何平，李林光，王海波，常源升，李慧峰

（山東省果樹研究所，山東泰安 271000）

遮光性套袋對桃果實轉(zhuǎn)錄組的影響

何平，李林光，王海波，常源升，李慧峰

（山東省果樹研究所，山東泰安 271000）

【目的】探明遮光性套袋在桃果實上的轉(zhuǎn)錄組差異，豐富桃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)信息?！痉椒ā窟x取遮光性套袋與對照的桃果實樣品，利用Illumina HiSeqTM 2500進行高通量測序，構(gòu)建桃果實轉(zhuǎn)錄組文庫，并用測序評估、基因功能注釋等生物信息學方法進行分析?！窘Y(jié)果】經(jīng)過測序獲得16.62 Gb clean data測序數(shù)據(jù)，且堿基百分比（Q30）大于91%，遮光性套袋和對照2個桃果實樣品分別獲得65 300 730個reads和66 603 686個reads，分別有85.73%和84.60%的reads與桃參考基因組匹配。以無袋處理為參考，對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行比較，遮光性套袋處理共獲得1 963個差異表達基因，其中，下調(diào)基因708個，上調(diào)基因1 255個；在Nr數(shù)據(jù)庫中對差異基因進一步進行注釋，注釋到1 957個基因，其中，下調(diào)基因有705個，上調(diào)基因有1 252個；COG功能注釋分析發(fā)現(xiàn)這些差異表達基因共獲得853個功能注釋，涉及23個功能類別；在GO功能注釋分析中，注釋到1 609個基因，可以分為53個功能分類，這些分類主要涉及到分子結(jié)合、催化活性、細胞過程、生物調(diào)節(jié)等諸多生理生化過程；KEGG分析發(fā)現(xiàn)共有421個基因被注釋到94個代謝通路中，其中，光合作用相關通路、類黃酮生物合成、核糖體生物合成等通路顯著富集。光合作用通路和類黃酮生物合成通路在果實著色中發(fā)揮了重要作用，而核糖體生物合成代謝通路在果實成熟著色中的作用尚不明確。同時也進行了兩組樣品的果實品質(zhì)檢測，結(jié)果表明，遮光性套袋對桃果實的可溶性固形物及可溶性總糖產(chǎn)生顯著性影響，可溶性固形物及可溶性總糖顯著降低，而對于果實總酸的影響不大，在果實大小上幾乎沒有影響?！窘Y(jié)論】在遮光性套袋處理狀態(tài)下，獲得一定數(shù)量的桃果實差異表達基因，光合作用通路和類黃酮生物合成通路基因在果實著色中發(fā)揮重要作用，遮光性套袋對桃果實的可溶性固形物及可溶性總糖產(chǎn)生顯著性影響。

