秦秀德劉 玉李傳朋李新悅王 鈺虢周科△張國(guó)偉△

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518000；2.河北大學(xué)，河北 保定 071000）

·研究報(bào)告·

紅花注射液通過(guò)抗炎癥反應(yīng)治療急性腦梗死的機(jī)制研究*

秦秀德1劉 玉1李傳朋1李新悅2王 鈺2虢周科1△張國(guó)偉2△

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518000；2.河北大學(xué)，河北 保定 071000）

目的觀察紅花注射液對(duì)于腦卒中大鼠模型血清中超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）炎性生物標(biāo)志物表達(dá)的影響。方法用改良線栓法制作大鼠中動(dòng)脈阻斷（MCAO）模型，評(píng)定紅花注射液對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)功能缺損、腦梗死面積等的影響，并采用ELISA法來(lái)檢測(cè)hs-CRP在腦卒中大鼠模型中表達(dá)的水平。結(jié)果紅花注射液能改善MCAO大鼠的的神經(jīng)功能損傷情況；紅花注射液12 h組的腦梗死面積與模型12 h組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），紅花注射液24 h組的腦梗死面積與模型24 h組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。紅花注射液12 h組的hs-CRP與模型12 h組相比具有均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。結(jié)論紅花注射液能減小急性腦梗死MCAO大鼠的腦梗死面積，減輕炎癥反應(yīng)，對(duì)于腦卒中大鼠模型血清中超敏C反應(yīng)蛋白這種炎性生物標(biāo)志物表達(dá)有抑制作用。

急性腦梗死 超敏C反應(yīng)蛋白 紅花注射液

腦梗死是臨床常見的重大疾病，如何更有效的防治腦梗死是國(guó)家戰(zhàn)略層面重點(diǎn)研究的內(nèi)容之一。腦血管病急性期炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度與患者的預(yù)后關(guān)系密切。急性腦缺血后炎癥反應(yīng)存在有利的一面，也有有害的一面［1］。隨著免疫學(xué)、分子生物學(xué)等醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的發(fā)展，更多學(xué)者把眼光投向如何運(yùn)用炎性生物標(biāo)志物對(duì)腦卒中及其相關(guān)性疾病進(jìn)行檢測(cè)等方面的研究。本研究擬通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探討臨床常用中成藥紅花注射液對(duì)腦梗死炎性標(biāo)志物C反應(yīng)蛋白（CRP）的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量（250±20）g，SPF級(jí)，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。許可證編號(hào)：SCXK-（軍）2012-0004，飼料批號(hào)：SCXK（京）2015-0007。

1.2 試藥與儀器 紅花注射液（雅安三九藥業(yè)有限公司）；依達(dá)拉奉注射液（國(guó)藥集團(tuán)國(guó)瑞藥業(yè)有限公司）。大鼠超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）試劑盒（上海源葉生物科技有限公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑 （TTC）（北京索萊寶科技有限公司）；PBS磷酸鹽 （北京博奧拓科技有限公司）；水合氯醛 （天津市科密歐化學(xué)試劑公司）；多聚甲醛（天津市科密歐化學(xué)試劑公司）。電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；雙光束紫外可見分光光度計(jì) （TU-1901）（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；恒溫水浴鍋（DR-HW-2）（北京醫(yī)療設(shè)備總廠）；臺(tái)式高速離心機(jī)（TG16W）（長(zhǎng)沙易達(dá)儀器有限公司）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（ELx800）（美國(guó)BIO-TEK寶特）。

