王白燕，韓倩倩，朱艷琴，李 光，石佳佳

河南中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院實驗教學中心 鄭州 450046

GRP78、CHOP在α-細辛醚誘導的Eca109細胞凋亡中的作用*

王白燕，韓倩倩，朱艷琴#，李 光，石佳佳

河南中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院實驗教學中心 鄭州 450046

#通信作者，女，1956年11月生，碩士，教授，研究方向：中藥抗腫瘤，E-mail：jc.zyqin@163.com

α-細辛醚；Eca109細胞；增殖抑制；凋亡；GRP78；CHOP

目的：研究葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)和C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應元件結合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白(CHOP)在α-細辛醚誘導的人食管癌Eca109細胞凋亡中的作用。方法：采用0.25、0.50及1.00 g/L的α-細辛醚作用于體外培養(yǎng)的Eca109細胞，并以無干預的細胞作為對照。分別于培養(yǎng)后12、24、36、48 h，采用MTT法檢測Eca109細胞的增殖抑制情況；采用免疫熒光染色法檢測細胞凋亡情況；運用Real-time PCR和Western blot檢測凋亡相關基因GRP78和CHOP的表達水平。結果：α-細辛醚對Eca109細胞的增殖具有抑制作用(P<0.05)，且具有時間、劑量效應關系。α-細辛醚作用48 h后，GRP78和CHOP mRNA和蛋白的相對表達量明顯增加(P<0.05)。結論：α-細辛醚可抑制Eca109細胞增殖和誘導細胞凋亡，其機制與調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白GRP78、CHOP表達有關。

食管癌(esophageal carcinoma，EC)是常見的上消化道惡性腫瘤，嚴重影響著人們的健康和生活質(zhì)量[1]。食管癌的發(fā)生、發(fā)展是一個復雜的多因素綜合作用的結果。α-細辛醚是中藥石菖蒲揮發(fā)油中的主要活性成分，祖國醫(yī)學認為石菖蒲有化痰開竅、鎮(zhèn)靜和抗驚厥之功效，可用于治療癲癇[2]。也有文獻[3]報道中藥石菖蒲揮發(fā)油中的另一主要成分β-細辛醚在誘導腸癌細胞凋亡中起到了一定的作用，其機制可能與線粒體途徑有關。而對于α-細辛醚抗腫瘤的研究尚未見報道。作者所在的課題組[4]在前期的研究中初步發(fā)現(xiàn)，α-細辛醚可誘導人食管癌Eca109細胞發(fā)生凋亡，該研究進一步對其凋亡機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 α-細辛醚注射液(批號201308，規(guī)格2 mg)；Eca109細胞購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；新生小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)雙染試劑盒購自北京Solarbio公司；鼠多抗GRP78購自Abcam公司；鼠多抗CHOP購自Cell Signaling公司；鼠抗人β-actin單克隆抗體購自Santa Cruz公司；TECAN酶聯(lián)免疫檢測儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品；全波長掃描式多功能讀數(shù)儀為Thermo Fisher公司產(chǎn)品；生物分子成像儀為日本富士產(chǎn)品。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組 取對數(shù)生長期的Eca109細胞，制成2×104mL-1的細胞懸液，接種于96孔板，分別用0.25、0.50、1.00 g/L α-細辛醚處理，不干預的作對照。每組設6個復孔，培養(yǎng)24 h后，進行藥物干預。

1.3 MTT 檢測細胞增殖抑制情況 細胞繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36、48 h后每孔直接加入MTT溶液20 μL，4 h后吸棄液體，加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，在酶標儀490 nm處測量各孔的吸光度(A)值，重復3次。細胞增殖抑制率=(1-實驗組A值 / 對照組A值)×100%。

