圖3所示，處理組花色苷的最大吸光度（）均顯著高于對照組花色苷（P＜0.05），4種酚酸均使紅肉蘋果花色苷在最大吸收波長處的吸光度增加10%以上?？Х人帷⑽核?、綠原酸和沒食子酸分別使花色苷最大吸收波長由515 nm變?yōu)?25、526、524和520 nm，即△分別為10、11、9和5 nm。

圖3 不同酚酸對紅肉蘋果花色苷吸收光譜的影響Fig. 3 The absorption spectra of red-fleshed apple anthocyanins

2.4 酚酸輔色對紅肉蘋果花色苷熱穩(wěn)定性的影響

不同溫度下加熱1 h后，對照組和處理組紅肉蘋果花色苷的最大吸光度（）均顯著減小（P＜0.05），加熱過程中，咖啡酸處理組花色苷的△λmax稍有減小，其他各組花色苷的△基本保持不變。

如圖4所示，加熱前和加熱后，各處理組花色苷的吸光度均顯著大于對照組花色苷（P＜0.05）。加熱溫度為60℃時(shí)，綠原酸、沒食子酸和阿魏酸處理組花色苷的吸光度無顯著差異（P＞0.05），且大于咖啡酸處理組；80℃時(shí)，綠原酸和沒食子酸處理組花色苷的吸光度最大且無顯著差異（P＞0.05），與其余各試驗(yàn)組間存在顯著差異（P＜0.05）；100℃時(shí)，綠原酸和沒食子酸處理組間無顯著差異（P＞0.05），阿魏酸和咖啡酸處理組也無顯著差異（P＞0.05）。

綜上所述，在加熱條件下，綠原酸和沒食子酸可使紅肉蘋果花色苷溶液保留最大吸光度。

2.5 酚酸輔色對紅肉蘋果花色苷光照穩(wěn)定性的影響

在室外自然光照條件下，紅肉蘋果花色苷很不穩(wěn)定，容易降解褪色。光照過程中，各試驗(yàn)組花色苷的持續(xù)減小，△也有所減小。如圖5所示，光照20 d后，對照組花色苷的紅色已完全褪盡，咖啡酸處理組呈橙紅色，阿魏酸處理組僅有少量紅色殘余，綠原酸處理組紅色較深，沒食子酸處理組呈淡紅色。

如圖6所示，光照0—16 d時(shí)，紅肉蘋果花色苷降解速率較快，16—20 d時(shí)，花色苷降解趨于平緩。第20天時(shí)，綠原酸處理組花色苷的吸光度顯著高于咖啡酸、沒食子酸、阿魏酸處理組及空白組花色苷，各試驗(yàn)組間均呈顯著性差異（P＜0.05）。

圖4 不同酚酸對紅肉蘋果花色苷熱穩(wěn)定性的影響Fig. 4 Effect of phenolic acids on stability of red-fleshed apple anthocyanins at different temperatures

紅肉蘋果花色苷的光降解符合一級動力學(xué)反應(yīng)方程，OCHOA等[22]發(fā)現(xiàn)光對樹莓、甜櫻桃及歐洲酸櫻桃中花色苷的降解也為一級動力學(xué)反應(yīng)。如圖7所示，自然光照下，紅肉蘋果花色苷降解速率較快，酚酸輔色減緩了花色苷降解速率，綠原酸處理組花色苷降解速率最慢，其次是咖啡酸、沒食子酸、阿魏酸處理組，對照組花色苷降解速率最快。

如表2所示，光照條件下空白花色苷半衰期少于7 d，4種酚酸顯著（P＜0.05）增強(qiáng)了花色苷的光照穩(wěn)定性。其中，綠原酸對紅肉蘋果花色苷的保護(hù)作用最佳，使其半衰期延長了170.87%，咖啡酸、沒食子酸、阿魏酸輔色分別使花色苷半衰期延長了142.68%、39.56%、23.05%。

圖5 光照前后花色苷的顏色變化Fig. 5 The picture of red-fleshed apple anthocyanins solution before and after lighting

圖6 不同酚酸對紅肉蘋果花色苷吸光度的影響Fig. 6 Effect of phenolic acids on absorbance of red-fleshed apple anthocyanins in light

