周麗，付智丹，杜青，陳平，楊文鈺，雍太文

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部西南作物生理生態(tài)與耕作重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/四川省作物帶狀復(fù)合種植工程技術(shù)研究中心，成都 611130）

減量施氮對(duì)玉米/大豆套作系統(tǒng)中作物氮素吸收及土壤氨氧化與反硝化細(xì)菌多樣性的影響

周麗，付智丹，杜青，陳平，楊文鈺，雍太文

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部西南作物生理生態(tài)與耕作重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/四川省作物帶狀復(fù)合種植工程技術(shù)研究中心，成都 611130）

【目的】揭示玉米/大豆套作系統(tǒng)下作物根際土壤細(xì)菌數(shù)量及群落多樣性變化特征與土壤總氮含量、作物氮素吸收之間的關(guān)系，為禾/豆間（套）作減肥增效生產(chǎn)提供理論和技術(shù)支撐。【方法】大田試驗(yàn)于2013—2015年進(jìn)行，采用兩因素裂區(qū)設(shè)計(jì)，主因素為種植模式，設(shè)玉米單作（MM）、大豆單作（SS）和玉米/大豆套作（IMS）；副因素為玉米、大豆施氮總量，設(shè)不施氮（NN：0）、減量施氮（RN：180 kg·hm-2）和常量施氮（CN：240 kg·hm-2）。在玉米V12期、VT期和R6期，大豆V5期、R2期、R5期和R8期，利用稀釋平板法和凱氏定氮法測(cè)定各作物根際土壤細(xì)菌數(shù)量、非根際土壤和植株總氮含量；結(jié)合克隆文庫(kù)和熒光定量PCR技術(shù)研究各處理氨氧化細(xì)菌（amoA基因）、反硝化細(xì)菌（nirS基因）多樣性及其基因豐度?！窘Y(jié)果】與相應(yīng)的單作相比，套作玉米（IM）的作物根際土壤細(xì)菌數(shù)量提高2.6%，套作大豆提高12.9%；套作玉米土壤總氮含量和植株吸氮量分別提高13.39%和2.10%，大豆的分別降低5.81%和3.24%；套作玉米、大豆的amoA基因豐度比單作增加了38.5%、64.8%，nirS基因豐度比單作提高57.77%、126.39%。各施氮水平間，RN的玉米根際土壤細(xì)菌數(shù)量比NN和CN的分別提高9.6%和9.8%，大豆的分別提高11.7%和11.0%；施氮提高了玉米、大豆植株吸氮量和土壤總氮含量，單作玉米隨施氮量的增加而增加，套作玉米及單、套作大豆的均在RN下最高；減量施氮提高了玉米、大豆amoA基因多樣性指數(shù)和單作玉米nirS基因多樣性指數(shù)，降低了套作玉米和單套作大豆nirS基因多樣性指數(shù)?！窘Y(jié)論】減量施氮有利于增加玉米/大豆套作系統(tǒng)中作物根際土壤細(xì)菌數(shù)量，調(diào)節(jié)氨氧化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性，改善土壤氮素轉(zhuǎn)化過(guò)程，促進(jìn)玉米、大豆對(duì)氮素的吸收，實(shí)現(xiàn)節(jié)肥增效。

