肖夢杰++肖學(xué)成++薛大權(quán)+++崔開宇++涂皓++吳瑩++朱雅蓮

[摘要]目的 建立HPLC法測定醋酸曲安奈德益康唑乳膏中硝酸益康唑有關(guān)物質(zhì)的方法。方法 采用ZORBAX Eclipse XDB-C18 （4.6 mm×100.0 mm，3.5 μm）為色譜柱，以甲醇-0.077%醋酸銨溶液（20∶80）為流動相A，以甲醇-乙腈（40∶60）為流動相B，進(jìn)行梯度洗脫，檢測波長為225 nm；流速1.0 ml/min；柱溫為35℃。結(jié)果 硝酸益康唑與各雜質(zhì)分離度良好，硝酸益康唑在0.2～100.0 μg/ml的濃度范圍內(nèi)峰面積與濃度之間呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=15.6295x+4.5920（r=0.999 97）。結(jié)論 此方法測定醋酸曲安奈德益康唑乳膏中硝酸益康唑的有關(guān)物質(zhì)簡單可行。

[關(guān)鍵詞]醋酸曲安奈德益康唑乳膏；硝酸益康唑；有關(guān)物質(zhì)；HPLC

[中圖分類號] R917 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）02（c）-0011-05

Determination of Econazole Nitrate related substances in Triamcinolone Acetonide Acetate and Econazole Nitrate Cream

XIAO Meng-jie XIAO Xue-cheng XUE Da-quan▲ CUI Kai-yu TU Hao WU Ying ZHU Ya-lian

College of Pharmacy，Hubei University of Traditional Chinese Medicine，Wuhan 430065，China

[Abstract]Objective To establish a HPLC method for the determination of related substances of Econazole Nitrate in Triamcinolone Acetonide Acetate and Econazole Nitrate Cream.Methods The ZORBAX Eclipse XDB-C18 （4.6 mm×100.0 mm，3.5 μm） column was adopted.The mobile phase consisted of a mixture of Methanol-0.077% solution of Ammonium Acetate （20：80） as mobile phase A，a mixture of Methanol-Acetonitrile （40：60） as mobile phase B，which was used as gradient elution.The detection wavelength was 225 nm.The flow rate was 1.0 ml/min，and the column temperature was 35℃.Results Econazole Nitrate was well separated from impurity.The calibration curves was linear in range of 0.2-100.0 μg/ml for Econazole Nitrate，the regression equation was y=15.6295x+4.5920 （r=0.999 97）.Conclusion This method is simple and feasible to determine the related substances of Econazole Nitrate in Triamcinolone Acetonide Acetate and Econazole Nitrate Cream.

[Key words]Triamcinolone Acetonide Acetate and Econazole Nitrate Cream；Econazole Nitrate；Related Substances；HPLC醋酸曲安奈德益康唑乳膏中硝酸益康唑為廣譜抗真菌藥，醋酸曲安奈德為糖皮質(zhì)激素，醋酸曲安奈德益康唑乳膏對皮炎、濕疹、皮膚細(xì)菌感染和皮膚淺表真菌感染伴有明顯炎癥反應(yīng)療效確切[1-9]。由于在曲安奈德益康唑乳膏（Ⅱ）（醋酸曲安奈德益康唑乳膏）國家標(biāo)準(zhǔn)WS1-（X-320）-2004Z、《中國藥典》[10]收錄的曲安奈德益康唑乳膏、硝酸益康唑乳膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中均未對產(chǎn)品的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行控制，為了更好地提高產(chǎn)品質(zhì)量，通過醋酸曲安奈德益康唑乳膏中硝酸益康唑的雜質(zhì)研究[11-13]，并參考EP標(biāo)準(zhǔn)[14]和《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)中硝酸益康唑原料藥有關(guān)物質(zhì)的檢查方法，對醋酸曲安奈德益康唑乳膏中硝酸益康唑的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行了控制。