圖7 不同酚酸對紅肉蘋果花色苷光降解速率的影響Fig. 7 Effect of phenolic acids on degradation speed of redfleshed apple anthocyanins in light

表2 紅肉蘋果花色苷的降解動力學(xué)參數(shù)Table 2 Degradation kinetics parameters of red-fleshed apple anthocyanins with different phenolic acids

2.6 酚酸輔色對紅肉蘋果花色苷氧化穩(wěn)定性的影響

紅肉蘋果花色苷溶液中加入H2O2，氧化10 min后，各試驗(yàn)組的Aλmax顯著減?。≒＜0.05），△λmax保持不變。如圖8-a所示，樣品中H2O2濃度為0.1%時(shí)，花色苷氧化速率稍慢，60 min后，對照組花色苷保留率為38.39%，阿魏酸、綠原酸、咖啡酸、沒食子酸處理組保留率顯著高于對照組（P＜0.05），分別為63.10%、59.95%、57.95%、48.81%。

如圖8-b所示，H2O2濃度為0.3%時(shí)，花色苷氧化速率加快，4種酚酸輔色樣品的花色苷保留率均顯著高于空白對照組（P＜0.05）。反應(yīng)60 min后，對照組花色苷保留率僅為15.05%；阿魏酸處理組的抗氧化效果最佳，花色苷保留率約為對照組的2倍（30.28%）；咖啡酸和綠原酸處理組次之，花色苷保留率分別為27.68%、26.66%；沒食子酸處理組的抗氧化效果較弱，花色苷保留率為18.89%。

如圖8-c所示，H2O2濃度為0.6%時(shí)，紅肉蘋果花色苷迅速褪色，酚酸顯著減緩了花色苷的氧化程度（P＜0.05）。氧化60 min后，對照組花色苷保留率僅為10.86%，阿魏酸處理組的抗氧化作用最佳，咖啡酸和綠原酸處理組次之，沒食子酸處理組的抗氧化作用較弱，花色苷保留率分別為17.19%、15.81%、14.54%、11.85%。

圖8 不同酚酸對紅肉蘋果花色苷氧化穩(wěn)定性的影響Fig. 8 Effect of phenolic acids on stability of red-fleshed apple anthocyanins in H2O2

2.7 酚酸輔色對紅肉蘋果花色苷金屬離子穩(wěn)定性的影響

Fe3+對紅肉蘋果花色苷有不利影響，XIONG等[23]的試驗(yàn)證明Fe3+對黑加侖花色苷也有破壞作用。如圖9所示，F(xiàn)e3+的濃度為2.5×10-4mol·L-1時(shí)，對照組紅肉蘋果花色苷顏色變淺，酚酸處理組樣品幾乎未受影響；濃度為5.0×10-4mol·L-1時(shí)，對照組花色苷顏色變淺、變暗，酚酸處理組顏色變暗仍保留較好的紅色；濃度為1.0×10-3mol·L-1時(shí)，對照組花色苷迅速變黑（失去特征吸收峰），酚酸處理組樣品變?yōu)檩^暗的深紅色（仍存在最大吸收峰）。

圖9 不同酚酸對紅肉蘋果花色苷金屬離子穩(wěn)定性的影響Fig. 9 Effect of phenolic acids on stability of red-fleshed apple anthocyanins in Fe3+

3 討論

3.1 pH對紅肉蘋果花色苷的影響

紅肉蘋果花色苷在不同pH條件下呈現(xiàn)出不同的顏色，這與其結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。當(dāng)溶液酸性很強(qiáng)（pH＜3.0）時(shí)，由于黃烊鹽正離子（AH+）占主導(dǎo)地位[24]，紅肉蘋果花色苷呈深紅色。隨著pH升高（pH 4.0—5.0），黃烊鹽正離子被水親核攻擊變成無色的甲醇假堿[18]，紅肉蘋果花色苷溶液紅色減弱。當(dāng)pH繼續(xù)升高（pH 6.0—7.0）時(shí)，甲醇假堿失去A-環(huán)和B-環(huán)之間的共軛雙鍵變?yōu)椴槎?，因此不能吸收可見光[25]，紅肉蘋果花色苷溶液失去特征性吸收峰。