玉米/大豆套作；減量施氮；細(xì)菌多樣性；氮素吸收

0 引言

【研究意義】土壤微生物是土壤物質(zhì)循環(huán)的重要推動(dòng)者[1]，土壤中已存在的或人為施入的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)都需要通過(guò)微生物的加工才能為植物所利用。同時(shí)，它也是土壤環(huán)境的重要監(jiān)測(cè)者，對(duì)土壤環(huán)境質(zhì)量的變化十分敏感[2]，其種群、數(shù)量、活性和群落結(jié)構(gòu)受到多種因素的影響[3-9]。此外，微生物活動(dòng)直接影響土壤的理化性質(zhì)[10]，與土壤養(yǎng)分的固定與釋放緊密相關(guān)[11]，現(xiàn)已作為評(píng)價(jià)土壤肥力的重要標(biāo)志之一[2]。施肥作為重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)措施，會(huì)對(duì)土壤類(lèi)型、土壤肥力產(chǎn)生深刻的影響[12]，氮肥進(jìn)入土壤后的一系列轉(zhuǎn)化離不開(kāi)與氮素轉(zhuǎn)化相關(guān)的微生物的參與。氨氧化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌分別是硝化作用和反硝化作用的限制性步驟[13-14]，兩者的變化直接影響農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)土壤氮素的轉(zhuǎn)化利用和氮損失[15]，其中，amoA為氨氧化細(xì)菌的調(diào)控酶AMO的活性中心，常作為研究環(huán)境中氨氧化微生物的分子標(biāo)記[16]，而含有nirS基因的細(xì)菌以假單胞菌占優(yōu)勢(shì)，在不同的菌株中分子大小相似、形態(tài)結(jié)構(gòu)保守[17]常作為反硝化細(xì)菌的研究對(duì)象。間套作在不增加耕地面積的前提下，顯著增加了播種面積，提高糧食產(chǎn)出，同時(shí)豆-禾間套作不僅有增產(chǎn)效應(yīng)[9,18-21]，還提高養(yǎng)分利用率[9,21-23]，降低氮素?fù)p失[24]，實(shí)現(xiàn)保肥、改善農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)功能[25]。因此，研究套作和施氮水平對(duì)氨氧化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌群落變化及其與作物氮素吸收的關(guān)系對(duì)于解析土壤氮素循環(huán)、提高間套作系統(tǒng)氮肥利用率具有十分重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】玉米/大豆帶狀套作作為中國(guó)南方旱地農(nóng)業(yè)的一種主要種植模式，在增產(chǎn)[26]、提高養(yǎng)分利用方面效果顯著[27]，前期研究表明減量施氮可以促進(jìn)該模式增產(chǎn)節(jié)肥[28]，顯著提高作物產(chǎn)量和養(yǎng)分吸收，套作大豆根系可分泌更多的質(zhì)子和有機(jī)酸，活化難溶性磷，促進(jìn)作物磷吸收[29]；大豆通過(guò)根瘤菌固氮滿(mǎn)足對(duì)氮需求的同時(shí)促進(jìn)了玉米對(duì)氮素的吸收，有利于系統(tǒng)增產(chǎn)[26]。由此推測(cè)系統(tǒng)養(yǎng)分高效利用和增產(chǎn)效應(yīng)與作物地下根系吸收能力及土壤環(huán)境有關(guān)，尤其是與土壤中微生物的變化情況密切相關(guān)。雍太文等[4]研究表明，麥/玉/豆套作提高了各作物根際細(xì)菌、真菌、放線(xiàn)菌數(shù)量。張向前等[5]證實(shí)間作在不同施肥條件下可顯著提高土壤中細(xì)菌、放線(xiàn)菌和固氮菌數(shù)量。涂勇等[8]表明，考煙-大豆帶狀套作顯著增加了作物根際細(xì)菌、放線(xiàn)菌數(shù)量，減少了真菌數(shù)量，與氮素代謝相關(guān)微生物數(shù)量顯著增加。宋亞娜等[30]研究表明，在短期定位試驗(yàn)中氮肥能夠顯著提高稻田土壤反硝化細(xì)菌的豐度。武傳東等[31]基于氨單加氧酶基因的研究表明，長(zhǎng)期施用氮肥和磷肥對(duì)土壤氨氧化古菌多樣性有較大影響。劉驍蒨等[32]通過(guò)秸稈還田和施肥對(duì)稻田土壤中固氮菌群落結(jié)構(gòu)的影響進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)秸稈還田配施足量氮磷鉀肥后土壤中固氮菌多樣性最為豐富?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】國(guó)內(nèi)外學(xué)者圍繞施肥對(duì)單作作物的根際生態(tài)環(huán)境、微生物數(shù)量及群落多樣性影響等做了大量研究，對(duì)揭示單作體系下作物養(yǎng)分高效利用的根際微生態(tài)機(jī)理做出了較大貢獻(xiàn)；但尚未對(duì)玉米/大豆套作系統(tǒng)的土壤細(xì)菌多樣性及其與套作系統(tǒng)中作物氮素高效吸收的關(guān)系進(jìn)行報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)比較玉米、大豆單套作及不同施氮水平下作物氮素吸收及根際土壤細(xì)菌群落多樣性的差異，明確減量施氮對(duì)玉米/大豆套作系統(tǒng)根際土壤氨氧化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌多樣性的調(diào)節(jié)作用及其與植株氮素高效吸收的關(guān)系，優(yōu)化玉米/大豆套作體系施肥方法，為禾/豆間（套）作減肥增效生產(chǎn)提供理論和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)及材料

