涂 艷 熊莉娜柳湘潔 雷 超 李凝旭 張瑞蕓

（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬梨園醫(yī)院，湖北 武漢 430077）

·實驗報告·

淫羊藿苷對成骨細胞成骨分化的影響及Wnt/-catenin信號系統(tǒng)的關(guān)系研究*

涂 艷 熊莉娜△柳湘潔 雷 超 李凝旭 張瑞蕓

（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬梨園醫(yī)院，湖北 武漢 430077）

目的探討淫羊藿苷對成骨細胞分化及其細胞內(nèi)Wnt/-catenin信號通路的影響。方法取SD大鼠，采用全骨髓貼壁法分離并體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞（rBMSC），并用貼壁篩選法進行體外培養(yǎng)rBMSC，給予淫羊藿苷3、6、9 d后，觀察對照組與淫羊藿苷處理組的堿性磷酸酶 （ALP）活性，對堿性磷酸酶陽性克?。–FUALP-F）以及礦化結(jié)節(jié)形成的影響。采用Western blot方法檢測每組-catenin和Runx2組蛋白表達水，采用RT-PCR方法檢測淫羊藿苷對Wnt10b、GSK-3、-catenin及LEF1 mRNA水平的影響。結(jié)果淫羊藿苷可以提高ALP的活性，堿性磷酸酶克隆數(shù)和礦化結(jié)節(jié)的形成。Western blot結(jié)果顯示，淫羊藿苷可以提高-catenin和Runx2的蛋白表達水平；RT-PCR結(jié)果顯示，淫羊藿苷可以提高Wnt10b、GSK-3、-catenin及LEF1表達水平。結(jié)論初步證明淫羊藿苷可以激活Wnt/-catenin信號通路，參與并調(diào)控BMSC的成骨分化。

淫羊藿苷 成骨細胞 成骨分化 Wnt/-catenin信號通路

成骨細胞（PB）來源于中胚層內(nèi)外骨膜、骨髓基質(zhì)的間充質(zhì)干細胞（MSCs），MSCs有著多向分化潛能，并在體內(nèi)復雜的調(diào)控因素的作用下可以分化成骨祖細胞，從而形成前成骨細胞（preosteoblast），MSCs的成骨分化是骨形成的重要過程［1］。多項研究表明，Wnt/-catenin信號通路在成骨細胞分化及骨的形成過程中具有重要的作用［2-4］。淫羊藿苷是從中藥淫羊藿內(nèi)提取出的單體，對抗骨質(zhì)疏松具有顯著的效果，可以抑制前體破骨細胞的增殖，進而減少破骨細胞的形成［5］。并且研究表明，淫羊藿苷在治療骨質(zhì)疏松的過程中有著顯著的效果［6-7］。為探究淫羊藿苷對成骨細胞成骨分化，以及對Wnt/-catenin信號通路調(diào)控的關(guān)系，本實驗取大鼠rBMSC為研究對象，對上述機制進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SD大鼠5只，體質(zhì)量200~250 g，購自中國醫(yī)科大學實驗動物中心。DMEM/F12培養(yǎng)液（Thermo Scientific Hyclone公司）；胎牛血清（FBS，Gibco公司）；青鏈霉素、25%Trypsin-EDTA（上海北諾生物科技有限公司）；淫羊藿苷、甘油磷酸鈉、地塞米松、抗壞血酸、MTT試劑、DMSO、茜紅素（上海源葉生物科技有限公司）；總RNA提取試劑盒、堿性磷酸酶測定試劑、SYBR Green熒光定量預混試劑 （浙江愛康生物科技有限公司）；引物、-catenin、Runx-2單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗（北京奧科鼎盛生物科技有限公司）。

1.2 rBMSCs的分離培養(yǎng) 用頸椎脫臼法處死大鼠，浸泡于75%乙醇中20 min，在無菌條件下分離股骨和脛骨，用注射器抽取適量DMEM/F12沖洗骨髓腔。用微量移液器吹打收集的沖洗液后靜置10 min。將上清液在1000 r/min離心5 min后棄去上清液，用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基使細胞重懸，吹打數(shù)次后計數(shù)，以106個/cm2的密度接種在6孔板中，并在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。3 d后開始更換培養(yǎng)液，每天觀察細胞情況，當90%貼壁細胞融合時，用胰酶消化傳代培養(yǎng)。當細胞傳代至第3代時開始實驗，96孔板、24孔板、6孔板接種密度分別為2×104、2×106、4× 106細胞/孔。

