王 琰,萬 一,李 皎,楊國武,鄧 媛,王 軍

(陜西省微生物研究所，陜西西安710043)

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Bacillusclarkii7364γ-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的可溶性表達及其催化特性分析

王 琰,萬 一,李 皎,楊國武,鄧 媛,王 軍

(陜西省微生物研究所，陜西西安710043)

按照大腸桿菌偏愛密碼子對Bacillusclarkii7364來源的γ-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(γ-CGTase)進行優(yōu)化，構(gòu)建γ-CGTase原核表達菌株，摸索γ-CGTase的可溶性表達條件及純化條件，并對其催化特性進行研究。結(jié)果表明：在28 ℃條件下實現(xiàn)了γ-CGTase的高效可溶性表達，可溶性蛋白占總蛋白表達量的63%，酶活可達3 830 U/mL。經(jīng)(NH4)2SO4沉淀和α-CD-Sepharose 6B親和柱純化后，酶蛋白純化了12.97倍，酶收率20.31%。使用該酶對木薯淀粉進行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中γ-環(huán)糊精(γ-CD)的比例可達90.9%，幾乎無α-環(huán)糊精(α-CD)，與天然酶的79%相比提高了15%。將該基因工程菌在20 L發(fā)酵罐中發(fā)酵，10 h后酶活達到4 375 U/mL，證實了其工業(yè)化放大的可能。該酶具有非常高的轉(zhuǎn)化專一性，有非常好的工業(yè)化前景。

γ-CGTase；Bacillusclarkii；可溶性表達；純化；產(chǎn)物專一性

環(huán)糊精(cyclodextrin，CD)，是由若干個D-吡喃葡萄糖單元通過α-1,4糖苷鍵連接而成的環(huán)狀低聚糖的總稱。根據(jù)葡萄糖殘基數(shù)目的不同，可將環(huán)糊精分為α、β和γ-CD，甚至更大的環(huán)狀分子。由于其內(nèi)疏水外親水的中空筒狀結(jié)構(gòu)，使得環(huán)糊精能與各種客體分子形成包結(jié)復(fù)合物，從而改變客體分子的性質(zhì)。因此，環(huán)糊精被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品、環(huán)保等眾多領(lǐng)域，是一種具有重要價值的生物化工產(chǎn)品[2-3]。在環(huán)糊精的3種常用形式中，γ-CD具有的空腔和環(huán)結(jié)構(gòu)均為最大，能夠包合更大的客體分子，最好的水溶性使得其對活性大分子的增溶效果更為明顯，因此，γ-CD的應(yīng)用更加廣泛[4-5]。

然而，目前γ-CD還未能實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，主要原因是目前用于生產(chǎn)的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(cyclodextrin glycosyltransferase，CGTase)的作用產(chǎn)物為α、β和γ-CD的混合物，加之γ-CD缺乏良好的后提取手段，因此，獲取高專一性的γ-CGTase對于實現(xiàn)γ-CD的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。然而目前國內(nèi)外對于高專一性γ-CGTase的研究報道較少。其中，Bacillussp.G-825-6的γ-CGTase在pH10.0條件下與10%可溶性淀粉反應(yīng)，主要產(chǎn)生γ-CD和β-CD，轉(zhuǎn)化率為10.7%；利用Bacillusclarkii7364野生菌株的γ-CGTase對137 g/L預(yù)膠狀的馬鈴薯淀粉進行轉(zhuǎn)化，產(chǎn)物中γ-CD占到79%；Brevibacteriumsp.no-9605菌株的γ-CGTase只產(chǎn)生β-CD和γ-CD，并且γ-CD在反應(yīng)的起始階段占據(jù)主要地位，當(dāng)以44 g/L可溶性淀粉為底物，添加體積分?jǐn)?shù)30%乙醇時，γ-CD產(chǎn)率最高為22%；Bacillussubtilis313的γ-CGTase只產(chǎn)生γ-CD，但是產(chǎn)率只有5%。國內(nèi)研究則主要集中于高產(chǎn)γ-CGTase菌株的篩選，以及產(chǎn)酶發(fā)酵條件的優(yōu)化。李皎等[10]篩選到一株芽孢桿菌32-3-10，其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中3種環(huán)糊精γ-CD、β-CD與α-CD的質(zhì)量比為53∶ 5∶ 50。紀(jì)麗萍等[11]對重組大腸桿菌產(chǎn)γ-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、王峰[12]對BacillusmacorousWSH02-06的產(chǎn)酶發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，都得到較優(yōu)的產(chǎn)酶條件。

