李金凰，陳毅挺,2，鄭晶晶，潘 彥

(1.閩江學(xué)院 化學(xué)與化學(xué)工程系，福建 福州 350108；2.綠色染整福建省高校工程研究中心，福建 福州 350108)

日落黃與牛血清白蛋白相互作用的電化學(xué)研究

李金凰1，陳毅挺1,2，鄭晶晶1，潘 彥1

(1.閩江學(xué)院 化學(xué)與化學(xué)工程系，福建 福州 350108；2.綠色染整福建省高校工程研究中心，福建 福州 350108)

利用微分脈沖伏安法，研究了日落黃與牛血清白蛋白之間的相互作用. 試驗(yàn)結(jié)果表明，日落黃與牛血清白蛋白之間形成近似1∶1的復(fù)合物，從而造成日落黃峰電流的降低，兩者之間的結(jié)合主要依靠靜電力，且結(jié)合常數(shù)隨溫度升高而降低. 研究有利于從分子水平上了解日落黃和牛血清白蛋白之間的結(jié)合作用，為更進(jìn)一步了解日落黃的生物代謝機(jī)理提供一定的理論參考.

日落黃；牛血清白蛋白；電化學(xué)

日落黃(Sunset Yellow，SY)是一種人工合成的偶氮類(lèi)色素(結(jié)構(gòu)式如圖1所示)，屬我國(guó)允許使用的食品添加劑之一[1]，但其具有慢性毒性和致癌性[2]. 探索SY與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合行為，對(duì)于了解其在生物體內(nèi)的作用機(jī)制具有一定的意義.

圖1 日落黃的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of SY

常用于探究分子與牛血清白蛋白(BSA)結(jié)合作用的方法有分光光度法[3-4]、熒光光譜法[5-6]、毛細(xì)管電泳法[7]、色譜法[8]、電化學(xué)分析法[9]和圓二色光譜法[10]等. 近年來(lái)，電化學(xué)分析法以其操作簡(jiǎn)便、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)而被用于蛋白與某些小分子之間相互作用行為的研究. 莫述誠(chéng)等[11]和石震等[12]分別利用電化學(xué)分析法研究了日落黃在銀基汞膜電極和乙炔黑-殼聚糖修飾電極上的伏安行為，但他們均未對(duì)日落黃與BSA的結(jié)合行為進(jìn)行探討. 本文使用微分脈沖伏安法探究了不同溫度和酸度下SY與BSA的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，并對(duì)作用力的類(lèi)型進(jìn)行了判斷.

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

CHI 760D(上海辰華儀器有限公司)；三電極體系：玻碳電極(Φ 3 mm，上海辰華儀器有限公司)為工作電極；飽和甘汞電極(232型，上海恒譽(yù)水分析儀器廠)為參比電極；鉑絲電極(1 mm×37 mm，上海辰華儀器有限公司)為輔助電極.

日落黃(分析標(biāo)準(zhǔn)品)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；牛血清白蛋白(相對(duì)分子質(zhì)量65 000，生化試劑)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸購(gòu)自上海成?；瘜W(xué)工業(yè)有限公司；氧化鋁購(gòu)自天津艾達(dá)恒晟科技發(fā)展有限公司. 所有試劑未注明的均為分析純，試驗(yàn)用水均為去離子水.

1.2 試驗(yàn)方法

玻碳電極在測(cè)定之前，先用氧化鋁懸濁液在麂皮上拋光至鏡面，用去離子水沖洗干凈，用氮?dú)獯蹈珊笾糜诖郎y(cè)溶液中進(jìn)行電化學(xué)測(cè)量. 在最優(yōu)參數(shù)下(脈沖周期：0.2 s、采樣寬度：0.04 s、脈沖幅度：0.05 V、電位增量：0.005 V、電位范圍0.1～-0.9 V)對(duì)含有SY和BSA的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液進(jìn)行微分脈沖伏安法掃描. 根據(jù)加入BSA前后SY峰電流差值的變化，測(cè)得SY與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù).