試驗(yàn)于2013年3月至2015年10月在四川省現(xiàn)代糧食產(chǎn)業(yè)（仁壽）示范基地（30°07′N(xiāo)、104°18′E）進(jìn)行。試驗(yàn)地土壤類(lèi)型為紫色土，供試玉米品種為登海605，由山東登海種業(yè)股份有限公司提供；大豆品種為南豆12，由四川省南充市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供。供試土壤2013年基礎(chǔ)肥力為pH 6.6，有機(jī)質(zhì)29.8 g·kg-1，全氮 1.6 g·kg-1，全磷 1.28 g·kg-1，全鉀 16.3 g·kg-1，速效氮317 mg·kg-1，速效磷42.2 mg·kg-1，速效鉀382 mg·kg-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用二因素裂區(qū)設(shè)計(jì)，主因素為種植方式：玉米單作（MM）、大豆單作（SS）、玉米/大豆套作（IMS）；副因素為玉米、大豆施氮總量（玉米、大豆施氮比例為3:1）：不施氮（NN：0）、減量施氮（RN：180 kg·hm-2，根據(jù)當(dāng)?shù)赜衩资┑看_定）、常量施氮（CN：240 kg·hm-2，根據(jù)當(dāng)?shù)赜衩着c大豆的總施氮量確定）。重復(fù)3次。每處理連續(xù)種3帶，帶長(zhǎng)6 m、帶寬2 m。玉米、大豆種植模式如圖 1，單作采用等行距種植，玉米行距 100 cm、大豆行距 50 cm，玉米、大豆穴距17 cm，穴留 1 株；玉米/大豆套作采用寬窄行種植，套作玉米（IM）寬行 160 cm，窄行 40 cm，在玉米大喇叭口期將兩行大豆播種于玉米寬行內(nèi)，套作大豆（IS）行距 40 cm，玉米與大豆間距 60 cm，穴距均為 17 cm，玉米穴留 1 株，密度 5.85萬(wàn)株/hm2，大豆穴留2株，密度11.7萬(wàn)株/hm2，玉米、大豆單作與套作的種植密度相同。玉米氮肥分兩次施用，即玉米底肥和大喇叭口期追肥，大豆氮肥一次性作底肥施用（表 1）。玉米、大豆單作按株間穴施方式施肥，玉米/大豆套作按玉米、大豆一體化施肥方式，即玉米底肥統(tǒng)一施72 kg N·hm-2，玉米大喇叭口期追肥與大豆氮磷鉀肥混合施用，在玉米、大豆之間，距玉米25 cm處開(kāi)溝施肥，各作物氮肥施用方式及施用量見(jiàn)表1；單、套作玉米及單作大豆的磷鉀肥隨底肥施用，玉米施用量為105 kg P2O5·hm-2、112.5 kg K2O·hm-2，大豆施用量為63 kg P2O5·hm-2、52.5 kg K2O·hm-2。玉米/大豆套作系統(tǒng)的共生期為玉米大喇叭口期至玉米收獲（大豆出苗至分枝期），2013年，玉米4月3日播種，8月1日收獲；大豆6月11日播種，10月29日收獲；2014年，玉米3月29日播種，7月26日收獲；大豆6月9日播種，10月28日收獲；2015年，玉米3月27日播種，7月25日收獲；大豆6月7日播種，10月25日收獲。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目和方法

1.3.1 植株樣品的采集 于作物成熟期采集植株樣品，單套作下玉米、大豆取樣方法相同，在每小區(qū)隨機(jī)選取長(zhǎng)勢(shì)一致的兩段，每段取對(duì)稱(chēng)2行的連續(xù)2穴，玉米單套作均為4株，大豆單套作均為8株。

圖1 不同種植模式示意圖Fig. 1 Diagram of different planting patterns

1.3.2 土壤樣品的采集 土壤樣品于玉米大喇叭口期（V12）、抽雄期（VT）和成熟期（R6），大豆五節(jié)期（V5）、盛花期（R2）、初莢期（R5）和成熟期（R8），采用挖掘法取土壤樣品。每小區(qū)隨機(jī)取長(zhǎng)勢(shì)一致樣段兩段，每段取對(duì)稱(chēng)2行的連續(xù)2穴，將植株根系從土壤中整體挖出（40 cm深），抖掉與根系松散結(jié)合的土體（非根土），然后用經(jīng)火焰滅菌的鑷子刮取附在根系上的一薄層（＜10 mm）土壤作為根際土壤。并將取得的兩段植株根際土樣整碎混勻按4分法取樣，取后立即放入冰盒中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后，迅速過(guò) 2 mm土篩，除去可見(jiàn)根系、動(dòng)植物殘?bào)w和石塊等雜物，并保存到-20℃條件下用于指標(biāo)測(cè)定。

表1 不同種植模式的氮肥施用量Table 1 N fertilization rates in different planting patterns

1.3.3 植株和土壤樣品測(cè)定 植株吸氮量：將成熟期植株樣地上部莖葉和籽粒分裝，105℃下殺青 30 min后，75℃烘至恒重，測(cè)定干物質(zhì)重量；隨后將樣品粉碎并過(guò)60目篩，采用凱氏定氮法測(cè)定總氮含量，植株各器官吸氮量（kg·hm-2）=植株各器官干物質(zhì)重量（kg·hm-2）×植株各器官氮濃度（g·g-1）；土壤總氮含量：將成熟期非根際土壤風(fēng)干后研磨過(guò)60目篩，采用凱氏定氮法測(cè)定土壤總氮；土壤細(xì)菌數(shù)量：用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性培養(yǎng)[33]，通過(guò)平板計(jì)數(shù)法測(cè)定玉米、大豆各取樣時(shí)期下根際土壤中細(xì)菌數(shù)量。