野生菌株大多存在產(chǎn)酶量低，發(fā)酵周期長的問題，通過大腸桿菌高效表達γ-CGTase仍是目前最有效的方式[13-14]。然而，大腸桿菌表達外源蛋白也存在其局限性，即常生成不具有生物活性的包涵體。因此，實現(xiàn)γ-CGTase的可溶性表達或胞外表達成為目前的研究熱點。如，Jemlis等[15]在大腸桿菌中表達來源于多黏芽孢桿菌的γ-CGTase，通過37 ℃培養(yǎng)22 h后,誘導(dǎo)溫度降為19 ℃，并將培養(yǎng)基從LB換為2TY，實現(xiàn)了該酶的可溶性表達，酶活達到22 U/mL。Kim等[16]通過共表達人肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶 (PPIase)，以及采用大腸桿菌高密度發(fā)酵技術(shù)和發(fā)酵上罐pH反饋補料技術(shù)實現(xiàn)了B.macerans來源的γ-CGTase在大腸桿菌中的可溶性表達，酶活達到1 200 U/mL。但這些可溶性表達的γ-CGTase并未進一步進行淀粉轉(zhuǎn)化活性以及轉(zhuǎn)化專一性的研究。

本文中，筆者將來源于B.clarkii7364的γ-CGTase基因按照大腸桿菌密碼子進行優(yōu)化后，將其構(gòu)建到pET22b(+)載體中并轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)。通過表達條件研究，實現(xiàn)該酶在大腸桿菌中的可溶性表達，并在20 L發(fā)酵罐中進行發(fā)酵驗證。同時利用該酶進行淀粉轉(zhuǎn)化研究，以期提高該γ-CGTase的轉(zhuǎn)化專一性，從而為γ-CD的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)、pET22b(+)均保存于筆者所在實驗室，pMD18-T-γ-CGTase載體委托上海桑尼生物技術(shù)有限公司合成并構(gòu)建。

1.1.2 主要試劑

Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHI和NcoI等，大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)；α-CD、β-CD和γ-CD標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司；質(zhì)粒DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒，Tiangen公司；IPTG、X-gal、乳糖、氨芐青霉素，昕泰生物公司；溶菌酶、透析袋，西安沃爾森生物科技有限公司；α-CD-Sepharose 6B填料，西安扛鼎生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

γ-CGTase優(yōu)化后序列由上海桑尼生物有限公司合成。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 10。用5 mol/L NaOH調(diào)pH到7.0。

種子培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 16，酵母粉 10，NaCl 5，甘油 20。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 2.5，酵母粉 2.5，NaCl 0.5，甘油 10，NH4Cl 0.5，K2HPO40.3，Na2HPO417.1，MgS04·7H2O 0.5。

1.2 方法

1.2.1E.coliBL21/pET22b(+)-γCGTase基因工程菌的構(gòu)建

以GenBank公開發(fā)表的γ-CGTase基因序列(AB082929)為基礎(chǔ)，根據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子從頭設(shè)計并合成了新的γ-CGTase基因序列，并在序列的5’端和3’端各設(shè)計添加了1個BamHI和NcoI酶切位點。通過BamHI和NcoI雙酶切pET22b(+)及pMD18-T-γ-CGTase，回收相應(yīng)片段后進行連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含100 μg/mL氨芐青霉素(Amp)的LB平板上篩選陽性克隆。通過菌落PCR和重組質(zhì)粒雙酶切進行驗證。菌落PCR條件為94 ℃預(yù)變性10 min；再進行30個循環(huán)(94 ℃ 40 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 2 min)；72 ℃延伸10 min。驗證成功后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)并進行誘導(dǎo)表達。

1.2.2γ-CGTase水解活性的測定

采用碘液法測定γ-CGTase水解活性[17]。取10 μL酶液(對照不加酶液)，加入0.2 mL 2.5 g/L的馬鈴薯淀粉溶液和0.2 mL 0.05 mol/L Tris-HCl (pH 8.0)緩沖液。40 ℃恒溫水浴中保溫10 min后立即加入0.5 mL醋酸溶液終止反應(yīng)，并加入3 mL 0.05 g/L碘液顯色，用分光光度計在700 nm處比色，記光密度值OD2。對照管光密度值讀數(shù)記OD1。以O(shè)D1吸光值下降1/10 為1個酶活單位。每個樣品做3個平行。酶活力按式(1)計算。

酶活力=(OD1-OD2)×100×

稀釋倍數(shù)/(0.1×OD2)