桃；遮光；套袋；轉(zhuǎn)錄組；高通量測序；功能分類

0 引言

【研究意義】桃（Prunus persica [L.] Batsch）起源于中國，屬于薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus）植物，是世界重要果樹樹種之一，分布廣泛，栽培歷史悠久。中國是世界桃的第一生產(chǎn)大國，面積和產(chǎn)量居世界首位。在桃的種植中，存在病蟲害嚴重、著色不良、外觀品質(zhì)差等問題，降低了果實的商品性。果實套袋已成為生產(chǎn)無公害、綠色果品的主要途徑和技術(shù)措施之一，但套袋對桃果實生長發(fā)育及其內(nèi)在品質(zhì)也造成一定程度的負面影響[1-4]。【前人研究進展】郭寶林等[5]和陳海江等[6]對燕紅、早露蟠桃、北京早艷等桃品種進行套袋試驗，結(jié)果表明，套袋處理使果實單果重明顯減輕。陳建軍[7]對9個桃品種套袋，套袋果的可溶性固形物含量均低于對照，而且套袋處理后油桃的固形物含量比普通桃降低幅度更大。沈玉英等[8]和LI等[9]在桃果實套袋上也得到了類似的結(jié)果。WANG等[10]發(fā)現(xiàn)套袋導致桃果實風味降低，不套袋桃果實的總揮發(fā)性成分的含量及C6化合物和酯類要顯著高于套袋果實，γ-癸內(nèi)酯、δ-癸內(nèi)酯的質(zhì)量濃度要顯著低于不套袋果實。套袋在改善果實外觀的同時，對果實內(nèi)在品質(zhì)產(chǎn)生一定影響，因此，光照可直接和間接影響果實品質(zhì)[11-12]。套袋減少了果實著色，降低了果實可溶性固形物含量，使得風味變淡[13]?！颈狙芯壳腥朦c】目前，關于桃果實套袋對果實品質(zhì)和色澤發(fā)育的影響，多數(shù)是從生理生化角度進行研究，從全基因組表達方面的研究仍鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究以易著色的晚熟桃品種‘秋雪’為材料，研究遮光性套袋與無袋栽培在桃果實轉(zhuǎn)錄組中基因表達上的差異，以期探討遮光性套袋影響桃果實著色和品質(zhì)的機制，為深入研究桃果實著色的基因調(diào)控機制提供理論依據(jù)，進一步為優(yōu)質(zhì)桃果品的生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試桃品種為山東省果樹研究所選育的桃新品種‘秋雪’，定植于山東省果樹研究所桃種質(zhì)資源圃內(nèi)，5年生樹，株距為2 m，行距為4 m，主干形整枝，選擇干周、冠徑及樹勢等基本一致的作為試驗材料。

供試果袋（雙層外黃內(nèi)紅紙袋，規(guī)格為14 cm× 18 cm，外層為全木漿紙，內(nèi)層為石蠟紙）選自青島小林制袋有限公司。

試驗設不套袋（對照）和盛花后 50 d套袋（2014年5月10日），單株小區(qū)，隨機排列，8月18日沿樹冠外圍距地面1.5—2 m處隨機采收30個果實，3次重復，用液氮迅速冷凍，-80℃保存?zhèn)溆茫▓D1）。

1.2 樣品的RNA提取和檢測

采用天根 TRNzol Universal總 RNA提取試劑（DP424）提取桃果實RNA，步驟參考其說明書。采用Nanodrop、Qubit 2.0、Agilent 2100分別檢測RNA樣品的純度、濃度和完整性。

圖1 桃果實的形態(tài)特征Fig. 1 Morphological characteristics of peach fruits

1.3 cDNA文庫構(gòu)建和質(zhì)控文庫制備

樣品檢測合格后，進行文庫構(gòu)建，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA；加入Fragmentation Buffer將mRNA進行隨機打斷；以mRNA為模板，用六堿基隨機引物（random hexamers）合成第一條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和 DNA polymerase I合成第二條cDNA鏈，利用AMPure XP beads純化cDNA；純化的雙鏈cDNA再進行末端修復、加 A尾并連接測序接頭，然后用 AMPure XP beads進行片段大小選擇；最后通過PCR富集得到cDNA文庫。

文庫構(gòu)建完成后，分別使用 Qubit2.0和 Agilent 2100對文庫的濃度和插入片段大?。↖nsert Size）進行檢測，使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量，以保證文庫質(zhì)量。

1.4 測序和數(shù)據(jù)處理

利用Illumina HiSeqTM 2500平臺進行高通量測序，測序讀長為PE125。

通過對原始序列（Raw reads）去除接頭、重復冗余、低質(zhì)量序列來獲得高質(zhì)量序列（Clean reads），并采用TopHat2[14]軟件將clean reads與桃參考基因組（ftp://ftp.bioinfo.wsu.edu/species/Prunus_persica/Prunu s_ persica-genome. v1.0/）進行序列比對（允許有2個堿基的錯配）。

1.5 差異基因的篩選

采用FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped）值來反映基因的表達量[15]，然后將不同樣品的基因表達量使用IDEG6軟件（http://telethon.bio.unipd.it/ bioinfo/IDEG6）進行卡方檢驗，通過多重假設檢驗（false discovery ratio，F(xiàn)DR）對P值進行校正；校正后取P＜1%，并且樣品間FPKM比值（Fold change≥2）≥2的基因，作為差異表達基因。