1.3 ALP活性檢測 取96孔板，接種并培養(yǎng)細胞24 h，然后將細胞進行成骨性誘導。并給予藥物處理，淫羊藿苷濃度為分別為0.6、1.2、5、8、10、20 mol/L。對照組和處理組的培養(yǎng)液中均含有0.1%的DMSO。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3、6、9 d，每3日更換1次培養(yǎng)液，PBS沖洗2次，將基質(zhì)液和緩沖液各50 L加入每孔中，置于37℃溫水中15 min。再加入150 L的顯影液，在520 nm波長下檢測吸光度（OD）。結(jié)果用每孔15 min內(nèi)產(chǎn)生酚的量表示。

1.4 CFUALP-F分析 取12孔板，接種并培養(yǎng)細胞24h，然后將細胞進行成骨性誘導。處理組加入10 mol/L的淫羊藿苷，對照組給予空白誘導培養(yǎng)液，對照組和處理組的培養(yǎng)液中均含有0.1%的DMSO。7 d后進行ALP組織化學染色，用PBS漂洗2次后加入基質(zhì)液，靜置30 min后再用PBS漂洗，固定。然后用IPP6.0軟件進行CFUALP-F灰度值、數(shù)量和面積的測定。

1.5 礦化結(jié)節(jié)的形成 取24孔板，接種并培養(yǎng)細胞24h，然后將細胞進行成骨性誘導。處理組加入10 mol/L的淫羊藿苷，對照組給予空白誘導培養(yǎng)液，對照組和處理組的培養(yǎng)液中均含有0.1%的DMSO。12 d后棄去培養(yǎng)液，用PBS漂洗2次后加入基茜紅素，并置于37℃環(huán)境中1 h，然后用IPP6.0軟件進行礦化結(jié)節(jié)灰度值、數(shù)量和面積的測定。

1.6 RT-CPR檢測 取6孔板，接種并培養(yǎng)細胞24 h，然后將細胞進行成骨性誘導。處理組給予淫羊藿苷10 mol/L，對照組給予空白誘導培養(yǎng)液。分別在8、24、48 h候提取總RNA，檢測純度及濃度，并調(diào)整RNA的濃度至1 g，再取1L逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。加入引物和SYBR Green試劑，用兩步法對cDNA擴增。并記錄CT（cycle threshold）值，ΔΔCT=（CT目的基因-CT內(nèi)參基因）處理組-（CT目的基因-CT內(nèi)參基因）對照組，計算各組2-ΔΔCT，結(jié)果即為目的基因處理組mRNA表達和對照組mRNA的倍數(shù)。

1.7 Western blot檢測 取6孔板，接種并培養(yǎng)細胞24 h，然后將細胞進行成骨性誘導。處理組分別給予淫羊藿苷5、10、20 mol/L，對照組給予空白誘導培養(yǎng)液。3 d后，提取細胞總蛋白。BCA法檢測蛋白的濃度，加入含溴酚藍上樣緩沖液，95℃水浴5 min。在SDSPAGE凝膠進行電泳，然后將蛋白移至PVDF膜上，PVDF膜置于含5%脫脂奶粉的TBST中，并在室溫下?lián)u床封閉2h，再加入-catenin、Runx2、-actin的一抗，在4℃環(huán)境下放置過夜。第2日，用TBST漂洗PVDF膜3次，每次10 min。用含標記辣根過氧化物的二抗，在室溫下?lián)u晃2 h。漂洗3次后，PVDF膜上涂抹發(fā)光液，并置于暗室內(nèi)曝光。晾干后，用IPP6.0軟件測定灰度值。