(1)

1.2.3E.coliBL21/pET22b(+)-γCGTase的可溶性表達

從平板上挑取E.coliBL21/pET22b(+)-γCGTase的單菌落接種于10 mL含100 μg/mL Amp的LB培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)過夜，次日以1%比例轉(zhuǎn)接到含Amp的LB培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6，用終濃度為1 mmol/L的IPTG分別在28、30和37 ℃進行誘導(dǎo)表達，誘導(dǎo)結(jié)束后離心收集菌體。按照10 mL/g菌體加入TE溶液 (10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH8.5) 進行重懸，再加10 μL/g的溶菌酶(50 mg/mL)進行裂菌，4 ℃裂解20 min后，加入10 mg/g脫氧膽酸鈉、10 μL/g 1 mol/L MgCl2和1 μL/g DNase (25 mg/mL)，攪拌至溶液無一點拉絲后，12 000 r/min離心15 min，分離上清和沉淀。15% SDS-PAGE檢測γ-CGTase表達情況以及γ-CGTase在裂菌上清和沉淀中的分布情況。通過Biolog凝膠成像系統(tǒng)獲得凝膠圖譜，用軟件ImageJ對凝膠圖譜上的蛋白條帶進行光密度掃描半定量分析，計算總蛋白量和可溶性蛋白的比例。

1.2.4 20 L發(fā)酵罐中γ-CGTase發(fā)酵條件

將種子液按6 %的接種量接入20 L全自動發(fā)酵罐(New Brunswick Scientific Bio Flo 415)中，裝液量10 L，攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min，通氣量1.8 L/min，37 ℃培養(yǎng)至OD600=5.0后加入終濃度為0.5 mmol/L的乳糖作為誘導(dǎo)劑并降溫至28 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)7 h。

1.2.5 重組蛋白γ-CGTase的純化

首先將含有目的蛋白的裂菌上清用50%飽和度的(NH4)2SO4沉淀過夜，12 000 r/min離心收集沉淀，并用0.01 mol/L乙酸緩沖液(pH5.5)溶解。在1 L 0.01 mol/L乙酸緩沖液(pH5.5)中透析3次后，12 000 r/min離心10 min，收集上清并用0.45 μm膜過濾，采用AKTA蛋白純化儀純化γ-CGTase。過α-CD-Sepharose 6B親和柱，用含10 g/Lα-CD的0.01 mol/L乙酸緩沖液洗脫目的蛋白，收集洗脫峰。15%SDS-PAGE檢測，對含有目的蛋白的洗脫峰在蒸餾水中透析后制備成凍干粉[18]。

1.2.6γ-CGTase轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的HPLC分析

用pH 8.0的Tris-HCl配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的木薯淀粉，以700 U/g淀粉的量加入γ-CGTase粗酶液和5%(體積分?jǐn)?shù)) 環(huán)己烷，58 ℃轉(zhuǎn)化15 h。反應(yīng)結(jié)束后5 000 r/min離心10 min，取上清液過0.45 μm膜，HPLC檢測轉(zhuǎn)化產(chǎn)物[19]。其中色譜柱為Thermo Phenyl-2 HYPERSIL (4.6 mm×150 mm)，流動相為100%水溶液，流速1.0 mL/min，檢測器為諾爾示差折光K-2301，柱溫40 ℃，進樣量10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 大腸桿菌E.coliBL21/pET22b(+)-γCGTase的構(gòu)建

將經(jīng)BamHI和NcoI雙酶切的pMD18-T-γ-CGTase及載體pET-22b(+)進行連接，構(gòu)建了pET22b(+)-γCGTase重組質(zhì)粒表達載體，并對其進行了菌落PCR和重組質(zhì)粒雙酶切驗證(圖1)。將驗證正確的pET22b(+)-γCGTase重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建成E.coliBL21/pET22b(+)-γCGTase表達菌株。

M為標(biāo)準(zhǔn)DNA;1～6為pET22b(+)-γCGTase/DH5α的菌落PCR產(chǎn)物;7為PCR的陰性對照;8為重組質(zhì)粒pET22b(+)-γCGTase的雙酶切產(chǎn)物圖1 pET22b(+)-γCGTase/DH5α的菌落PCR鑒定和重組質(zhì)粒pET22b(+)-γCGTase的BamHI和NcoI雙酶切鑒定Fig.1Identification of pET22b(+)-γCGTase/DH5α by colony PCR and identification of recombinant plasmid pET22b(+)-γCGTase with BamHI and NcoI double digestion

