宗緒巖，王祥余，2*，刁沖

（1.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000；2.諾維信（中國(guó)）投資有限公司，北京100085）

芝麻香型丟糟酒實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)模型的建立

宗緒巖1，王祥余1，2*，刁沖1

（1.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000；2.諾維信（中國(guó)）投資有限公司，北京100085）

該研究針對(duì)目前芝麻香型丟糟酒的生產(chǎn)過(guò)程設(shè)計(jì)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室模型并通過(guò)工廠實(shí)驗(yàn)予以佐證。采用高效液相色譜和改進(jìn)Megazymes法檢測(cè)樣品中的殘淀粉、含酒量等關(guān)鍵指標(biāo)，并通過(guò)多重比較法評(píng)價(jià)模型的合理性和穩(wěn)定性。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)室模型-1能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)丟糟酒成熟酒醅的含酒量和殘淀粉，為設(shè)計(jì)和優(yōu)化針對(duì)芝麻香型丟糟酒的特種生物制劑提供快捷有效的預(yù)測(cè)手段；同時(shí)實(shí)驗(yàn)室模型-2也揭示了物料的均勻混合和酵母的活力對(duì)殘葡萄糖、淀粉利用率和出酒率的顯著影響。

丟糟；模型；芝麻香型白酒；多重比較法

丟糟是我國(guó)傳統(tǒng)白酒固態(tài)釀造過(guò)程中的必然產(chǎn)物，不但產(chǎn)量巨大，而且成分復(fù)雜。復(fù)雜的物質(zhì)組成及反復(fù)蒸煮和長(zhǎng)時(shí)間的固態(tài)發(fā)酵使得丟糟的處理和合理回收利用非常困難[1-3]。芝麻香型白酒作為我國(guó)建國(guó)后發(fā)展起來(lái)的新型白酒，其結(jié)合了濃香型、清香型和醬香型三大香型的生產(chǎn)工藝，也將這三大香型白酒的風(fēng)味特征有機(jī)的融合起來(lái)，近年來(lái)深得消費(fèi)者的喜愛(ài)，產(chǎn)量也迅速得到擴(kuò)大[4-5]。與此同時(shí)，芝麻香型白酒也因其獨(dú)特的釀造工藝造成了其丟糟中淀粉含量較高（10%～12%），含水量較低。由于傳統(tǒng)的處理方式不能充分利用芝麻香型丟糟中存在的豐富香味物質(zhì)和殘余淀粉，利用芝麻香型白酒丟糟生產(chǎn)芝麻香型白酒丟糟酒成為了生產(chǎn)企業(yè)一種較為普遍的選擇[3，6]。然而正常發(fā)酵中使用的發(fā)酵劑（傳統(tǒng)大曲、麩曲等）因?yàn)槊赶档娜毕菁懊富畹牟蛔阋呀?jīng)無(wú)法更多的產(chǎn)生丟糟酒，尋找合適的酶替代或加強(qiáng)淀粉分解利用率十分重要[3]。目前在白酒生產(chǎn)過(guò)程中利用單酶[7-9]、復(fù)合酶[10-11]和酵母[12]、細(xì)菌[13]作為發(fā)酵劑的研究已經(jīng)有很多，但受限于白酒企業(yè)復(fù)雜的發(fā)酵工藝和工廠現(xiàn)場(chǎng)條件而無(wú)法大規(guī)模、高效的進(jìn)行酶、微生物的篩選和測(cè)試，并準(zhǔn)確的獲得相關(guān)數(shù)據(jù)以供生產(chǎn)使用。

芝麻香型丟糟酒實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)模型的建立參考了濃香型白酒模型建立中的經(jīng)驗(yàn)[14]，以JMP軟件中的多重比較法（TukeyHSD）分析檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室模型相對(duì)于生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)的可靠性，建立芝麻香型丟糟酒實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)模型，為尋找適合分解利用該香型丟糟殘淀粉的新酶分子提供快捷方便的實(shí)驗(yàn)室篩選手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丟糟：山東地區(qū)某著名酒廠丟糟，丟糟前期發(fā)酵工藝傳統(tǒng)芝麻香發(fā)酵工藝，使用窖池為磚壘花洞塞泥窖；酵母：安琪高活性酵母；酶制劑：本土固體糖化酶（酒廠提供）。