1.6 差異表達基因的COG分類、GO分類和KEGG富集分析

將差異表達基因和 Nr數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得差異表達基因在 Nr數(shù)據(jù)庫中的注釋信息；與 COG（Clusters of orthologous groups of proteins）數(shù)據(jù)庫進行比對分析，獲得差異表達基因的 COG功能注釋及其分類；利用Blast2GO[16]和WEGO軟件[17]對差異表達基因進行GO（Gene ongology）功能注釋及分類；與KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得差異表達基因相對應的Pathway注釋信息。

1.7 差異表達基因熒光定量PCR分析

采用TransScript II All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（北京全式金）試劑盒對1.2中提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄；用SYBRGreen染料進行熒光定量PCR（qRT-PCR）分析，以2-ΔΔCt法計算基因的差異倍數(shù)。每個樣品 3次重復。選用 PpN1（ppa009483m）為內(nèi)參基因，引物序列參考文獻[18]（表1）。

表1 用于qRT-PCR分析的基因及其引物Table 1 The qRT-PCR primers for the 6 selected genes

1.8 果實品質(zhì)檢測

選用1.1部分采收的果實，每個處理隨機選取30個果實測定平均單果質(zhì)量，根據(jù) GB/T12295-1990、GB/T12456-2008和 GB/T6194-1986標準委托農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（濟南）檢測果實可溶性固形物、可溶性總糖和總酸含量的測定。

2 結(jié)果

2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

遮光性套袋和對照的測序原始數(shù)據(jù)堿基組成基本平衡，而且大部分reads的堿基質(zhì)量值分布于20以上，說明測序所得的原始數(shù)據(jù)質(zhì)量較好，可以滿足后續(xù)的分析。

2個樣品共得到16.62 Gb Clean Data測序數(shù)據(jù)，并且堿基百分比（Q30）大于 91%。充分說明測序得到的數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠，滿足后續(xù)分析。遮光性套袋和對照分別獲得65 300 730個reads和66 603 686個reads，與參考基因組匹配的reads分別有55 984 355個和56 344 011個，占總讀數(shù)的85.73%和84.60%。表明 2個樣品的 reads與參考基因組的比對效率較高。

2.2 差異表達基因的篩選

通過對桃果實轉(zhuǎn)錄組FPKM值的測定（表2），發(fā)現(xiàn)遮光性套袋處理的桃果實轉(zhuǎn)錄組 FPKM值＜5的基因占 70.50%，＞100的基因占 4.25%；對照組的FPKM值＜5的基因占70.59%，＞100的基因占4.34%，二者差異不顯著。為了檢測遮光性套袋對桃果實基因表達的影響，使用IDEG6軟件，將差異倍數(shù)（fold change）＞2，顯著水平P＜0.05作為顯著差異的表達基因。共獲得1 963個差異表達基因，其中，下調(diào)基因708個，上調(diào)基因1 255個，進一步將這些差異基因在Nr數(shù)據(jù)庫中進行注釋，得到1 957個注釋基因，其中下調(diào)基因有 705個，上調(diào)基因有1 252個。

表2 桃果實FPKM值Table 2 FPKM values of peach fruits

2.3 差異表達基因COG注釋

對Nr數(shù)據(jù)庫中注釋到的1 957個差異表達基因在COG數(shù)據(jù)庫中進行比對和功能注釋，結(jié)果表明，在COG功能分類體系中，共獲得853個COG功能注釋，涉及23個COG功能類別（圖2）。其中，最大群體比例為R（一般功能基因），有242個基因；其次為K類（轉(zhuǎn)錄）、L類（復制、重組和修復）和T類（信號傳導機制），分別有116、126和105個基因。

圖2 差異表達基因COG功能分類圖Fig. 2 COG function classification of differentially expressed genes