3.2 酚酸對紅肉蘋果花色苷的輔色效果

本研究發(fā)現(xiàn)，4種酚酸均使紅肉蘋果花色苷產(chǎn)生了顯著的增色和紅移效果。這可能是因?yàn)榉铀崤c花色苷發(fā)生了分子間輔色，兩者以非共價(jià)鍵和氫鍵結(jié)合，形成水平[26]或垂直重疊[27]的復(fù)合物，使紅肉蘋果花色苷呈色加強(qiáng)?！盎ㄉ?輔色劑”分子間上下疊加的π-π共軛作用及一些氫鍵作用使花色苷極性或電子分布下降，使其在可見光范圍內(nèi)的最大吸收波長紅移[28]。輔色效應(yīng)隨花色苷的糖基化、甲氧基化程度增大而增強(qiáng)[29]，而羥基化會減弱輔色效應(yīng)[16]?？Х人岷桶⑽核崾侨夤鹚?，且阿魏酸有一個甲氧基，綠原酸是共軛肉桂酸的衍生物，沒食子酸是三羥基苯甲酸，4種酚酸結(jié)構(gòu)不同，因而產(chǎn)生了不同的輔色效應(yīng)。本試驗(yàn)中，咖啡酸、阿魏酸、綠原酸、沒食子酸使紅肉蘋果花色苷最大吸收波長紅移了10、11、9和5 nm，與EIRO等[16]對矢車菊-3-葡萄糖苷輔色的研究結(jié)果相近。

3.3 酚酸對紅肉蘋果花色苷穩(wěn)定性的影響

溫度對紅肉蘋果花色苷穩(wěn)定性影響較大，溫度越高，花色苷越不穩(wěn)定。本試驗(yàn)中，紅肉蘋果花色苷溶液在60℃水浴條件下降解速率最慢，隨著溫度升高，花色苷降解速率加快，在100℃條件下紅肉蘋果花色苷降解速率最快。KAMERER等[30]認(rèn)為加熱過程中花色苷存在著結(jié)構(gòu)互變，黃烊鹽離子水化為假堿以及假堿轉(zhuǎn)化為查耳酮均為吸熱反應(yīng)，隨著溫度升高，平衡向吸熱方向進(jìn)行，當(dāng)假堿和查爾酮結(jié)構(gòu)為花色苷的主要存在形式時(shí)，花色苷溶液褪色。在不同溫度條件下加熱1 h后，處理組花色苷的吸光度顯著（P＜0.05）高于對照組花色苷，可能是因?yàn)檩o色劑和花色苷的分子間作用力減弱了花色苷的熱降解作用[31]，增強(qiáng)了花色苷的熱穩(wěn)定性。MAZZA等[29]認(rèn)為花色苷和輔色劑間的反應(yīng)是放熱過程，高溫會使“花色苷-輔色劑”分解為無色的混合物。因此，本試驗(yàn)中，酚酸對紅肉蘋果花色苷的輔色效果隨溫度升高而有所減弱，KUCHARSKA等[32]也有相似的研究結(jié)果。

紅肉蘋果花色苷對光敏感，光照條件下極易褪色，這可能是因?yàn)榛鶓B(tài)的花色苷吸收光能后轉(zhuǎn)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)的花色苷，激發(fā)態(tài)的花色苷水解開環(huán)形成中間產(chǎn)物，隨后繼續(xù)降解為酚酸和醛類[33]，失去色澤。本研究得出，紅肉蘋果花色苷在室外自然光照下的半衰期（t1/2）僅約為6 d，綠原酸、咖啡酸分別使其半衰期延長了170.87%和142.68%。這與BAKOWSKA[17]、YAN[34]、XU[31]等的試驗(yàn)結(jié)果相似，說明酚酸輔色能夠有效抑制光照引起的花色苷降解，提高花色苷的光穩(wěn)定性。此外，由于酚酸本身具有抗紫外光的能力，游離于溶液中時(shí)可優(yōu)先吸收紫外線（UV），因而減少對花色苷的破壞[35]。