酒石酸鉀鈉（分析純）：阿拉丁試劑公司；五水硫酸銅（分析純）、NaOH（分析純）：美國(guó)默克公司；葡萄糖、麥芽糖、果糖、乙酸、乳酸、甘油、琥珀酸、三糖、四糖、五糖、多糖、淀粉分解糊精、雙乙酰、甲醇、乙醇、NaOH等（均為色譜純）：美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME3002天平及萬(wàn)分之一天平：梅特勒-托利多公司；Waters 1515高效液相色譜（配備Waters 2414 Refractive Index Detector，Waters 2707 Autosampler和Bio-Rad生產(chǎn)AminexRHPX-87H Column 300 mm×7.8 mm色譜柱）：美國(guó)Waters公司；Milli-Q純水機(jī)：美國(guó)Merck公司；SPEXRSample Prep 1600樣品制備儀：美國(guó)SPEX公司；水浴鍋：丹麥Heto公司；烘箱：德國(guó)BINDER公司；其余玻璃器皿均購(gòu)自德國(guó)DURAN公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)室丟糟酒發(fā)酵

實(shí)驗(yàn)室模型-1：使用1 L的發(fā)酵瓶，每個(gè)發(fā)酵瓶中加入從工廠取回的已經(jīng)配制好的入窖丟糟酒醅約600 g（丟糟酒醅具體配制為600 g新鮮丟糟，0.12 g安琪高活性酵母（提前用5mL的32℃溫水活化），酶制劑0.24g（劑量為糖化酶酶活17CU/g丟糟酒醅）），做5個(gè)平行樣；封口前用75%vol酒精將發(fā)酵瓶口部及酒糟沒(méi)有接觸到的發(fā)酵瓶上部消毒，然后用保鮮膜封口置于環(huán)境溫度為22℃的培養(yǎng)箱中避光發(fā)酵30d。

實(shí)驗(yàn)室模型-2：使用1 L的發(fā)酵瓶，操作方法類似于實(shí)驗(yàn)室模型-1，只是使用的是工廠取回的新鮮丟糟酒醅600g，將其與0.12g安琪高活性酵母混合（使用前用帶有丟糟和所需糖化酶的32℃溫水5 mL活化15 min），酶制劑0.24 g（劑量為糖化酶酶活17 CU/g丟糟酒醅，充分溶解于活化酵母種子液中），于實(shí)驗(yàn)室中充分混勻。

1.3.2 酒廠芝麻香型丟糟酒發(fā)酵

在正常生產(chǎn)芝麻香型白酒的成熟酒醅完成蒸酒后，待酒醅溫度降低至35℃以下時(shí)按照0.4 kg/t劑量加入酶制劑和0.2 kg/t安琪高活性酵母（提前活化），并用鐵鍬混勻，入磚壘花洞塞泥窖密封發(fā)酵30 d。

1.3.3 殘淀粉含量檢測(cè)

殘淀粉含量的檢測(cè)方法為酶法，方法及原理與Megazyme試劑盒一致，利用諾維信復(fù)合淀粉酶和糖化酶代替Megazyme所用酶制劑以取得更穩(wěn)定的檢測(cè)結(jié)果。具體操作參照參考文獻(xiàn)[14]。

1.3.4 成熟酒醅成分分析

成熟酒醅的成分檢測(cè)使用Waters 1515高效液相色譜，柱溫為65℃，流動(dòng)相為5 mmol/L H2SO4，流速0.6 mL/min，分析時(shí)間為30 min。

1.3.5 多重比較分析[15]

通過(guò)分析所有不同處理方式得到的結(jié)果相互之間的差異及特定處理方式得到的結(jié)果與總體結(jié)果的差異得出特定處理方式對(duì)結(jié)果的影響大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵成熟酒醅殘淀粉分析

成熟酒醅的殘淀粉含量如圖1所示。由圖1可知，酒廠、實(shí)驗(yàn)室模型-1和實(shí)驗(yàn)室模型-2的平均出窖酒醅殘淀粉含量分別為4.83%、4.92%和4.29%，標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.07%、0.08%和0.04%，表明在酒廠條件下和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?1條件下淀粉的分解利用效率明顯低于實(shí)驗(yàn)室模型-2；結(jié)合考察三種處理方式的差異，可以得出酵母的活化即活酵母的接入量、活性和物料混合的均勻度對(duì)芝麻香型丟糟中的殘淀粉的分解和利用有著顯著的影響，其中物料混合方面的結(jié)論與信春暉等[16]關(guān)于大曲粉碎度方面的研究結(jié)果相吻合，在殘淀粉含量上與周瑞平等[17]的結(jié)論進(jìn)行對(duì)照可確認(rèn)混合度的高低可以影響最終殘淀粉的含量；在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头矫妫瑢?shí)驗(yàn)室模型-1在殘淀粉表現(xiàn)方面更接近于酒廠現(xiàn)場(chǎng)狀態(tài)，但是從原料利用效率考慮，實(shí)驗(yàn)室模型-2的生產(chǎn)方式更加適合于酒廠采用，有利于原料的充分利用。