土壤總DNA提取、PCR擴(kuò)增及克隆文庫(kù)的構(gòu)建：稱(chēng)取玉米或大豆根際土壤樣品 0.5 g（-20℃保存），按E.Z.N.A Soil DNA Kit試劑盒說(shuō)明，提取土壤微生物總DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后DNA樣品于-20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ蕴崛〉腄NA為模板，用特異引物（表2）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，基因PCR擴(kuò)增體系為：2×Power Taq PCR Master Mix 25μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 21 μL，總共50 μL。并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用Axygen DNA 回收試劑盒回收和純化PCR產(chǎn)物，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。將回收片段與bluntsimple載體連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，采樣藍(lán)白斑篩選方法篩選陽(yáng)性克隆并送樣測(cè)序。將所測(cè)序列在NCBI上進(jìn)行同源性比對(duì)，利用mothur軟件分別將相似性≥97%的amoA和相似性≥90%的nirS基因序列歸為同一個(gè)操作分類(lèi)單元（Operational TaxonomicUnits，OTUs），并估算每個(gè)克隆文庫(kù) aomA和nirS基因多樣性指數(shù)Shannon-Weiner（H′）和Simpson（D）、Evenness J，覆蓋百分率（Coverage，C）。

文庫(kù)多樣性指數(shù)計(jì)算公式：

式中，Pi表示第i個(gè)種占總數(shù)的比例；H為香農(nóng)指數(shù)，Hmax為H的最大值。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Q-PCR） 吸取10 μL陽(yáng)性克隆菌液于1 mL含氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)10 h，提取質(zhì)粒并測(cè)定濃度，進(jìn)一步換算成拷貝數(shù)。10梯度倍稀釋構(gòu)建amoA、nirS基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍在103—107。

質(zhì)粒濃度換算公式：拷貝數(shù)（μL）= 質(zhì)粒濃度（ng·μL-1）×6.02×1014/分子量

每個(gè)樣品重復(fù)3次進(jìn)行熒光定量PCR，引物參見(jiàn)表2。反應(yīng)體系為：SybrGreen qPCR Master Mix 12.5 μL，引物F（10 μmol·L-1） 0.5 μL，引物R（10 μmol·L-1）0.5 μL，ddH2O 9.5 μL，Template（cDNA）2 μL，共25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；最后加上溶解曲線(xiàn)過(guò)程（95℃ 15 s，60℃15 s，95℃ 15 s）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理計(jì)算，基因序列利用mothur軟件進(jìn)行分類(lèi)后再通過(guò)Gene Marker軟件計(jì)算多樣性指數(shù)，并利用SPSS 18.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、LSD顯著性檢測(cè)和相關(guān)性分析。

表2 amoA和nirS基因引物序列及限制性?xún)?nèi)切酶[15,34]Table 2 amoA and nirS gene sequences of primers and restriction enzymes

2 結(jié)果

2.1 土壤總氮含量與植株氮素吸收

2.1.1 土壤總氮含量 套作下減量施氮促進(jìn)了玉米、大豆土壤總氮含量的增加（表 3），減氮處理下的IMS土壤總氮含量最高，與MM（SS）相比，IM土壤總氮含量增加 13.39%，而 IS土壤總氮含量降低了5.81%。施氮與不施氮相比，除2015年大豆的土壤總氮含量呈降低趨勢(shì)外，施氮顯著提高了玉米大豆的土壤總氮含量；各施氮水平間，IMS的土壤總氮含量均以RN 的最高，與NN和CN相比，IM下分別高出 9.84%和 5.34%，IS下分別高出 5.57%和5.02%；MM/SS下，玉米土壤總氮含量隨施氮量的增加而增加，以CN最高，CN和RN比NN分別高17.15%和11.06%，大豆的則以RN最高，比CN和NN的分別高16.15%和18.98%。

2.1.2 植株吸氮量 種植模式對(duì)玉米、大豆地上部植株吸氮量影響顯著（表4），且年際間變化規(guī)律一致。與MM相比，IM的玉米植株吸氮量呈增加趨勢(shì)，但差異不顯著，3年平均提高2.10%。各施氮水平之間，MM下玉米植株吸氮量隨施氮量的增加而增加，IM下則以RN的最高，分別比NN和CN的高91.35%和9.88%。套作顯著降低了大豆植株吸氮量，IS的比SS的平均低 3.24%。各施氮水平間，單套作下大豆植株吸氮量均以RN的最高，SS下分別比NN和CN的高15.24%和14.97%，IS下分別比NN和CN的高26.24%和11.90%。

表3 不同種植模式與施氮量下玉米大豆土壤總氮含量Table 3 The soil total N content under different planting patterns and N fertilization rates (kg·hm–2)