2 結(jié)果與討論

2.1 微分脈沖伏安法測(cè)定日落黃的參數(shù)優(yōu)化

保持日落黃溶液濃度不變，逐一改變脈沖周期、采樣寬度、起始電位、終止電位、電勢(shì)增量和振幅，考察不同參數(shù)對(duì)日落黃峰電流的影響. 試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示.

圖2 電化學(xué)參數(shù)對(duì)峰電流的影響Fig.2 Effect of electrochemical parameters on peak current

由圖2可見(jiàn)，當(dāng)脈沖周期、采樣寬度、脈沖幅度、電位增量、起始電位和終止電位分別為0.2 s、0.04 s、0.05 V、0.005 V、0.1 V、-0.9 V時(shí)，日落黃的峰電流最大.

2.2 SY-BSA體系的微分脈沖伏安分析

在上述最優(yōu)參數(shù)下，對(duì)SY及SY-BSA體系進(jìn)行微分脈沖伏安掃描，其曲線(xiàn)如圖3所示.

圖3 SY、SY-BSA體系的微分脈沖掃描伏安圖Fig.3 Differential pulse sweep voltammetric curves of SY and SY-BSA(a)1.0×10-4 mol/L SY；(b) a+1.2×10-7 mol/L BSA

在pH 7.2的Tris-HCl緩沖溶液中，SY在玻碳電極上產(chǎn)生了一個(gè)靈敏的氧化峰，加入BSA后SY的峰電流降低，峰電位略微發(fā)生移動(dòng)，表明二者之間發(fā)生結(jié)合作用，生成了一種非電活性復(fù)合物[13]. BSA 的空間結(jié)構(gòu)由3 個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，每個(gè)結(jié)構(gòu)域有2 個(gè)亞結(jié)構(gòu)域以槽口相對(duì)的方式形成圓筒狀結(jié)構(gòu)，幾乎所有疏水性氨基酸殘基都包埋在圓筒內(nèi)部，構(gòu)成疏水性腔[14-15]，SY易進(jìn)入蛋白的疏水空腔中，從而使其電活性基團(tuán)隱藏于BSA 內(nèi)部導(dǎo)致峰電流的下降，因此SY在BSA 分子上的結(jié)合位點(diǎn)可能主要位于BSA 疏水腔內(nèi)[16].

根據(jù)圖3，假定日落黃與BSA只形成一種簡(jiǎn)單的化合物BSA-nSY，則結(jié)合常數(shù)和結(jié)合數(shù)可根據(jù)式(1)求得[17].

log[ΔI/(ΔImax-ΔI)]=logβ+nlog[SY]

(1)

式中，ΔI表示引入BSA前后SY峰電流的差值；ΔImax表示的是峰電流的最大差值；n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)；β表示平衡常數(shù)，在BSA-nSY體系中即為結(jié)合常數(shù). 根據(jù)加入BSA前后SY溶液(pH7.2,20 ℃)所測(cè)得的峰電流差值ΔI，即可得到圖4的曲線(xiàn).

圖4 Ip與日落黃濃度的關(guān)系圖Fig.4 Relation of Ip and concentration(a)SY；(b) SY+BSA(1.19×10-7 mol/L)；(c) △I

2.3 不同環(huán)境溫度和酸度對(duì)日落黃與BSA相互作用的影響

為了研究體系環(huán)境對(duì)SY與BSA相互作用的影響，考察了不同溫度和酸度下SY-BSA的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合數(shù)，結(jié)果如表1、表2所列.

由表1可見(jiàn)，溫度對(duì)SY與BSA 的結(jié)合行為有所影響.隨著溫度的升高，兩者的結(jié)合常數(shù)呈逐漸降低的趨勢(shì)，這與SY和BSA由于形成復(fù)合物而引起B(yǎng)SA熒光的靜態(tài)猝滅現(xiàn)象相符[18].

表1 不同溫度下SY與BSA的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合數(shù)(pH 7.2)Table 1 Binding constants and binding numbers of SY-BSA at different temperatures(pH 7.2)

表2 不同pH下SY與BSA的結(jié)合數(shù)和結(jié)合常數(shù)(T=293 K)Table 2 Binding constants and binding numbers of SY-BSA at different pHs(T=293 K)

由于牛血清白蛋白的pI在4.6～5.8之間，當(dāng)pH高于5.0后，SY與BSA結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)基本不變，但是與pH 3.5時(shí)的數(shù)據(jù)相比則有所增強(qiáng)，估計(jì)是由于此時(shí)SY帶正電，而B(niǎo)SA帶負(fù)電，二者之間的靜電作用使得結(jié)合常數(shù)Ka略有上升[19].