2.4 差異表達基因的GO的分類

利用Blast2GO軟件對差異表達基因進行GO分類和功能注釋。結(jié)果表明，共分為3大類別（細胞組分、分子功能和生物過程），53個小類（圖 3），1 963個差異表達基因中有1 609個獲得功能注釋，其中有1 431個差異基因（占總差異基因的88.94%）分類到細胞組分中的16個類別，另外按照分子功能分成17個類別，有 1 342個差異基因（占總差異基因的83.41%），按照生物過程分成20個類別，有1 533個差異基因（占總差異基因的95.28%）。在細胞組分分類中，細胞部分（cell part）和細胞（cell）所占比例最多，分別占 97.83%和 96.09%，其次是細胞器（organelle），占82.50%；而細胞外基質(zhì)（extracellular matrix）和細胞外基質(zhì)部分（extracellular matrix part）比例最低，分別僅有2條序列。在分子功能分類中，結(jié)合（binding）和催化活性（catalytic activity）所占比例最多，分別占 68.18%和 68.48%，其次是轉(zhuǎn)動活性（transporter activity）和核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性（nucleic acid binding transcription factor activity），分別占9.24%和8.42%；而營養(yǎng)庫活性（nutrient reservoir activity）的比例最低，僅有4條序列。在生物學過程中，細胞過程（cellular process）、代謝過程（metabolic process）、單一生物過程（single organism process）和刺激反應（response to stimulus）所占比例最多，分別占91.45%、88.39%、87.21%和74.56%，而細胞殺傷（cell killing）和生物相（biological phase）比例最低，僅有2條和1條序列。

2.5 差異表達基因KEGG富集分析

差異表達基因的KEGG分析結(jié)果如圖4所示，共有421個差異表達基因被注釋到了94個通路中，其中顯著富集通路（P＜0.05）有5個，主要參與到光合作用通路、類黃酮生物合成、核糖體生物合成等通路中（表 3）。在各通路中注釋到基因多數(shù)表達下調(diào)，其中光合作用（photosynthesis）注釋到25個差異表達基因（22個下調(diào)，3個上調(diào)），光合作用-天線蛋白通路（photosynthesis-antenna proteins）注釋到9個差異表達基因（8個下調(diào)，1個上調(diào)），類黃酮生物合成途徑（flavonoid biosynthesis），注釋到12個差異表達基因（11個下調(diào)，1個上調(diào)），DNA復制路徑（DNA replication）注釋到13個差異表達基因（11個下調(diào)，2個上調(diào)），光合生物碳固定作用通路（carbon fixation in photosynthetic organisms）注釋到14個差異表達基因（13個下調(diào)，1個上調(diào)）。類黃酮生物合成途徑KEGG數(shù)據(jù)庫圖譜如圖 5所示，差異表達的基因大多下調(diào)（綠色），注釋到的12個差異表達基因多數(shù)參與花色苷生物合成途徑，如F3H（ppa007636m）、LDOX（ppa007738m）、DFR（ppa008069m）、ANR（ppa008295m）、CHI（ppa011276m）等功能基因，且均表現(xiàn)下調(diào)。

圖4 差異表達基因KEGG功能分類圖Fig. 4 KEGG function classification of differentially expressed genes

表3 差異表達基因KEGG代謝途徑分類Table 3 KEGG classification of differentially expressed genes

圖5 KEGG數(shù)據(jù)庫中類黃酮生物合成途徑Fig.5 Flavonoid biosynthesis pathway in KEGG

2.6 差異表達基因的qRT-PCR熒光定量分析

對類黃酮途徑中的關鍵基因F3H（ppa007636m）、LDOX（ppa007738m）、DFR（ppa008069m）、ANR（ppa008295m）、CHI（ppa011276m）進行qRT-PCR熒光定量分析（表4），發(fā)現(xiàn)遮光性套袋處理的桃果實樣品各基因的表達均與對照表現(xiàn)下調(diào)趨勢，只是差異倍數(shù)上與轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)有所區(qū)別。

表4 差異表達基因的RNA-Seq FPKM值、qRT-PCR相對表達水平及其比率Table 4 RNA-Seq FPKM value, qRT-PCR relative expressionlevel, ratio of CK and QX in the differentially expressed genes

2.7 果實品質(zhì)的檢測

由表5的測評結(jié)果可知桃果實遮光性套袋對果實的可溶性固形物及可溶性總糖產(chǎn)生顯著性影響，可溶性固形物及可溶性總糖顯著降低，而對于果實總酸的影響不大。在果實大小上幾乎沒有影響。