2.2γ-CGTase的可溶性表達

E.coliBL21/pET22b(+)-γCGTase表達菌株在37 ℃下經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，經(jīng)15% SDE-PAGE檢測，與未誘導(dǎo)相比，經(jīng)誘導(dǎo)的E.coliBL21/pET22b(+)-γCGTase在7.0×104附近有新條帶產(chǎn)生，大小與預(yù)期理論值7.509×104基本相符(圖2)。但是，目的蛋白主要以包涵體的形式存在。為了實現(xiàn)γ-CGTase的可溶性表達，分別在30 和28 ℃下對E.coliBL21 / pET22b (+)-γCGTase進行誘導(dǎo)表達，溶菌酶裂解菌體后，經(jīng)15% SDS-PAGE檢測，僅在28 ℃時實現(xiàn)了γ-CGTase的高效可溶性表達，并且可溶性蛋白表達量占總蛋白的63%(圖3)。

M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1為在37 ℃下IPTG誘導(dǎo)4 h的樣品;2為在37 ℃下誘導(dǎo)樣品的裂菌上清;3為在37 ℃下誘導(dǎo)樣品的裂菌沉淀圖2 E.coli BL21/pET22b(+)-γCGTase在37 ℃時誘導(dǎo)表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.2SDS-PAGE analysis of expression products in E.coli BL21/pET22b(+)-γCGTase at 37 ℃

M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白; 1、5為未誘導(dǎo)的對照樣品; 2為在30 ℃下IPTG誘導(dǎo)4 h的樣品; 3為在30 ℃下誘導(dǎo)樣品的裂菌上清;4為在30 ℃下誘導(dǎo)樣品的裂菌沉淀;6為在28 ℃下IPTG誘導(dǎo)4 h的樣品;7為在28 ℃下誘導(dǎo)樣品的裂菌上清;8為在28 ℃下誘導(dǎo)樣品的裂菌沉淀圖3 E.coli BL21/pET22b(+)-γCGTase在28 ℃誘導(dǎo)溫度下γ-CGTase的表達形式分析Fig.3Expression form of γ-CGTase in E.coli BL21/pET22b(+)-γCGTase at 28 ℃

1為(NH4)2SO4沉淀再透析后的樣品; M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白;2為親和柱純化過程中的穿過峰; 3為純化后的γ-CGTase圖4 純化的γ-CGTase的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE profile of purified γ-CGTase

2.3γ-CGTase的純化及活性測定

E.coliBL21/pET22b(+)-γCGTase在28 ℃誘導(dǎo)的裂菌上清液經(jīng)50%飽和度的(NH4)2SO4沉淀后復(fù)溶于0.01 mol/L乙酸緩沖液，過α-CD-Sepharose 6B親和柱，用含10 g/Lα-CD的0.01 mol/L 乙酸緩沖液可以有效洗脫目的蛋白。純化的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析，獲得表觀電泳純酶蛋白(圖4)。對純化的γ-CGTase溶液進行透析，凍干，制成干粉。采用1.2.2節(jié)的方法對獲取的γ-CGTase凍干粉進行活性測定，其比酶活為64 400 U/mg。各步純化樣品的酶活力和蛋白質(zhì)質(zhì)量結(jié)果見表1。

表1 γ-CGTase的純化總結(jié)表

2.4 20 L發(fā)酵罐發(fā)酵γ-CGTase驗證及γ-CGTase作用產(chǎn)物分析

將種子液按6%的接種量接入20 L全自動發(fā)酵罐中，37 ℃培養(yǎng)至OD600=5.0后加入終濃度為0.5 mmol/L的乳糖并降溫至28 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)7 h。發(fā)酵結(jié)束后共收集濕菌體456 g，測定發(fā)酵液菌上清酶活達到4 375 U/mL。與目前文獻報道相比，Bacillusmacerans的CGTase[16]在大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中進行可溶性表達，酶活為1 200 U/mL，通過降低誘導(dǎo)溫度至30 ℃，添加0.5 mol/L甘露醇，可溶性蛋白量增加34倍(8.51 U/mL)，活性CGTase為總蛋白的24%[20]；Bacillusclarkii7364來源的γ-CGTase在大腸桿菌中培養(yǎng)16 h后得到可溶性表達。本研究僅通過降低誘導(dǎo)溫度到28 ℃即實現(xiàn)了γ-CGTase的可溶性表達，并且γ-CGTase的酶活可達4 375 U/mL。