1.3 造模與分組 在24~26℃室溫的實(shí)驗(yàn)室中飼養(yǎng)3 d，大鼠于晨8時(shí)給予食物20 g，自由飲水。手術(shù)大鼠術(shù)前禁食12 h，自由飲水，稱體質(zhì)量，采用改良線栓法制備腦缺血大鼠模型。先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的戊巴比妥鈉0.4 mL/100 g腹腔注射麻醉，將大鼠四肢和牙齒用棉線繩固定好，消毒，正中切口，鈍性分離頸部肌肉，分離頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），結(jié)扎ECA遠(yuǎn)心端、CCA近心端。動(dòng)脈夾夾閉ICA，由CCA插入MCAO栓線，向頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）推進(jìn)，至大腦中動(dòng)脈（MCA），導(dǎo)致局灶性腦缺血［2］。10-0絲線縫合頸部切口。假手術(shù)組動(dòng)物不插入MCAO栓線，術(shù)中嚴(yán)格控制室溫在20~25℃。術(shù)前大鼠體質(zhì)量控制在250~ 280 g范圍內(nèi)，可增加成功率。動(dòng)物分組，SD雄性大鼠48只，隨機(jī)分成8組，每組6只。分組如下：模型組12 h組（C-12組），模型組24 h組（C-24組），假手術(shù)12 h組（SC-12組），假手術(shù)24 h組（SC-24組），紅花注射液12 h組（HH-12組），紅花注射液24 h組（HH-24組），依達(dá)拉奉12 h組（YD-12組），依達(dá)拉奉24 h組（YD-24組）。分組后大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后開始正式實(shí)驗(yàn)。給藥劑量：1）依達(dá)拉奉注射液人體用藥劑量為0.9 mg/kg，換算后大鼠的用藥劑量為5.67 mg/kg，將依達(dá)拉奉加入0.9%氯化鈉溶液2 mL溶解。12 h組和24 h組均為造模成功3 h后，進(jìn)行尾緣靜脈注射1次。2）紅花注射液：紅花注射液人體用藥劑量為0.29 mL/kg，換算后大鼠的用藥劑量為1.83 mL/kg。12 h組和24 h組均為造模成功后6 h后紅花注射液尾緣靜脈注射1次。

1.4 標(biāo)本采集與檢測(cè) 手術(shù)24 h后稱取大鼠體質(zhì)量，將大鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈取血5 mL，3000 r/min離心10 min取上清液，并用ELISA試劑盒檢測(cè)CRP。大鼠斷頭取腦，稱取大腦濕質(zhì)量后，放入-20℃冰箱中冰凍30 min后取出，沿大腦冠狀方向均勻切成6片，在1%TTC中水浴并避光15 min染色。而后將腦切片分別放入多聚甲醛及組織保存液中以待病理檢測(cè)。主要指標(biāo)：模型制作前后大鼠體質(zhì)量變化；大腦指數(shù)；血清中超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）及白細(xì)胞介素1β（IL-1β）的水平；神經(jīng)功能損傷評(píng)分：1）大腦指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器濕質(zhì)量（mg）/大鼠質(zhì)量（g）×100%；2）大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分。神經(jīng)功能損傷程度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)采用改良的Zea Longa標(biāo)準(zhǔn)分為6個(gè)等級(jí)。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無(wú)缺陷；1分，不能伸展對(duì)側(cè)前肢；2分，對(duì)側(cè)前肢彎曲；3分，輕度向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；4分，嚴(yán)重向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；5分，對(duì)側(cè)癱瘓。3）hs-CRP檢測(cè)按照ELISA試劑盒步驟操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料以（s）表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分比較 見表1。假手術(shù)12 h與模型組12 h相比具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），假手術(shù)24h與模型24h相比具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。其他組均無(wú)顯著性差異。

2.2 各組大鼠腦梗死面積比 見表1。腦梗死面積比分析：假手術(shù)12 h組與模型12 h組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），假手術(shù)24 h與模型24 h組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），紅花注射液12 h組與模型12h組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），紅花注射液24 h組與模型24 h組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。紅花注射液12 h組與依達(dá)拉奉12 h組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），紅花注射液24 h組與依達(dá)拉奉24 h組相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 各組大鼠hs-CRP水平比較 見表1。假手術(shù)12 h組與模型12 h組有顯著性差異（P＜0.05），模型12 h組大鼠血清中CRP含量明顯高于假手術(shù)12 h組；假手術(shù)24 h組與模型24 h組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但是模型24 h組血清中CRP含量均值大于假手術(shù)24 h組，模型組血清中CRP炎性因子表達(dá)程度高；紅花注射液12 h組CRP含量明顯低于模型12 h組CRP含量（P＞0.05）；紅花注射液24 h組與模型24 h組CRP含量雖然沒(méi)有顯著性差異，但紅花注射液24 h組CRP含量均值比模型組24 h低，證實(shí)了紅花注射液對(duì)24 h的大鼠模型血清中CRP起到一定抑制作用；紅花注射液12 h組、依達(dá)拉奉注射液12 h組和紅花注射液24 h組、依達(dá)拉奉注射液24 h組均無(wú)顯著性差異。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死面積比及CRP水平比較（s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死面積比及CRP水平比較（s）