表4 不同種植模式與施氮量下作物地上部植株吸氮量Table 4 Crops shoot N uptake under different planting patterns and N fertilization rates (kg·hm–2)

2.2 根際土壤細(xì)菌數(shù)量

玉米、大豆根際土壤細(xì)菌達(dá)到106數(shù)量級(jí)（表5），施氮增加了土壤中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量，對(duì)微生物生長(zhǎng)、活動(dòng)起到一定促進(jìn)作用。玉米根際土壤細(xì)菌數(shù)量隨生育期的推進(jìn)而降低，在大喇叭口期（V12）達(dá)到最大；種植模式顯著影響玉米細(xì)菌數(shù)量，玉米大豆共生前的大喇叭口期（V12）為MM＞IMS，共生后IMS的玉米根際土壤細(xì)菌數(shù)量較MM高2.6%。施氮有利于提高玉米根際土壤細(xì)菌數(shù)量，以RN的最高，R6期RN比NN和CN分別高9.6%和9.8%。與單作相比，套作能較顯著提高大豆根際土壤細(xì)菌數(shù)量，以V5期最高，該時(shí)期下IMS比SS提高12.9%。各施氮水平間，大豆細(xì)菌數(shù)量均以RN的最高，RN分別比NN和CN高11.7%和11.0%。

表5 不同種植模式與施氮量下玉米大豆根際土壤細(xì)菌數(shù)量Table 5 The soil bacteria number of rhizosphere under different planting patterns and N fertilization rates (×106cfu/g)

2.3 根際土壤氨氧化細(xì)菌amoA基因多樣性分析

2.3.1 文庫(kù)多樣性指數(shù) 由表6可知，克隆文庫(kù)庫(kù)容值C在88.2%—98%，能夠比較完整的反映土壤中氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。玉米土壤中的OTUs數(shù)量為MM＜IMS，多樣性指數(shù)H、D和均一度指數(shù)J均為MM＞IMS，減量施氮提高了玉米土壤中 amoA基因文庫(kù)的多樣性指數(shù)，單套作下各指標(biāo)均以RN的最高。大豆的OTUs數(shù)為SS＞IMS，SS下多樣性指數(shù)H比IMS的低17.2%，但D和J為SS＞IMS，分別比IMS的高93.6%和45.1%；IMS下大豆的多樣性指數(shù)H、D、J和SS的H、J指數(shù)均在RN下達(dá)到最高。

2.3.2 基因豐度 由圖2可知，種植模式對(duì)玉米根際土壤的 amoA基因豐度影響顯著，玉米大豆共生前（V12期）為MM＞IMS，平均高15.3%；玉米大豆共生后（R6期）則為IMS＞MM，平均高38.5%。施氮（圖3）顯著增加了玉米土壤中amoA的豐度，V12時(shí)，RN的高于CN；R6時(shí)，隨施氮量增加而增加，以CN的最高，但與RN差異不顯著。

表6 玉豆套作系統(tǒng)下amoA基因文庫(kù)多樣性指數(shù)分析（2015年）Table 6 Diversity indices of amoA gene clone libraries in maize/soybean relay strip intercropping system (2015)

圖2 不同種植模式下根際土中amoA型氨氧化細(xì)菌群落豐度Fig. 2 Abundances of amoA-type denitrifiers in rhizosphere soil under different planting patterns (107copies/μL)

圖3 不同施氮量下根際土中amoA型氨氧化細(xì)菌群落豐度Fig. 3 Abundances of amoA-type denitrifiers in rhizosphere under different N fertilization rates (107copies/μL)

大豆的 aomA基因豐度隨生育進(jìn)程的推進(jìn)而增加，與V5相比，R2期下SS、IMS的分別增加107.2%和64.8%；與SS相比，IMS促進(jìn)了amoA基因豐度增加，V5和R2期下，IMS的分別增加44.5%和14.9%。各施氮水平間，玉米大豆共生（V5期）時(shí)，大豆amoA基因豐度以RN的最高；玉米收獲后的R2期，amoA基因豐度則隨施氮量的增加而增加，施氮比不施氮的平均高108.9%。

2.4 根際土壤反硝化細(xì)菌nirS基因豐度多樣性分析

2.4.1 文庫(kù)多樣性 與 MM（SS）相比，IMS提高了玉米的OTUs數(shù)與多樣性指數(shù)H，但大豆的則相對(duì)降低（表7）。各種植模式下，施氮對(duì)玉米、大豆nirS基因的OTUs數(shù)量與多樣性指數(shù)的影響規(guī)律一致，RN提高了MM下玉米根際土壤nirS基因的OTUs數(shù)和多樣性指數(shù)，IMS下的OTUs數(shù)量和多樣性指數(shù)則呈降低趨勢(shì)；大豆在MM與IMS下均表現(xiàn)為RN的nirS基因文庫(kù)的多樣性指數(shù)低于CN。