1.4 免疫熒光染色法檢測細胞凋亡情況 用胰蛋白酶消化培養(yǎng)48 h、貼壁生長的細胞。收集細胞，PBS洗滌2遍，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，加入50 μL PBS重懸；按AO/EB雙染試劑盒說明書染色，吸取混合液10 μL，滴于載玻片上，蓋玻片封片，在510 nm波長處激發(fā)熒光，倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.5 Real-time PCR法檢測GRP78和CHOP mRNA的表達 培養(yǎng)48 h后，取對數(shù)生長期的細胞，按說明書提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應體系：2 × Ultra SYBR Mixture 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，無菌水7 μL,總體積20 μL。反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環(huán)。引物序列見表1。每個樣本設3個復孔和2個陰性對照，mRNA含量根據(jù)各個樣本的β-actin含量進行標準化，結果用相對定量2-ΔΔCT法分析。

1.6 Western blot法檢測GRP78和CHOP蛋白的表達 培養(yǎng)48 h后，收集各組細胞用PBS洗滌2遍，棄上清，常規(guī)冰浴裂解50 min，14 000 r/min離心5 min，取上清即為細胞總蛋白樣品，BCA法測定蛋白濃度。每孔上樣量為30 μg蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳的分離膠濃度為120 g/L，蛋白分離后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件：恒流300 mA，1.5 h。轉(zhuǎn)膜結束后用TBST洗膜，5 min×3次。室溫下振搖封閉2 h，然后分別加鼠抗人GRP78、CHOP抗體(稀釋1 000倍)，4 ℃孵育過夜，再與HRP 標記的羊抗鼠IgG二抗(稀釋1 000倍)結合，TBST漂洗?；瘜W發(fā)光法顯色照相。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 17.0進行分析，各組細胞增殖抑制情況的比較采用析因設計的方差分析，GRP78和CHOP mRNA以及蛋白表達情況的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 各組Eca109細胞增殖抑制情況 見表2。

表2 各組Eca109細胞增殖抑制情況(n=6)

F組間=66.891，F(xiàn)時間=297.823，F(xiàn)交互=16.624，P均﹤0.001。

2.2 各組細胞凋亡情況 α-細辛醚作用于Eca109 細胞48 h后，即發(fā)生明顯的細胞形態(tài)變化。AO/EB雙染后倒置顯微鏡下可見對照組細胞處于存活狀態(tài)(綠色熒光)，未見凋亡細胞；α-細辛醚處理組細胞的部分細胞核呈現(xiàn)出早期(橘紅色熒光)或晚期(紅色熒光)凋亡狀態(tài)(圖1)。

A：對照組；B：0.25 g/L α-細辛醚處理組；C：0.50 g/L α-細辛醚處理組；D：1.00 g/L α-細辛醚處理組。圖1 各組Eca109 細胞AO/EB雙染觀察結果(×400)

2.3 各組GRP78和CHOP mRNA的表達情況 見表3。

表3 各組GRP78和CHOP mRNA的表達情況 (n=3)

*：與對照組相比，P<0.05；#：與0.25 g/L α-細辛醚處理組相比，P<0.05；△：與0.50 g/L α-細辛醚處理組相比，P<0.05。

2.4 各組GRP78和CHOP 蛋白的表達情況 見圖2和表4。

1：對照組；2：0.25 g/L α-細辛醚處理組；3：0.50 g/L α-細辛醚處理組；4：1.00 g/L α-細辛醚處理組。圖2 各組GRP78和CHOP蛋白的表達

表4 各組GRP78和CHOP蛋白的表達情況(n=3)

*：與對照組相比，P<0.05；#：與0.25 g/L α-細辛醚處理組相比，P<0.05；△：與0.50 g/L α-細辛醚處理組相比，P<0.05。

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞質(zhì)內(nèi)參與蛋白質(zhì)合成、修飾與加工的重要細胞器，是調(diào)節(jié)細胞應激反應及細胞內(nèi)鈣濃度的場所。當細胞受到低氧等有害刺激時，可使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正確折疊蛋白的能力被削弱，導致未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)積聚，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，繼而導致促凋亡編碼基因的激活[5-6]。ERS可通過線粒體Apaf.1依賴途徑、Caspase-12活化途徑、Bcl-2家族、Ca2+、CHOP等多條信號通路誘導細胞凋亡[7]。其中 CHOP 是介導ERS誘導細胞凋亡的特異性轉(zhuǎn)錄因子，可抑制Bcl-2的啟動，其在正常的細胞中低表達，而在ERS時激活并伴 mRNA 及蛋白水平表達升高，通過活化胱天蛋白酶 9 前體、啟動胱天蛋白酶級聯(lián)反應，最終誘導細胞凋亡[8-9]。