3 討論

高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在挖掘差異表達基因，揭示生物基因表達及調(diào)控機理發(fā)揮了重要作用[19-22]。本研究通過Illumina HiSeqTM 2500高通量測序技術(shù)構(gòu)建了遮光性套袋桃果實及其對照的轉(zhuǎn)錄組文庫，獲得大量的轉(zhuǎn)錄組信息。處理與對照共獲得16.62 Gb Clean Data 數(shù)據(jù)量，比對到桃參考基因組上的reads在84%以上，說明本試驗文庫構(gòu)建很成功，數(shù)據(jù)覆蓋度較高。通過對文庫分析，獲得1 963個差異基因，其中1 957個基因在Nr數(shù)據(jù)庫中得到功能注釋，未得到注釋的差異表達基因有6個；有1 609個基因獲得GO功能注釋，348個基因未得到GO功能注釋；421個基因被注釋到了KEGG的94個代謝通路中，153個基因未得到KEGG的注釋。這種造成基因注釋信息缺失的現(xiàn)象，前人認為轉(zhuǎn)錄組序列越短，獲得注釋信息就越少[23]。

表5 果實品質(zhì)檢測分析Table 5 Analysis of the fruit quality detection

COG功能分類表明，853個差異表達基因獲得COG功能注釋，包括23個功能類別。GO功能注釋分類顯示，差異表達基因主要涉及細胞相關類別（包括細胞部分、細胞、細胞器等）、分子結(jié)合、細胞過程、代謝過程等類型。深入對差異基因進行 Pathway分析，進一步對差異表達基因參與的主要代謝途徑和信號傳導途徑進行研究，有利于明確差異表達基因在生物代謝周期中發(fā)輝的功能以及與其他基因的相互作用[22-23]。本研究KEGG Pathway富集分析表明，差異表達基因共涉及到94個通路，其中光合作用相關通路3個、類黃酮生物合成1個、核糖體生物合成1個等5個通路顯著富集。果實色澤是果實商品品質(zhì)的重要因素之一，果實成熟著色是由于葉綠素降解，同時形成顯現(xiàn)類胡蘿卜素或花青苷的結(jié)果?；ㄇ嘬帐且活愵慄S酮化合物，花青苷是果實的次生代謝產(chǎn)物之一，它是經(jīng)過莽草酸途徑合成的[24]，花青苷的生物合成是依賴光照進行的反應過程[25]?；ㄇ嘬帐怯苫ㄉ睾吞墙M成，而花色素又是在糖代謝的基礎上由丙酮酸和乙酸縮合而成的[26-27]。花青苷含量和著色程度與果肉中還原糖和可溶性糖含量呈顯著相關，可溶性固形物含量與花青苷合成呈正相關[28-29]。套袋雖然在一定程度上降低果實的含糖量，但也能有效地促進果實著色[13,30]。這一事實說明果實著色在一定范圍內(nèi)受限于果實中含糖量，如果越過一定閾值則含糖量不再成為限制因素；再則充分表明光照對果實著色的重要性，果實套袋增加光有效性的同時也促使光照不足，以致有關基因不能活化[31-32]。前人研究認為光照影響花青苷合成和果實著色，首先光照影響光合作用，進而影響糖、苯丙氨酸等有機物合成；其次光照調(diào)解花青苷合成相關酶的活性，其中查爾酮合成酶（CHS）、查爾酮異構(gòu)酶（CHI）、黃烷酮 3-羥化酶（F3H）、二羥基黃酮醇還原酶（DFR）、花色素合成酶（ANS）等基因的表達受到光照因子的誘導[33-37]。本研究顯著富集的通路中有3個與光合作用相關，充分說明了光照在果實成熟期對著色的重要性，同時又顯著富集到類黃酮生物合成通路，進一步說明光照調(diào)控花青苷代謝過程相關基因表達的事實。本研究篩選到了參與此通路上的F3H、LDOX、DFR、ANR、CHI等5個差異表達基因，且表達水平較對照低，說明套袋增加了光的有效性，但光照不足，以致有關基因不能活化或表達水平較低，此結(jié)果與王惠聰在荔枝[27]上和馬瑞娟等[38]在桃上的研究相似。同時檢測發(fā)現(xiàn)遮光性套袋顯著降低了果實的可溶性固形物的含量，進一步證明套袋在一定程度上降低果實的含糖量的論點，說明可溶性固形物含量與花青苷合成呈正相關。此外，核酸生物合成（DNA復制）也得到了顯著富集，這類代謝通路在果實著色上的作用尚不明確。差異表達基因 KEGG Pathway分析表明光照與類黃酮生物合成通路調(diào)控著果實著色，但具體的調(diào)控機制還需要對相關通路的基因進行更深入的研究。