H2O2可以使紅肉蘋果花色苷降解，?ZKAN等[36]研究發(fā)現(xiàn)其作用機(jī)制主要是H2O2裂解生成了大量的·OH和·OOH自由基，使花色苷苯環(huán)被破壞，迅速褪色。而咖啡酸、阿魏酸、綠原酸、沒食子酸均為酚酸類化合物，具有還原性，可與H2O2發(fā)生氧化還原反應(yīng)，減少·OH等自由基的產(chǎn)生，保護(hù)花色苷不被降解。本研究中4種酚酸均顯著（P＜0.05）減弱了H2O2對紅肉蘋果花色苷的氧化作用。

本試驗(yàn)證明，F(xiàn)e3+對紅肉蘋果花色苷有一定的破壞作用，濃度越高，破壞作用越強(qiáng)；在Fe3+離子濃度相同情況下，4種酚酸對紅肉蘋果花色苷產(chǎn)生了較好的保護(hù)效果。XIONG等[23]研究表明，有氧條件下Fe3+催化花色苷發(fā)生氧化反應(yīng)，而酚酸中的酚羥基作為供電子基團(tuán)具有強(qiáng)抗氧化性，有效減弱了花色苷的氧化分解。

4 結(jié)論

紅肉蘋果花色苷的顏色受pH影響較大，強(qiáng)酸（pH＜3.0）環(huán)境更利于其加工儲藏?？Х人帷⑽核?、綠原酸、沒食子酸4種酚酸對紅肉蘋果花色苷有明顯增色作用和紅移效果，并能顯著提高紅肉蘋果花色苷的穩(wěn)定性。加熱條件下，綠原酸和沒食子酸對紅肉蘋果花色苷溶液具有較好的保護(hù)作用；光照時(shí)，綠原酸對紅肉蘋果花色苷的降解具有最佳抑制效果；阿魏酸可有效防止紅肉蘋果花色苷在H2O2中的氧化；沒食子酸可以顯著減少Fe3+對紅肉蘋果花色苷的不利影響。

[1] 王延玲, 張艷敏, 馮守千, 宋楊, 徐玉亭, 張友朋, 陳學(xué)森. 新疆紅肉蘋果果皮果肉呈色差異機(jī)理. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 45(13): 2771-2778.

WANG Y L, ZHANG Y M, FENG S Q, SONG Y, XU Y T, ZHANG Y P, CHEN X S. The mechanism of red coloring difference between skin and cortex inMalus sieversiif.neidzwetzkyana(Dieck) Langenf.Scientia Agricultura Sinica, 2012, 45(13): 2771-2778. (in Chinese)

[2] WANG H, CAO G, PRIOR R L. Oxygen radical absorbing capacity of anthocyanins.Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1997, 45: 304-309.

[3] DIACONEASA Z, LEOPOLD L, RUGINA D, AYVAZ H, SOCACIU C. Antiproliferative and antioxidant properties of anthocyanin rich extracts from blueberry and blackcurrant juice.International Journal of Molecular Sciences, 2015, 16(2): 2352-2365.

[4] KIKURA M, LEVY J H, SAFON R A, LEE M K, SZLAM F. The influence of red wine or white wine intake on platelet function and viscoelastic property of blood in volunteers.Platelets, 2004, 15(1): 37-41.

[5] CHABIR N, IBRAHIM H, ROMDHANE M, VALENTIN A, MOUKARZEL B, MARS M, BOUAJILA J. Seeds ofPeganum harmalaL. Chemical analysis, antimalarial and antioxidant activities, and cytotoxicity against human breast cancer cells.Medicinal Chemistry, 2015, 11(1): 94-101.

[6] JENNINGS A, WELCH A A, FAIRWEATHER-TAIT S J, KAY C, MINIHANE A M, CHOWIENCZYK P, JIANG B, CECELJA M, SPECTOR T, MACGREGOR A, CASSIDY A. Higher anthocyanin intake is associated with lower arterial stiffness and central blood pressure in women.The American Journal of Clinical Nutrition, 2012, 96(4): 781-788.