組別 n CRP（ng/mL）CS-12組 6 20.66±2.08 CS-24組 6 20.30±0.76神經(jīng)功能缺損評(píng)分 腦梗死面積比均值0 0 0 0 C-12組 6 27.23±5.65 3.99±0.82 0.40±0.033 C-24組 6 3.00±0.63 0.37±0.024 22.93±2.97 HH-12組 6 18.85±3.34 2.67±0.81 0.31±0.037 HH-24組 6 2.67±0.51 0.30±0.044 20.71±1.68 YD-12組 6 2.67±0.81 0.29±0.065 19.74±3.35 YD-24組 6 2.67±0.51 0.30±0.056 17.76±1.51

2.4 各組大鼠腦切片病理及炎癥情況比較 見圖1。病理切片顯示，模型組局灶神經(jīng)上皮胞漿透亮，似核周空暈，散在分布淋巴細(xì)胞；假手術(shù)組：散在分布淋巴細(xì)胞；紅花注射液組局灶神經(jīng)上皮胞漿透亮，散在較多分布的淋巴細(xì)胞；依達(dá)拉奉組散在分布少許淋巴細(xì)胞，近腦室為著，灶狀淋巴組織聚集。

圖1 各組大鼠腦病理切片比較（HE染色，400倍，100倍）

3 討 論

現(xiàn)今由于吸煙、喝酒、夜生活過(guò)度、高脂肪飲食等不良生活習(xí)慣及高工作強(qiáng)度使腦卒中等心腦血管疾病的患病率顯著升高。世界銀行發(fā)布的報(bào)告中指出，慢性病已對(duì)中國(guó)國(guó)民健康造成不可估計(jì)的損失，慢性病死亡占死亡人數(shù)的比例已超過(guò)百分之八十多，其中，腦卒中對(duì)個(gè)體健康和生活造成的危害最大［3］。根據(jù)相關(guān)報(bào)告公布的數(shù)據(jù)，我國(guó)腦卒中患病率逐步升高。由此可見，我國(guó)腦卒中防控形勢(shì)嚴(yán)峻［4］。

hs-CRP是急性時(shí)相蛋白，可以誘發(fā)炎癥的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并對(duì)細(xì)胞因子的平衡起重要調(diào)節(jié)功能［5］。hs-CRP異常表達(dá)均對(duì)急性腦梗死病變的形成和進(jìn)展起重要作用［6］。正常人血清中超敏CRP含量很少，幾乎檢測(cè)不到，但當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)炎癥、創(chuàng)傷和心腦血管疾病時(shí)hs-CRP會(huì)升高。hs-CRP的水平與炎癥的出現(xiàn)及其嚴(yán)重程度具有相關(guān)性。臨床研究表明，患者h(yuǎn)s-CRP、FIB水平均與NIHSS評(píng)分呈正相關(guān)（r分別為0.291、0.891，P＜0.05），并由此得出結(jié)論：hs-CRP、FIB水平的升高與腦梗死的發(fā)病關(guān)系密切，及時(shí)檢測(cè)這兩項(xiàng)指標(biāo)的水平變化有助于腦梗死的早發(fā)現(xiàn)、早治療［7］。hs-CRP濃度可以作為腦梗死高危人群的臨床篩查工具指標(biāo)［8］。