2.4.2 基因豐度 玉米根際土壤反硝化基因（nirS）豐度在共生前后均表現(xiàn)為IMS＞MM，V12期，IMS的比MM的高25.0%；R6期，IMS的比MM的高84.8%；且隨生育時(shí)期的推進(jìn)而增加，MM與IMS下，R6期的比V12期的分別高21.2%和79.25%（圖4）。玉米大豆共生前后，各施氮處理間的nirS基因豐度隨施氮量的增加而增加，以CN最高；玉豆共生后的R6，RN的比NN和CN的分別低7.5%和30.7%（圖5）。各模式下大豆根際土壤nirS基因豐度隨生育時(shí)期的推進(jìn)而降低，與V5相比，R2期的nirS基因豐度降低了72.8%和65.7%。玉米大豆共生前后，施氮顯著提高了大豆根際土壤中反硝化細(xì)菌nirS基因豐度，以CN最高；玉豆共生后的R2期，RN的nirS基因豐度比NN和CN的分別降低13.7%和74.0%。

表7 玉豆套作系統(tǒng)下nirS基因文庫(kù)多樣性指數(shù)分析（2015年）Table 7 Diversity indices of nirS gene clone libraries in maize/soybean relay strip intercropping system (2015)

圖4 不同種植模式下根際土中nirS型反硝化細(xì)菌群落豐度Fig. 4 Abundances of nirS-type denitrifiers in rhizosphere under different planting patterns (108copies/μL)

2.5 植株吸氮量、土壤含氮量與基因多樣性指數(shù)的相關(guān)性分析

圖5 不同施氮量下根際土中nirS型反硝化細(xì)菌群落豐度Fig. 5 Abundances of nirS -type denitrifiers in rhizosphere under different N fertilization rates (108copies/μL)

對(duì)玉米、大豆土壤總氮含量、植株吸氮量與根際土壤細(xì)菌多樣性指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果表明（表8），玉米土壤總氮含量、植株吸氮量與amoA和nirS基因的物種豐度呈正相關(guān)，玉米土壤amoA基因多樣性參數(shù)H、D、J與土壤總氮含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與植株吸氮量為正相關(guān)，二者均達(dá)到顯著水平。玉米土壤nirS基因的H、D、J與土壤總氮含量、植株吸氮量正相關(guān)，其中與土壤氮含量達(dá)到顯著或極顯著水平。

大豆土壤中總氮含量、植株吸氮量與amoA、nirS基因物種豐度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。大豆的amoA基因的H、D、J與土壤氮含量、植株吸氮量為顯著或極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。nirS基因的H、D、J指標(biāo)與土壤氮含量為顯著或極顯著正相關(guān)，與植株吸氮量相關(guān)不顯著。

表8 土壤氮含量、植株地上部吸氮量和aomA和nirS基因相關(guān)性Table 8 Correlation coefficients between soil total N content, shoot N uptake and aomA, nirS gene

3 討論

3.1 不同種植模式和施氮水平對(duì)根際土壤細(xì)菌數(shù)量的影響

土壤微生物是土壤肥力的重要參考依據(jù)，其數(shù)量、豐度與作物生長(zhǎng)和土壤養(yǎng)分循環(huán)有緊密聯(lián)系，但其影響因素眾多。雍太文等[4]研究表明，套作和大豆茬口效應(yīng)提高了土壤中微生物數(shù)量。孟慶英等[11]發(fā)現(xiàn)，施用控釋肥可以增加土壤中微生物數(shù)量；張向前等[5]的研究表明無(wú)論施肥與否，間作可以顯著增加土壤中細(xì)菌、真菌、放線(xiàn)菌數(shù)量。本研究中，套作與施氮提高了玉米、大豆微生物數(shù)量。與MM（SS）相比，IMS土壤中細(xì)菌在各施氮水平下有增加，總體為 IMS＞MM（SS），施氮＞不施氮。玉米、大豆土壤中各微生物在共生期受套作影響較大。其中，玉米與大豆共生前根際土壤中的細(xì)菌數(shù)量為MM（SS）＞IMS，共生后為MM（SS）＜IMS；大豆在共生期土壤中細(xì)菌呈降低趨勢(shì)，到成熟期解除共生關(guān)系后有所增加。分析其原因一是玉米、大豆自身各時(shí)期根系分布和分泌物不同[35]，在單套作和施氮水平下受到土壤硝化-反硝化作用影響程度不同；二是套作下作物根系的交互作用[36]。套作能促進(jìn)作物根系生長(zhǎng)和活力，增強(qiáng)對(duì)土壤中養(yǎng)分和水分的吸收[4]，刺激根系分泌物增加[4]，調(diào)節(jié)微生物生長(zhǎng)環(huán)境，從而提高IMS下玉米細(xì)菌和大豆細(xì)菌數(shù)量；另外，施氮增加了土壤中氮營(yíng)養(yǎng)，滿(mǎn)足微生物生長(zhǎng)所需要的氮源，促進(jìn)微生物數(shù)量增加，并增強(qiáng)土壤有機(jī)氮向無(wú)機(jī)氮的轉(zhuǎn)化，加劇玉米、大豆共生期間的養(yǎng)分競(jìng)爭(zhēng)，降低土壤氮濃度，促進(jìn)大豆根瘤固氮。