[7] XIAO J B, CHEN X Q, JIANG X Y, HILCZER M, TACHIYA M. Probing the interaction of trans-resveratrol with bovine serum albumin: A fluorescence quenching study with tachiya model.Journal of Fluorescence, 2008, 18(3/4): 671-678.

[8] BENN T, KIM B, PARK Y K, WEGNER C J, HARNESS E, NAM T G, KIM D O, LEE J S, LEE J L. Polyphenol-rich blackcurrant extract prevents inflammation in diet-induced obese mice.Journal of Nutritional Biochemistry, 2014, 25(10): 1019-1025.

[9] CASTA?EDA-OVANDO A, PACHECO-HERNáNDEZ M D L, PáEZ-HERNáNDEZ M E, RODRíGUEZ J A,GALáN-VIDAL C A. Chemical studies of anthocyanins: A review.Food Chemistry, 2009, 113(4): 859-871.

[10] BORDENAVE N, HAMAKER B R, FERRUZZI M G. Nature and consequences of non-covalent interactions between flavonoids and macronutrients in foods.Food & Function, 2014, 5(1): 18-34.

[11] HUBBERMANN E M, HEINS A, STOCKMANN H, SCHWARZ K. Influence of acids, salt, sugars and hydrocolloids on the colour stability of anthocyanin rich black currant and elderberry concentrates.European Food Research and Technology, 2006, 223(1): 83-90.

[12] JAKOBEK L. Interactions of polyphenols with carbohydrates, lipids and proteins.Food Chemistry, 2015, 175: 556-567.

[13] MAZZA G, VELIOGLU Y S. Anthocyanins and other phenolic compounds in fruits of red-flesh apples.Food Chemistry, 1992, 43(2): 113-117.

[14] 王燕, 陳學(xué)森, 劉大亮, 王傳增, 宋楊, 陳曉流, 張艷敏.‘紫紅1號’紅肉蘋果果肉抗氧化性及花色苷分析. 園藝學(xué)報(bào), 2012, 39(10): 1991-1998.

WANG Y, CHEN X S, LIU D L, WANG C Z, SONG Y, CHEN X L, ZHANG Y M. Antioxidant activity and anthocyanins analysis of pulp in ‘Zihong 1’ red-flesh apple.Acta Horticulturae Sinica, 2012, 39(10): 1991-1998. (in Chinese)

[15] WANG X Q, LI C, LIANG D, ZOU Y, LI P, MA F. Phenolic compounds and antioxidant activity in red-fleshed apples.Journal of Functional Foods, 2015, 18: 1086-1094.

[16] EIRO M J, HEINONEN M. Anthocyanin color behavior and stability during storage: effect of intermolecular copigmentation.Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2002, 50: 7461-7466.

[17] BAKOWSKA A, KUCHARSKA A Z, OSZMIANSKI J. The effects of heating, UV irradiation, and storage on stability of the anthocyaninpolyphenol copigment complex.Food Chemistry, 2003, 81: 349-355.

[18] 董楠, 宋會歌, 劉嘉, 趙國華. 咖啡酸對胭脂蘿卜紅色素輔色作用及穩(wěn)定性的影響. 食品科學(xué), 2011, 32(7): 61-64.

DONG N, SONG H G, ZHAO G H. Effect of caffeic acid on co-pigmentation and stability of kermes radish red pigment.Food Science, 2011, 32(7): 61-64. (in Chinese)

[19] GIUSTI M M, WROLSTAD R E. Characterization and measurement of anthocyanins by UV-visible spectroscopy.Protocols in Food Analytical Chemistry, 2001. DOI: 10.1002/0471142913.

[20] 陳磊. 采前ALA/GNT處理和氣調(diào)貯藏方式對蘋果花青苷及相關(guān)基因表達(dá)的影響[D]. 西安: 陜西師范大學(xué), 2015.

CHEN L. The effect of the compound treatment of ALA/GNT at pre-harvest period and controlled atmosphere storage on apple Anthocyanins and the related gene expression [D]. Xi’an: ShaanxiNormal University, 2015. (in Chinese)

[21] ?ZKAN M. Degradation of anthocyanins in sour cherry and pomegranate juices by hydrogen peroxide in the presence of added ascorbic acid.Food Chemistry, 2002, 78(4): 499-504.