GRP78也稱為免疫球蛋白重鏈結合蛋白 BIP，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的一種分子伴侶，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊和轉(zhuǎn)運，是促進蛋白質(zhì)正常合成和成熟、維持細胞正常生理功能的一種重要分子[10]。GRP78也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一種應激蛋白，在細胞受刺激時高表達從而維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)定，對細胞有保護作用[11]。有研究[12]表明，GRP78 在多種腫瘤細胞中的表達水平比在正常細胞中高，推測GRP78在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中起到一定的調(diào)控作用。

該研究結果發(fā)現(xiàn)不同濃度α-細辛醚處理可抑制Eca109細胞增殖，促進Eca109細胞凋亡，Real-time PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)α-細辛醚處理組細胞GRP78與CHOP mRNA和蛋白高表達，提示藥物處理后細胞發(fā)生了ERS，繼而通過ERS下游靶基因CHOP信號通路使CHOP mRNA 高表達，從而誘導Eca109細胞凋亡。但CHOP誘導凋亡的下游信號機制還需要進一步研究。

[1]郝鵬程,李自亨,魏煜程,等.GRP78在食管鱗狀細胞癌、不典型增生及正常食管鱗狀上皮組織中的表達[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2011,11(19):3669

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[3]吳堅,張星星,陳敏,等.β-細辛醚對腸癌細胞 HT-29生物行為學的影響及機制[J].時珍國醫(yī)國藥,2014,25(5):1103

[4]王甜甜,吳芳,朱艷琴,等.α-細辛醚誘導人食管癌細胞系Eca-109凋亡的實驗研究[J].中醫(yī)學報,2014,29(4):473

[5]曹珊,周慧茹,朱艷琴.苦參素對食管癌 Eca-109細胞 BIP 和 CHOP mRNA 表達的影響[J].鄭州大學學報(醫(yī)學版),2014,49(1):1

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[11]沈曉君,何航.葛根素對HCY誘導的血管內(nèi)皮細胞凋亡及GRP78表達的影響[J].中藥藥理與臨床,2009,25(4):12

[12]付政祺,鎮(zhèn)鴻燕,劉麗江.GRP78在胃癌生長中的作用[J].中國病理生理雜志,2014,30(4):625

(2016-08-26收稿 責任編輯李沛寰)

Effects of GRP78 and CHOP on apoptosis of human esophageal carcinoma Eca109 cells induced by α-asarone

WANGBaiyan,HANQianqian,ZHUYanqin,LIGuang,SHIJiajia

ExperimentTeachingCenter,BasicMedicalSchool,HenanUniversityofChineseMedicine,Zhengzhou450046

α-asarone；Eca109 cell line；proliferation inhibition；apoptosis；GRP78；CHOP

Aim: To investigate the effect of GRP78 and CHOP on apoptosis of human esophageal carcinoma Eca109 cell line induced by α-asarone. Methods: Eca109 cells were cultured for 24 h, and were treated with various concentrations(0.25, 0.50 and 1.00 g/L) of α-asarone for 12, 24, 36 and 48 h, respectively. MTT assay was used to detect the proliferation of Eca109 cells. The apoptosis morphological changes of Eca109 cells were observed with an inverted microscope. The expression level of GRP78 and CHOP were measured by Real-time PCR and Western blot, respectively.Results: α-asarone had obvious time- and dose-dependent inhibition effects on the proliferation of Eca109 cells(P<0.05). After Eca109 cells were treated with various concentrations of α-asarone for 48 h，the expressions of both GRP78 and CHOP were increased significantly(P<0.05). Conclusion: α-asarone could inhibit the proliferation of Eca109 cells and induce cell apoptosis by regulating the expressions of GRP78 and CHOP.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.02.001

*鄭州市科技攻關項目 131PPTGG417-1；鄭州市科技創(chuàng)新團隊項目 121PCXTD520

R735.1