圖1 成熟酒醅的殘淀粉含量Fig.1 Residual starch contents of mature fermented grains

2.2 發(fā)酵成熟酒醅含酒量分析

圖2 成熟酒醅的含酒量Fig.2 Alcohol contents of mature fermented grains

成熟酒醅的含酒量如圖2所示。由圖2可知，酒廠、實(shí)驗(yàn)室模型-1和實(shí)驗(yàn)室模型-2的平均出窖酒醅含酒量分別為0.77%、0.82%和1.98%，標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.04%、0.05%和0.01%，結(jié)合圖1分析可知，在酒廠條件下和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?1條件下淀粉的分解利用效率明顯低于實(shí)驗(yàn)室模型-2，從而導(dǎo)致了淀粉轉(zhuǎn)化為酒精的效率大幅降低；圖1和圖2的結(jié)果證明酵母的活化即活酵母的接入量、活性和物料混合的均勻度對(duì)芝麻香型丟糟中的殘淀粉的利用和出酒率有著顯著的影響；實(shí)驗(yàn)室模型-1在出酒率表現(xiàn)方面更接近于酒廠現(xiàn)場(chǎng)狀態(tài)，但是從原料利用效率考慮，實(shí)驗(yàn)室模型-2的生產(chǎn)方式更加適合于酒廠采用，有利于原料的充分利用。

2.3 發(fā)酵成熟酒醅殘葡萄糖分析

成熟酒醅的殘葡萄糖含量如圖3所示。由圖3可知，酒廠、實(shí)驗(yàn)室模型-1和實(shí)驗(yàn)室模型-2的平均出窖酒醅殘葡萄糖的含量分別為2.56%、2.43%和0.26%，標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.30%、0.30%和0.02%，結(jié)合圖1和圖2分析可知，在酒廠條件下和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?1條件下產(chǎn)酒率較實(shí)驗(yàn)室模型-2明顯低的另一個(gè)原因則是淀粉分解得到的葡萄糖未能被酵母等可代謝產(chǎn)生酒精的微生物利用，證明在發(fā)酵過(guò)程中有發(fā)酵能力的微生物（有活性的釀酒酵母）嚴(yán)重的不足是限制酒廠條件下和實(shí)驗(yàn)室條件下產(chǎn)酒率提高的限制性因素，高效的活化酵母工藝和物料攪拌均勻是酒廠提高丟糟酒產(chǎn)率的一個(gè)可行措施，這一點(diǎn)通過(guò)研究對(duì)比周瑞平等[17]多糧兼香白酒研究中的殘葡萄糖也可以確定；在成熟酒醅殘還原糖這個(gè)指標(biāo)上，實(shí)驗(yàn)室模型-1同樣較實(shí)驗(yàn)室模型-2更能表現(xiàn)出酒廠的現(xiàn)實(shí)狀況。

圖3 成熟酒醅的殘葡萄糖含量Fig.3 Residual glucose contents of mature fermented grains

2.4 發(fā)酵成熟酒醅乳酸積累量的分析

成熟酒醅的乳酸積累量如圖4所示。由圖4可知，酒廠、實(shí)驗(yàn)室模型-1和實(shí)驗(yàn)室模型-2的平均出窖酒醅乳酸積累量分別為3.95%、3.72%和3.34%，標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.14%、0.07%和0.07%，結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)室條件下乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中的活動(dòng)強(qiáng)度明顯低于酒廠條件下，其原因是實(shí)驗(yàn)室條件下發(fā)酵容器中的乳酸菌含量較低，針對(duì)實(shí)驗(yàn)室模型-2還有另一個(gè)原因則是相對(duì)較好的混勻效果及較多的活性酵母使得發(fā)酵過(guò)程中酒精含量上升較快，限制了乳酸菌活動(dòng)的時(shí)間長(zhǎng)度；在成熟酒醅乳酸積累這個(gè)指標(biāo)上，實(shí)驗(yàn)室模型-1和實(shí)驗(yàn)室模型-2的乳酸積累量與酒廠條件下的乳酸積累量都有著明顯不同，但實(shí)驗(yàn)室模型-1的表現(xiàn)更加接近于酒廠條件，改善模型的方法是向發(fā)酵模型中接種合理數(shù)量的乳酸菌。