[22] OCHOA M R, KESSELER A G, DE MICHELIS A, MUGRIDGE A, CHAVES A R. Kinetics of colour change of raspberry, sweet (Prunus avium) and sour (Prunus cerasus) cherries preserves packed in glass containers: light and room temperature effects.Journal of Food Engineering, 2001, 49(1): 55-62.

[23] XIONG S Y, MELTON L D, EASTEAL A J, SIEW D. Stability and antioxidant activity of black currant anthocyanins in solution and encapsulated in glucan gel.Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54(17): 6201-6208.

[24] GARCíA-VIGUERA C, BRIDLE P. Influence of structure on colour stability of anthocyanins and flavylium salts with ascorbic acid.Food Chemistry, 1999, 64(1): 21-26.

[25] 王鋒, 鄧潔紅, 譚興和, 張禮紅, 鐘浩, 李清明. 花色苷及其共色作用研究進(jìn)展. 食品科學(xué), 2008, 29(2): 472-476.

WANG F, DENG J H, TAN X H, ZHANG L H, ZHONG H, LI Q M. Research Progress on Anthocyanins and Copigmentation.Food Science, 2008, 29(2): 472-476. (in Chinese)

[26] CHEN H G, HRAZDINA G. Structural aspects of anthocyaninflavonoid complex formation and its role in plant color.Phytochemistry, 1981, 20(2): 297-303.

[27] GOTO T, HOSHINO T, TAKASE S. A proposed structure of commelinin, a sky-blue anthocyanin complex obtained from the flower petals of commelina.Tetrahedron Letters, 1979, 20(31): 2905-2908.

[28] 凌文華, 郭紅輝. 植物花色苷. 北京:科學(xué)出版社, 2009: 57-67.

LI W H, GUO H H.Plant Anthocyanins. Beijing: Science Press, 2009: 57-67. (in Chinese)

[29] MAZZA G, BROUILLARD R. The mechanism of co-pigmentation of anthocyanins in aqueous solutions.Phytochemistry, 1990, 29(4): 1097-1102.

[30] KAMMERER D R, SCHILLM?LLER S, MAIER O, SCHIEBERA, CARLE R. Colour stability of canned strawberries using black carrot and elderberry juice concentrates as natural colourants.European Food Research and Technology, 2007, 224(6): 667-679.

[31] XU H G, LIU X, YAN Q L, YUAN F, GAO Y X. A novel copigment of quercetagetin for stabilization of grape skin anthocyanins.Food Chemistry, 2015, 166: 50-55.

[32] KUCHARSKA A Z, OSZMIANSKI J, KOPACZ M, LAMERZARAWSKA E. Application of flavonoids for anthocyanins stabilization//Conference of Flavonoids and Their Employment. Rzeszow, Poland, 1998.

[33] 宋會歌, 劉美艷, 董楠, 張予沛, 趙國華. 食品中花色苷降解機(jī)制研究進(jìn)展. 食品科學(xué), 2011, 32(13): 355-359.

SONG H G, LIU M Y, DONG N, ZHANG Y P, ZHAO G H. Research progress on degradation mechanisms of anthocyanins in foods.Food Science, 2011, 32(13): 355-359. (in Chinese)

[34] YAN Q L, ZHANG L H, ZHANG X F, LIU X, YUAN F, HOU H Q, GAO Y X. Stabilization of grape skin anthocyanins by copigmentation with enzymatically modified isoquercitrin (emiq) as a copigment.Food Research International, 2013, 50: 603-609.

[35] PALAMIDIS N, MARKAKIS P. Stability of grape anthocyanin in a carbonated beverage.Journal of Food Science, 1975, 40(5): 1047-1049.

[36] ?ZKAN M, YEMENICIO?LU A, CEMERO?LU B. Degradation of various fruit juice anthocyanins by hydrogen peroxide.Food Research International, 2005, 38(8): 1015-1021.