2.4 日落黃與BSA相互作用的作用力類(lèi)型判斷

當(dāng)溫度變化不大時(shí)，熱力學(xué)參數(shù)可通過(guò)下列公式求得[20]：

lnKa=-(ΔH/RT)+ΔS/R

(2)

ΔG=ΔH-TΔS

(3)

式中，Ka表示SY與BSA的結(jié)合常數(shù)，T表示溫度.

根據(jù)式(2)可求得反應(yīng)的自由能變?chǔ)和熵變?chǔ)，而當(dāng)溫度變化不大時(shí)，反應(yīng)的焓變?chǔ)視為常數(shù)，可根據(jù)式(3)求得. 對(duì)于本試驗(yàn)體系，將試驗(yàn)得到的不同溫度下結(jié)合常數(shù)Ka值代入上述熱力學(xué)公式，即可求得日落黃與BSA反應(yīng)的有關(guān)熱力學(xué)參數(shù)，如表3所列.

表3 日落黃與BSA結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermodynamic constants for system of SY-BSA

小分子與蛋白質(zhì)之間的作用力主要包括疏水作用力、靜電相互作用、氫鍵以及范德華力. 可以根據(jù)反應(yīng)熱力學(xué)參數(shù)的大小和正負(fù)來(lái)判斷染料分子與蛋白質(zhì)結(jié)合的主要作用力類(lèi)型. 由表3可見(jiàn)△G <0，說(shuō)明結(jié)合反應(yīng)可以自發(fā)進(jìn)行；而ΔH<0、ΔS>0，則表示SY與BSA之間的作用力主要為靜電力，這與不同酸度下結(jié)合常數(shù)的變化趨勢(shì)相符.

3 結(jié)論

利用微分脈沖伏安法研究了日落黃與牛血清蛋白的相互作用，試驗(yàn)結(jié)果表明，兩者之間主要依靠靜電作用力形成近似1∶1的復(fù)合物，從而造成日落黃峰電流的降低. 該研究可以為更深入的了解染料與蛋白質(zhì)的作用機(jī)制提供理論參考.

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Electrochemical Studies on Interaction between Sunset Yellow and Bovine Serum Albumin

LI Jin-huang1, CHEN Yi-ting1,2, ZHENG Jing-jing1, PAN Yan1

(1.ChemistryandChemicalEngineeringDepartmentofMinjiangUniversity,Fuzhou350108，China; 2.EnngineeringResearchCenterofGreenDyeingandFinishinginFujianProvincialUniversity,Fuzhou350108，China)

The interaction between sunset yellow (SY) and bovine serum albumin (BSA) was studied by differential pulse voltammetry. The results showed that the decrease of peak current was caused by the formation of SY and BSA (approximately, 1∶1)composite. The electrostatic force played the main role in their combination. The binding constant was decreased with increasing temperature. The research results are helpful in understanding the metabolism mechanism of SY and BSA at a molecular level, and provide some theoretical references for the study of the biological metabolism mechanism of SY.

sunset yellow; bovine serum albumin; electrochemical

研究報(bào)告(006～010)

2016-12-13;

2017-02-22.

國(guó)家自然科學(xué)基金(21405075)；福建省工業(yè)科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2014H0040)；福建省高校青年自然基金重點(diǎn)項(xiàng)目(JZ160468)；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目(201610395009)；閩江學(xué)院科技項(xiàng)目(MYK15001)資助

李金凰(1995-)，女，本科生，E-mail: 731415770@qq.com

陳毅挺(1978-)，教授，博士，研究方向?yàn)榛瘜W(xué)傳感器與現(xiàn)代分離分析研究工作，E-mail: fjcyt@foxmail.com.

O657.1

A

1006-3757(2017)01-0006-05

10.16495/j.1006-3757.2017.01.002