4 結(jié)論

通過高通量測序技術(shù)獲得一定數(shù)量在遮光性套袋處理狀態(tài)下桃果實差異表達基因，光合作用通路和類黃酮生物合成通路基因在果實著色中發(fā)揮了重要作用，再次印證了遮光性套袋對桃果實的可溶性固形物及可溶性總糖產(chǎn)生顯著性影響。

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（責任編輯 李莉）

Effects of Shading Fruit with Opaque Paper Bag on Transcriptome in Peach

HE Ping, LI LinGuang, WANG HaiBo, CHANG YuanSheng, LI HuiFeng
(Shandong Institute of Pomology, Tai’an 271000, Shandong)

【Objective】 The objective of this study was to find the transcriptome differences between shading fruits with opaque paper bags and CK in peach, and enrich the peach transcriptome data. 【Method】 Selecting peach fruits as samples (shading fruits with opaque paper bags and CK, respectively), then the transcriptome libraries of peach fruits were constructed by using the Illumina HiSeqTM 2500 sequencing technique, and were analyzed by using the bioinformatics methods subsequently, such as sequencing assess and gene function annotation. 【Result】 The results showed that the 16.62 Gb transcriptome data were obtained from both the shading bagged fruits and CK , and the base ratios with quality values higher than 30 in reads (Q30) were more than 91% from both the shading fruits and CK. There were 65 300 730 reads and 66 603 686 reads transcriptome data were obtained from the peach fruits used bagging or not, and 85.73% and 84.60% reads could be compared to the peach reference genome sequence, respectively. Compared the transcriptome of shading bagged fruits with CK, 1 963 differentially expressed genes were found in theshading bagged fruits, including 1 255 up-regulated genes and 708 down-regulated genes. Annotation analysis indicated that 1 957 genes were annotated in Nr data, including 1 252 up-regulated genes and 705 down-regulated genes. Through COG analysis, there were 853 functional annotations of these differentially expressed genes, involving 23 functional classifications. With GO function annotation classifications, a total of 1 609 genes were divided into 53 function categories, in which many functional categories were mainly involved, such as molecular binding, catalytic activity, cell process, biological regulation. KEGG analysis showed that a total of 421 genes were annotated to 94 metabolic pathways, and photosynthesis signaling pathway, carbon fixation in photosynthetic organisms, photosynthesis-antenna proteins signaling pathway, flavonoid biosynthesis, ribosome biosynthesis (DNA replication) pathway were significantly enriched. The photosynthesis and flavonoid biosynthesis signaling pathway played an important role in fruit color, but the role of ribosome biosynthesis was not clear. The fruit quality also was detected from the shading bagged fruits and CK. The results showed that shading bagged peach fruits had a remarkable impact on soluble solids and total soluble sugar, which were significantly reduced. But the study also found, on average, little or no effect on total acid and per fruit weight from both the shading fruits and CK. 【Conclusion】 The number of differentially expressed genes under different physiological status of the fruit tissue in peach were obtained. The study found that the photosynthesis and flavonoid biosynthesis signaling pathway played an important role in fruit color and shading bagged peach fruits had a remarkable impact on soluble solids and total soluble sugar.

peach; shading; bagging; transcriptome; high-throughput sequencing; functional classification

2016-07-01；接受日期：2016-10-09

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-31）、山東省農(nóng)業(yè)重大應用技術(shù)創(chuàng)新課題（2014-38）、山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程（CXGC2016B07）

聯(lián)系方式：何平，E-mail：heping024@163.com。通信作者李林光，Tel：0538-8266675；E-mail：llg6536@163.com