紅花注射液是臨床常用的中成藥，因此本課題基于抗炎癥反應(yīng)來(lái)探討紅花注射液治療腦梗死的部分作用機(jī)制。紅花味辛微苦、性溫，乃活血通經(jīng)、祛瘀止痛之良藥，素有“活血之王”的美稱，其在腦血管的防治中發(fā)揮著重要作用。從紅花中提取得到的紅花黃色素可顯著改善腦缺血性缺氧，并且紅花黃色素的抗凝血作用可以抑制大鼠血栓形成［9］，對(duì)腦梗死具有較好的治療效果［10］。研究表明，黃芪注射液加紅花注射液促進(jìn)腦缺血再灌注模型鼠NT-3的上調(diào)可能是其抗腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制之一［11］。紅花黃色素可以明顯改善急性腦梗死患者的血漿黏度，降低紅細(xì)胞壓積，糾正血液高黏狀態(tài)［12］。紅花注射液在大鼠腦缺血/再灌注損傷中通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體SOD活性，降低MDA含量，達(dá)到其保護(hù)作用［13］。紅花注射液顯著減輕CH誘導(dǎo)的兔海馬缺血缺氧性損傷，可能是通過(guò)抑制nNOS蛋白表達(dá)起作用的［14］。趙氏等［15］運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理念和網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù)研究紅花注射液主要活性成分對(duì)腦血管疾病網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控作用，結(jié)果成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)含有940個(gè)節(jié)點(diǎn)，2360條連接。涉及的生物學(xué)過(guò)程主要有生物大分子合成及代謝、神經(jīng)再生、凋亡、血管生成、免疫炎癥反應(yīng)、缺氧應(yīng)激響應(yīng)等，其中羥基紅花黃色素A和槲皮素可能通過(guò)協(xié)同抗凋亡的作用發(fā)揮抗腦血管疾病作用。紅花注射液廣泛的用于腦梗死、冠心病等疾病的臨床治療，臨床觀察發(fā)現(xiàn)患者癥狀顯著改善，且使用過(guò)程中無(wú)明顯不良反應(yīng)。崔氏等［16］通過(guò)對(duì)9項(xiàng)研究共800例患者的系統(tǒng)評(píng)價(jià)，肯定了紅花黃色素對(duì)急性腦梗死治療的有效性與安全性。

因紅花注射液通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)標(biāo)志物hs-CRP的研究較少，探究紅花注射液對(duì)于腦卒中大鼠模型血清中hs-CRP這種重要的炎性生物標(biāo)志物表達(dá)的影響有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)研究表明，紅花注射液能夠改善急性腦梗死實(shí)驗(yàn)大鼠神經(jīng)功能缺損，減輕炎癥反應(yīng)，抑制腦卒中大鼠血清中hs-CRP炎性生物標(biāo)志物的表達(dá)，進(jìn)一步明確了紅花注射液對(duì)缺血性腦卒中有治療作用的機(jī)理，也為紅花注射液治療某些炎癥損傷疾病提供了一定的參考價(jià)值。下一步本課題將從氧化應(yīng)激信號(hào)通路深化對(duì)紅花注射液抗炎的機(jī)制研究。

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Study of Safflower Injection on Acute Ischemic Cerebral Infarction through Anti-inflammatory Way

QIN Xiude，LIU Yu，LI Chuanpeng，et al. Shenzhen TCM Hospital Affiliated to Guangzhou University of TCM，Guangdong，Shenzhen 518000，China.

Objective：To explore the effect of safflower injection on the expression of inflammatory bio-markers of hypersensitive C-reactive protein in MCAO model rats.Methods：MCAO model was established with reforming Longa method.The effect of safflower injection on the neurological deficits and infarct size in MCAO rats was evaluated.The expression level of inflammatory bio-markers of hypersensitive C-reactive protein was detected using ELISA method.Results：Neurologic impairment in rats：safflower injection could improve the neurologic function of MCAO rats.The brain infarction area ratio：there was significant difference between the 12 hours group of safflower injection and the model group（P＜0.05），and there was also significant difference between the 24 hours group of safflower injection and the model group（P＜0.05）.Serum hs-CRP concentration：there was significant difference between the hsCRP concentration of the safflower injection 12 hours group and the 12 hours model group（P＜0.05）.Conclusion：Safflower injection can reduce the infarct area of the stroke model rats，relieve inflammatory reaction and inhibit the expression of inflammatory biomarkers such as serum super-sensitive C-reactive protein.

Stroke；high-sensitivity C-reactive protein；Safflower injection

R285.5

A

1004-745X（2017）03-0409-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.03.010

2016-12-06）

深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（JCYJ20150401163247219）

△通信作者（電子郵箱：xxzgw@126.com）