3.2 氨氧化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌對(duì)套作系統(tǒng)氮高效利用的調(diào)控機(jī)理

土壤中的氮需要轉(zhuǎn)化成無(wú)機(jī)態(tài)氮才能為作物所吸收，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的定位研究，前期結(jié)果發(fā)現(xiàn)[24]，減量施氮能夠提高套作體系玉米、大豆土壤的硝化作用，降低氨化作用強(qiáng)度，保證作物對(duì) NO3--N離子的吸收，減輕 NH4+-N揮發(fā)，還能提高玉米、大豆土壤的固氮作用強(qiáng)度，并指出土壤中氮素轉(zhuǎn)化受土壤微生物的調(diào)控。本研究中通過(guò)施氮量和套作來(lái)影響玉米、大豆土壤中參與土壤氮轉(zhuǎn)化的氨氧化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌的多樣性因子來(lái)調(diào)節(jié)各個(gè)作物土壤氮素轉(zhuǎn)化過(guò)程，即協(xié)調(diào)土壤氮素轉(zhuǎn)化相關(guān)細(xì)菌的關(guān)鍵基因表達(dá)，使土壤氮素轉(zhuǎn)化向更有利于作物氮素吸收的方向進(jìn)行。

氨氧化細(xì)菌作為硝化作用的起始步驟，經(jīng)氨單加氧酶催化將氨氧化成羥胺使土壤中NH4+和NO3-的相對(duì)含量發(fā)生改變，影響土壤中氮素含量和作物氮素吸收[14]，玉米在硝化作用起始階段始終占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位[37]。研究中套作和減量施氮對(duì)玉米、大豆作物根際土壤中 amoA基因多樣性具有促進(jìn)作用，玉米大豆共生后文庫(kù)多樣性和基因豐度均顯著提高，IMS＞MM（SS），施氮＞不施氮，以RN下達(dá)到最高，這與前人研究[38]結(jié)果相似。減量施氮通過(guò)提高玉米、大豆土壤中AOB細(xì)菌多樣性的增加，增強(qiáng)硝化作用強(qiáng)度，調(diào)節(jié)土壤中無(wú)機(jī)態(tài)氮相對(duì)含量，使植株吸氮量得到增加，從而促進(jìn)作物氮素的吸收；但是由于大豆受套作系統(tǒng)內(nèi)部玉米對(duì)氮素競(jìng)爭(zhēng)的影響，導(dǎo)致大豆植株吸氮量出現(xiàn)降低。

套作和增加施氮能提高玉米、大豆土壤中反硝化細(xì)菌多樣性，促進(jìn)土壤中反硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)，增強(qiáng)土壤反硝化作用強(qiáng)度[39]。本研究中減量施氮提高了單作玉米 nirS基因多樣性指數(shù)，降低了大豆和套作玉米nirS基因的多樣性指數(shù)；基因豐度均以套作的較高，且R6期玉米的nirS基因豐度增長(zhǎng)速度比單作的快；套作大豆在共生階段V5期的nirS基因豐度降低，但在R2期則為IS＞SS。推測(cè)其原因可能是套作系統(tǒng)中土壤中硝酸鹽、亞硝酸鹽含量增加，刺激、促進(jìn)了反硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)，使土壤中nirS基因拷貝數(shù)較單作增加。此外，玉米大豆共生時(shí)，作物間的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系、生態(tài)位差異[27]及根系分泌物主導(dǎo)的選擇性壓力調(diào)節(jié)等也對(duì)nirS基因豐度產(chǎn)生調(diào)控作用；玉米、大豆共生前，玉米根際土壤nirS基因豐度隨施氮量的增加而增加，共生后，減量施氮進(jìn)一步調(diào)節(jié)玉米、大豆根際土壤中反硝化細(xì)菌生長(zhǎng)環(huán)境，降低基因豐度，成熟期以減量施氮處理下基因豐度達(dá)到最低。玉米大豆套作系統(tǒng)土壤中反硝化細(xì)菌多樣性變化對(duì)土壤氮素的影響表現(xiàn)為，一方面亞硝酸還原酶將硝酸鹽降解為NO和NH3，會(huì)造成土壤氮素?fù)p失，這與前期研究發(fā)現(xiàn)施氮增加土壤中反硝化作用強(qiáng)度，提高土壤氮損失規(guī)律一致[24]。另一方面，土壤中亞硝態(tài)氮的積累減少可以減輕對(duì)植物體的自身毒害，降低土壤因高濃度氮對(duì)大豆根瘤固氮的遏制作用，并有利于大豆固氮向玉米轉(zhuǎn)移，促進(jìn)玉米植株吸氮量的增加。