1.8 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0軟件。計量資料以（s）表示，組間差異分析比較采用方差分析，檢驗水平＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度的淫羊藿苷對ALP活性的影響 見圖1。如圖1所示，rBMSC誘導為成骨細胞后，隨著時間的增加，ALP活性的也隨之增加，在第9天時其活性達到最高。不同濃度淫羊藿苷作用下，第6天和第9天時的ALP活性均有所提高。并且在濃度為10 mol/L淫羊藿苷作用下ALP活性增加至最高，在濃度為20 mol/L淫羊藿苷的作用下ALP活性稍有減少。

圖1 不同濃度的淫羊藿苷對ALP活性的影響

2.2 淫羊藿苷對CFUALP-F的影響 見表1。加入淫羊藿苷5、10、20 mol/L后，將3個處理組和對照組形成CFUALP-F的灰度值、數(shù)量和面積進行對比分析，3個處理組CFUALP-F的灰度值、數(shù)量和面積高于對照組（P＜0.05）。

表1 各組CFUALP-F的灰度值、數(shù)量和面積的方差分析（s）

表1 各組CFUALP-F的灰度值、數(shù)量和面積的方差分析（s）

與對照組比較，△P＜0.05。

組別 灰度值 數(shù)量 面積對照組 23658.24±7.26 422.38±44.55 31.69±8.33 5 mol/L組 44054.12±4.89△846.01±75.93△56.87±7.12△10 mol/L組 59873.75±6.60△966.51±69.18△77.34±8.96△20 mol/L組 50770.15±5.27△870.23±52.46△69.05±5.45△

2.3 淫羊藿苷對礦化結(jié)節(jié)形成的影響 見表2。加入淫羊藿苷 5、10、20 mol/L后，3個處理組 Wnt10b、GSK-3、-catenin、LEF1 mRNA表達水平明顯提高。且在36 h時，淫羊藿苷對Wnt 10 b和LEF1 mRNA表達水平的影響最顯著。

表2 不同時間下10 mol/L淫羊藿苷對Wnt/-catenin的mRNA表達水平影響的方差分析（s）

表2 不同時間下10 mol/L淫羊藿苷對Wnt/-catenin的mRNA表達水平影響的方差分析（s）

與12、24 h比較，*P＜0.05。

時間 -catenin LEF1 Wnt 10 b GSK-3 12 h 5.12±0.05 3.59±0.05 24 h 5.53±0.28 3.47±0.56 16.03±2.58 4.69±0.03 20.29±2.63 4.87±0.24 36 h 6.48±0.17*13.93±1.18*24.76±2.70*5.34±0.96*

2.4 淫羊藿苷對-catenin和Runx2蛋白表達水平對影響 加入淫羊藿苷 5、10、20 mol/L 3 d后，采用Western blot對-catenin和Runx2蛋白表達水平檢測。結(jié)果顯示，在10 mol/L濃度淫羊藿苷下，Runx2蛋白表達水平的提高較為明顯，而-catenin蛋白表達水平在3種濃度下的淫羊藿苷均有提高。

3 討 論

目前，許多骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)炎等骨關(guān)節(jié)疾病影響著人們的健康及生活質(zhì)量。特別是對于絕經(jīng)期后，體內(nèi)雌激素下降的女性，更易引發(fā)骨質(zhì)疏松。淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分。多項研究表明，淫羊藿苷可以有效防治骨質(zhì)疏松、延緩衰老、抗腫瘤等功效［8-9］。相比較其他藥物對防治骨質(zhì)疏松的過程中，如降鈣素、雌激素等，使用淫羊藿苷后的不良反應及并發(fā)癥較少，服用時更為安全。