按照700 U/g淀粉的量加入γ-CGTase粗酶液，反應(yīng)體系中木薯淀粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，轉(zhuǎn)化15 h后，用HPLC檢測轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。圖5為α-CD、β-CD和γ-CD標(biāo)準(zhǔn)樣品(10 mg/mL)和重組γ-CGTase轉(zhuǎn)化生成α-CD、β-CD和γ-CD的HPLC色譜圖。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度和峰面積計算轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中各CD的生成量，m(α-CD)∶m(β-CD)∶m(γ-CD)為1.33∶ 7.77∶ 90.9。原始菌Bacillusclarkii7364來源的γ-CGTase與10%可溶性淀粉在pH10.0和50 ℃條件下反應(yīng)48 h后，γ-CD的轉(zhuǎn)化率為10%，而該酶通過58 ℃反應(yīng)15 h即實現(xiàn)γ-CD 10.7%的轉(zhuǎn)化率，大大縮短了反應(yīng)時間。同時，γ-CD的轉(zhuǎn)化比例由原始菌的79%提高到90.9%，與目前文獻報道相比，具有非常高的轉(zhuǎn)化專一性，并且?guī)缀鯚oα-CD生成，具有非常好的工業(yè)化前景。但是該酶目前的轉(zhuǎn)化率為10.7%，與達到工業(yè)化應(yīng)用的30%[21]還有一定距離。因此，后續(xù)實驗應(yīng)充分利用該酶高專一性的優(yōu)勢，通過轉(zhuǎn)化工藝的摸索，提高其轉(zhuǎn)化率，從而為其工業(yè)化應(yīng)用奠定堅實基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

通過對Bacillusclarkii7364來源的γ-CGTase按照大腸桿菌密碼子進行優(yōu)化后，成功構(gòu)建了工程菌株pET22b(+)-γ-CGTase/E.coliBL21(DE3)。通過降低誘導(dǎo)溫度到28 ℃實現(xiàn)了該酶在大腸桿菌中的可溶性表達，并且經(jīng)20 L發(fā)酵罐放大發(fā)酵后，酶活可達4 375 U/mL。經(jīng)過(NH4)2SO4沉淀和α-CD-Sepharose 6B親和純化后，酶蛋白純化了12.97倍，酶收率20.31%。在pH 8.0、58 ℃條件下轉(zhuǎn)化15 h后，γ-CD的轉(zhuǎn)化比例可達90.9%，并且?guī)缀鯚oα-CD，證實該酶具有非常高的轉(zhuǎn)化專一性，具有較好的工業(yè)化前景。

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(責(zé)任編輯 荀志金)

Expression and characterization of a recombinantγ-cyclodextringlycosyltransferase fromBacillusclarkii7364

WANG Yan,WAN Yi,LI Jiao,YANG Guowu,DENG Yuan,WANG Jun

(Microbiology Institute of Shaanxi,Xi′an 710043,China)

Theγ-CGTase gene sequence fromBacillusclarkii7364 was optimized according to the biased condons ofE.coliand its prokaryotic expression strain was constructed.The condition of expression ofγ-CGTase and the purification method ofγ-CGTase was established,and the catalytic characterization ofγ-CGTase was studied.Theγ-CGTase achieved highly soluble expression at 28 ℃ and the soluble expression protein accounts for 63% of the total protein,the enzyme activity reached 3 830 U/mL in the periplasm.The recombinantγ-CGTase was purified by ammonia sulfate precipitation,followed by affinity chromatography on aα-CD-Sepharose 6B affinity column,and the purification fold and yield was 12.97 and 20.31%,separately.After incubation with cassava starch,the majority (90.9%) of product CDs wasγ-CD that was about 15% higher than the wildγ-CGTase,and nearly noα-CD was detected.The engineering strain was cultivated in 20 L fermentor andγ-CGTase activity could reach 4 375 U/mL,which provided the possibility for further industrialization.The recombinantγ-CGTase showed very high specificity of transformation and would have better perspective in industrialization.

γ-cyclodextrin glycosyltransferase；Bacillusclarkii；soluble expression；purification；specificity of products

10.3969/j.issn.1672-3678.2017.02.002

2016-11-28

陜西省科學(xué)院應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目(2013K-09)；陜西省科學(xué)院科學(xué)技術(shù)平臺項目(2015k-33)

王 琰(1982—)，女，河南滎陽人，助理研究員，研究方向：基因工程類產(chǎn)品開發(fā)；萬 一(聯(lián)系人)，研究員，E-mail：wanyi6565@sina.com

Q812；Q815

A

1672-3678(2017)02-0007-06