4 結(jié)論

種植模式和施氮水平對(duì)玉米/大豆套作系統(tǒng)下作物氮素吸收及根際土壤氮素轉(zhuǎn)化細(xì)菌多樣性影響顯著。套作相對(duì)單作提高了玉米植株吸氮量和玉米土壤總氮含量，降低了大豆植株吸氮量和大豆土壤總氮含量；套作體系上的玉米和大豆根際土壤細(xì)菌數(shù)量顯著增加，并提高了玉米根際土壤中氨氧化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌的多樣性指數(shù)和基因豐度，降低大豆根際土壤中反硝化細(xì)菌物種多樣性。與常量施氮相比，減量施氮有利于提高玉米、大豆植株和土壤總氮含量，增強(qiáng)玉米、大豆共生期間的土壤硝化作用，減弱土壤反硝化作用，促進(jìn)玉米-大豆套作系統(tǒng)下作物對(duì)氮素的吸收利用，減少土壤氮素?fù)p失。

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（責(zé)任編輯 楊鑫浩）

Effects of Reduced N Fertilization on Crop N Uptake, Soil Ammonia Oxidation and Denitrification Bacteria Diversity in Maize/Soybean Relay Strip Intercropping System

ZHOU Li, FU ZhiDan, DU Qing, CHEN Ping, YANG WenYu, YONG TaiWen
(College of Agronomy, Sichuan Agricultural University/Key Laboratory of Crop Physiology, Ecology and Cultivation in Southwest China, Ministry of Agriculture/Sichuan Engineering Research Center for Crop Strip Intercropping System, Chengdu 611130)

【Objective】The aim of this study is to reveal the variation characteristics of soil bacteria quantity and community in crop rhizosphere, and the relationship among bacteria quantity and community, soil total N content, crops N uptake in maize/soybean relay strip intercropping system, which will provide theoretical and technology support to reduce fertilizer input and efficient production in cereal/legumes intercropping system.【Method】Field experiments were conducted with two factors split-plot designed from 2013 to 2015, the main factor was planting patterns which included monoculture maize (MM), solo soybean (SS) and maize/soybean relay strip intercropping system (IMS), and the sub-factor total N for maize and soybean were no nitrogen 0 (NN),reduced nitrogen 180 kg N·hm-2(RN), conventional nitrogen 240 kg N·hm-2(CN), respectively. At V12, VT, R6 stages of maize and V5, R2, R5, R8 stages of soybean, the rhizosphere bacteria quantity was investigated by dilution-plate method, non-rhizosphere soil and crops shoot total N contents were determined by Kjeldahl method, and the diversity and gene abundance of ammonia oxdizing bacteria (amoA) and denitrifying bacteria (nirS) under different N fertilization rates were measured by combining clone library with FQ-PCR. 【Result】 The bacteria quantity in the rhizosphere of intercropped maize (IM) was 2.6% higher, and that of intercropped soybean (IS) was 12.9% higher compared with the corresponding monoculture. The total soil and shoot N contents of intercropped maize were increased by 13.39% and 2.10%, and that of intercropped soybean were decreased by 5.81% and 3.24% in contrast with corresponding monoculture, respectively. The gene abundance of ammonia oxdizing bacteria (amoA) of intercropped maize and soybean was 38.5% and 64.8% higher, and the gene abundance of denitrifying bacteria (nirS) of intercropped maize and soybean was 57.77% and 126.39% higher in contrast with corresponding monoculture, respectively. Under different N fertilization rates, the bacteria quantity in the rhizosphere of maize was 9.6% and 9.8% higher, and that of soybean was 11.7% and 11.0% greater in RN compared NN with CN, respectively. In addition, reduced N fertilization increased the diversity index of amoA gene in the rhizosphere of maize and soybean, and increased the diversity index of nirS of monoculture maize, moreover, reduced N fertilization decreased the diversity index of nirS of intercropped maize and soybean. 【Conclusion】 Reduced N fertilization contributed to increase bacteria quantity in the rhizosphere under maize/soybean relay strip intercropping system, improved the progress of soil N transfer, promoted the N uptake of maize and soybean thereby achieved saving fertilizer.

maize-soybean relay strip intercropping system; reduced N; bacterial diversity; N uptake

2016-09-08；接受日期：2016-11-29

國(guó)家自然科學(xué)基金（31271669，31671625）、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD0300202）

聯(lián)系方式：周麗，E-mail：1904897216@qq.com。通信作者雍太文，E-mail：scndytw@qq.com。通信作者楊文鈺，E-mail：mssiyangwy@sicau.edu.cn