Wnt/-catenin信號通路對骨的形成和重建過程中有著重要的作用。該通路可以激活因子，從而促進BMSCs向成骨細胞分化。-catenin在成骨細胞分化過程中起著關(guān)鍵的作用，是成骨細胞分化早期階段不可或缺的，在-catenin剔除的小鼠中，MSCs前體細胞向軟骨細胞分化，而沒有形成成骨細胞［10］。當-catenin與 LEF1/TCF和Smad4形成復合物時，可促使Smad4進入細胞核內(nèi)，調(diào)控Wnt靶基因的表達。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt10b可活化-catenin表達水平，激活Wnt/-catenin信號通路，從而促進成骨細胞形成和成骨細胞向成骨分化以及骨細胞的礦化［11］。Runx2在BMSCs成骨分化中也起到關(guān)鍵的作用，Runx2基因表達活性影響Wnt/ -catenin信號通路調(diào)控成骨細胞成骨分化。Runx2可以和OCN啟動子上的特異性元件結(jié)合調(diào)控成骨細胞的分化過程，同時Runx2可以提高Colla1的表達水平。缺失Runx2基因會降低BMSCs向成骨細胞分化的能力。研究發(fā)現(xiàn)，Runx2基因突變的小鼠不會形成肋骨，而且出生不久便會死亡，經(jīng)組織切片發(fā)現(xiàn)小鼠沒有成骨細胞的形成［12］。此外，淫羊藿苷可以明顯增加ALP的活性，而ALP則是成骨細胞分化的早期標志［13］。

體內(nèi)激素水平可以影響Wnt/-catenin信號通路和Runx2表達水平，從而影響著成骨細胞的增殖與分化。女性絕經(jīng)后體內(nèi)雌激素水平明顯下降，極易引發(fā)骨質(zhì)疏松。而淫羊藿苷的有效成分為黃酮類化合物，可以預防和治療因激素水平而造成的骨質(zhì)疏松。同時本實驗結(jié)果顯示，淫羊藿苷可以使Wnt10b、GSK-3、-catenin、LEF1 mRNA表達水平明顯提高。Western blot結(jié)果提示，淫羊藿苷可以提高-catenin和Runx2的蛋白表達水平。說明淫羊藿苷可以通過激活Wnt/-catenin信號通路，參與并調(diào)控BMSC向成骨細胞分化。

近年來，淫羊藿苷在治療骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)炎等骨關(guān)節(jié)疾病的研究取得了很大的進展。研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷可以激活Wnt/-catenin信號通路能夠促進了成骨細胞的增殖與分化。但是，Wnt/-catenin信號通路中一些信號過度增強反而會誘導BMCs衰老［14］。因此，對Wnt/-catenin信號通路信號的強弱把控以及 Wnt/ -catenin信號通路中其他相關(guān)因子有待于進一步研究，以期使我們能更深一步的了解淫羊藿苷促進成骨細胞增殖和分化的機制，為臨床防治骨關(guān)節(jié)疾病提供有力依據(jù)。

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Effect of Icariin on Osteogenic Differentiation of Osteoblasts and Research on the Relationship of Wnt/-catenin Signal System

TU Yan，XIONG Lina，LIU XiangJie，et al. Liyuan Hospital Affiliated to Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology，Hubei，Wuhan 430077，China.

Objective：To investigate the effect of icariin on osteogenic differentiation of osteoblasts and Wnt/-catenin signaling pathway in the cells.Methods：SD rats were selected and rat bone marrow derived mesenchymal stem cells（rBMSC）were isolated and cultured by whole bone marrow adherent method in vitro，with adherent screening method.On the 3rd，6th and 9th day being treated with icariin，alkaline phosphatase（ALP）activity was observed in the control group and icariin treatment group，the alkaline phosphatase positive clone（CFUALP-F）and the influence of the formation of mineralized nodules were observed.Western blot method was used to detect the expression of-catenin and Runx2 protein in each group.The effect of Wnt10b，GSK-3，-catenin and LEF1 mRNA levels were detected by RT-PCR method.Results：The activity of ALP，the number of alkaline phosphatase and the formation of mineralized nodules could be enhanced by the activity of the alkaline phosphatase. Western blot results showed that the protein expression levels of-catenin and Runx2 could be improved by the expression of the protein.RT-PCR results showed that the expression levels of Wnt10b，GSK-3，-catenin and LEF1 were increased.Conclusion：Icariin can activate the Wnt/-catenin signaling pathway and participate in and regulate the BMSC osteogenic differentiation.

Icariin；Osteoblast；Osteogenic differentiation；Wnt/-catenin signal pathway

R285.5

A

1004-745X（2017）03-0448-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.03.023

2016-12-06）

華中科技大學院系自主創(chuàng)新研究基金（2016YXMS127）

△通信作者（電子郵箱：huyanyan@163.com）