（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Effects of Phenolic Acids on Copigmentation and Stability of Anthocyanins in Red-Fleshed Apple

SU Fan, XUE Jia, YANG Xi, DENG Hong, MENG YongHong, GUO YuRong
(College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710119)

【Objective】‘Zihong NO.1’ red-fleshed apple is cultivated widely in Xinjiang Autonomous Region of China. Through investigating copigmentation of phenolic acids on anthocyanins in red-fleshed apple and their stability, this paper aims at providing a theoretical basis and reference for industrial utilization of red-fleshed apple anthocyanins. 【Method】 Ultrasonic-assistedmethod was used to extract anthocyanins, and pH differential method was adopted to determine the total content of red-fleshed apple anthocyanins. Besides, the constituents of red-fleshed apple anthocyanins and content of monomeric anthocyanins were also analyzed by HPLC. In phosphate buffer (pH 3.0) of red-fleshed apple anthocyanins, the copigmentation effect of these four acids was evaluated. The absorption spectra and absorbance at λmaxof all treatment groups as well as the contrast groups were measured before and after the treatments of heating, light exposure, oxidation and adding metal ions (Fe3+).【Result】The content of total anthocyanins in red-fleshed apple is 268.6 mg·kg-1and mainly consist of cyanidin-3-galactoside, cyanidin-3-arabinoside and cyanidin-3-glucoside, and cyanidin-3-galactoside accounts for the largest proportion of 75.34%. The wavelength of maximum absorption of red-fleshed apple anthocyanins in water system is at 515 nm, and the color and A515mnof red-fleshed apple anthocyanins change due to different pH values. At the concentration of 0.01 mol·L-1, caffeic acid, ferulic acid, chlorogenic acid and gallic acid all showed evident copigmentation, which led to the phenomena of hyperchromic effect and the bathochromic shift in varying degrees. Especially, ferulic acid caused the greatest extent of redshift (11nm) in anthocyanins solution. After anthocyanins was heated in water-bath at 60℃, 80℃, and 100℃ for one hour, respectively, chlorogenic acid and gallic acid showed the best protection effect, which is better than caffeic acid and ferulic acid. Under the natural lighting, the half-life of anthocyanins solution without copigments was less than 7 days, while the stabilities of anthocyanins with phenolic acids as copigments increased evidently (P＜0.05). The half-life of anthocyanins with chlorogenic acid, caffeic acid, gallic acid, and ferulic acid increased by 170.87%, 142.68%, 39.56% and 23.05%, respectively. When the concentration of H2O2in anthocyanins solution was at a range of 0.1%-0.6%, anthocyanins was oxidized rapidly, but phenolic acids can protect anthocyanins from oxidation apparently. After being oxidized by 0.1% H2O2for one hour, the content of anthocyanins in contrast group decreased to 38.39%, however, the retention rate of treatment groups with caffeic acid, ferulic acid, chlorogenic acid and gallic acid were 57.95%, 63.10%, 59.95% and 48.81%, respectively. The solution of Fe3+with concentration of 2.5×10-4－1×10-3mol·L-1had an adverse effect on anthocyanins color. In the solution containing Fe3+, the stability of anthocyanins with gallic acid as copigment was the highest. Additionally, the A515nmof treatment groups were higher than contrast group (P＜0.05). 【Conclusion】The color of red-fleshed apple anthocyanins depends on pH value of solutions obviously. The property of anthocyanins remained stable and the color kept bright red when pH＜3.0. Caffeic acid, ferulic acid, chlorogenic acid and gallic acid showed varying degrees of hyperchromic effect and the bathochromic shift on red-fleshed apple anthocyanins and evidently improved the stability of anthocyanins (P＜0.05) under various conditions of heating, light exposure, oxidation and adding metal ion of Fe3+.

red-fleshed apple; anthocyanins; phenolic acids; caffeic acid; ferulic acid; chlorogenic acid; gallic acid; copigmentation; stability

10.3864/j.issn.0578-1752.2017.04.013

2016-07-19；接受日期：2016-10-25

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-28）

聯(lián)系方式：蘇帆，E-mail：sufan.stella@hotmail.com。通信作者郭玉蓉，Tel：029-85310471；E-mail：guoyurong730@163.com