圖4 成熟酒醅的乳酸積累量Fig.4 Lactic acid accumulation of mature fermented grains

2.5 發(fā)酵成熟酒醅醋酸積累量的分析

成熟酒醅的醋酸積累量如圖5所示。由圖5可知，酒廠、實(shí)驗(yàn)室模型-1和實(shí)驗(yàn)室模型-2的平均出窖酒醅醋酸的含量分別為0.47%、0.41%和0.39%，標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.08%、0.05%和0.04%，結(jié)果表明，在酒廠、實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?1和實(shí)驗(yàn)室模型-2條件下醋酸的積累情況類似于乳酸，其形成原因也與乳酸類似，積累量相互之間不存在明顯差異，但是實(shí)驗(yàn)室模型-1的表現(xiàn)較實(shí)驗(yàn)室模型-2的表現(xiàn)更加接近于酒廠條件。

圖5 成熟酒醅的醋酸積累量Fig.5 Acetic acid accumulation of mature fermented grains

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果的討論表明，利用實(shí)驗(yàn)室條件模擬芝麻香型丟糟酒的生產(chǎn)過(guò)程是可行的，可以利用這一模型預(yù)測(cè)不同處理?xiàng)l件下丟糟酒成熟酒醅的殘淀粉含量、含酒量、葡萄糖、乳酸和醋酸等關(guān)鍵指標(biāo)，為優(yōu)化丟糟酒的生產(chǎn)條件，特別是研究針對(duì)芝麻香型丟糟酒的特種復(fù)合生物制劑提供快捷有效的預(yù)測(cè)手段。同時(shí)在建立模型的過(guò)程中所觀察到的酵母活化效果優(yōu)劣和物料均勻度的差異對(duì)出酒率、殘淀粉、葡萄糖的影響也表明酵母活化效果及物料的攪拌均勻度是工廠的短板，這將明顯的影響丟糟發(fā)酵潛力的充分發(fā)揮。但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明該模型由于在微生物環(huán)境方面的存在不足，導(dǎo)致有機(jī)酸積累量與實(shí)際工廠有所差距，需要進(jìn)一步研究乳酸菌和醋酸菌的接種量的問(wèn)題，才可以進(jìn)一步完善該模型，為未來(lái)研究不同發(fā)酵劑對(duì)酒體風(fēng)味的影響提供參考。

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Establishment of experimental production model for sesame-flavorBaijiumade by distiller's grains

ZONG Xuyan1,WANG Xiangyu1,2*,DIAO Chong1
(1.College of Bioengineering,Sichuan University of Science&Engineering,Zigong 643000,China; 2.Novozymes(China)Investment Co.,Ltd.,Beijing 100085,China)

The experimental model based on the process of sesame-flavorBaijiumade by distiller's grains was established and verified by industrial scale experiments.The starch content,alcohol content and other important indexes in distiller's grains were determined by HPLC and improved megazyme method.Then Tukey HSD was used to test the reasonability and stability of experimental model.Results showed that the experimental model 1 can exactly forecast the starch and alcohol content in mature distiller's grains,which will provide an effective forecast tool in designing and optimizing complex biological agents focus on sesame-flavorBaijiuby distiller's grains.At the same time,experimental model 2 also indicated that the uniform mixing of materials and the yeast activity had significant effect on residual glucose,starch utilization ratio and liquor yield.

distiller's grains;model;sesame-flavorBaijiu;tukey HSD

TS261

0254-5071（2017）03-0071-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.015

2016-10-16

固態(tài)釀造關(guān)鍵技術(shù)研究四川省院士（專家）工作站開(kāi)放基金項(xiàng)目（No.GY2014-01）；釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目（NO.NJ2014-07）；瀘州老窖科研獎(jiǎng)學(xué)金項(xiàng)目（No.13ljzk6）資助

宗緒巖（1976-），男，副教授，博士，主要從事食品生物化學(xué)、酶學(xué)應(yīng)用及發(fā)酵過(guò)程控制的研究工作。

*通訊作者：王祥余（1985-），男，工程師，碩士，主要從事酶學(xué)應(yīng)用、微生態(tài)研究和發(fā)酵過(guò)程控制工作。