1儀器與試藥

1.1儀器

KNAUER S-2500高效液相色譜儀（德國諾爾）和相應(yīng)的工作站；TU-1810紫外-可見分光光度計（北京譜析）；Acculab ALC-110.4分析天平；水浴鍋（鞏義市英峪予華儀器廠）；ORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×100.0 mm，3.5 μm）色譜柱。

1.2試藥

醋酸曲安奈德益康唑乳膏樣品由武漢諾安藥業(yè)有限公司試制，批號：20160701、20160702、20160703；空白輔料樣品（自制，除不含有硝酸益康唑外，其他成分均與樣品一致）；市售醋酸曲安奈德益康唑乳膏（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：15061701，商名品：吉佰芙）；硝酸益康唑?qū)φ掌罚ㄓ芍袊称匪幤窓z定研究院提供，批號：100214-201204，含量為99.6%）；硝酸益康唑系統(tǒng)適用性對照品（由歐洲藥典委員會提供，批號：006PA0，含硝酸益康唑和雜質(zhì)A、B、C）；硝酸益康唑雜質(zhì)A對照品（由Cato Research Chemicals Inc提供，批號：C3D-2013-1503，含量為98.8%）；硝酸益康唑雜質(zhì)B對照品（由Cato Research Chemicals Inc提供，批號：C4X-13272-1501，含量為99.8%）；硝酸益康唑雜質(zhì)C對照品（由Cato Research Chemicals Inc提供，批號：C4X-13273-1412，含量為99.7%）。甲醇、乙腈為色譜純；其他均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

采用ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×100.0 mm，3.5 μm）為色譜柱，以甲醇-0.077%醋酸銨溶液（20∶80）為流動相A，以甲醇-乙腈（40∶60）為流動相B，檢測波長為225 nm；流速為1.0 ml/min；柱溫為35℃；進(jìn)樣量為20 μl，梯度洗脫見表1。

2.2溶液的制備

2.2.1樣品溶液 取醋酸曲安奈德益康唑乳膏2.5 g，精密稱定，置燒杯中，加甲醇15 ml，置80℃水浴中加熱2 min，使溶解，用甲醇適量移至25 ml量瓶中，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，在冰浴中冷卻1 h后立即過濾，取續(xù)濾液放置至室溫，備用。

2.2.2對照品溶液 取硝酸益康唑?qū)φ掌芳s10 mg，精密稱定，置100 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為硝酸益康唑?qū)φ掌穬湟?；取硝酸益康唑系統(tǒng)適用性對照品適量，精密稱定，用甲醇稀釋成濃度約為1 mg/ml的對照品溶液；分別取雜質(zhì)A對照品、雜質(zhì)B對照品、雜質(zhì)C對照品約10 mg，精密稱定，用甲醇分別稀釋成濃度約為10 μg/ml的對照品溶液。

2.2.3空白輔料對照溶液 取空白輔料樣品乳膏2.5 g，精密稱定，制備方法同“2.2.1”項下。

2.3專屬性考察

取空白溶劑（甲醇）、空白輔料、系統(tǒng)適用性溶液及供試品溶液分別按上述色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)行專屬性考察，結(jié)果顯示溶劑和空白輔料對主峰及雜質(zhì)的檢測均無干擾。表明該流動相用于醋酸曲安奈德益康唑乳膏中硝酸益康唑的有關(guān)物質(zhì)的檢測具有一定的專屬性，色譜圖見圖1～4。

2.4破壞試驗

2.4.1酸破壞 取醋酸曲安奈德益康唑乳膏2.5 g，精密稱定，置燒杯中，加甲醇15 ml，置80℃水浴中加熱2 min，使溶解，用甲醇適量移至25 ml量瓶中，放冷。加1 mol/L的鹽酸溶液2.5 ml，搖勻，避光放置2 h后，用1 mol/L氫氧化鈉溶液2.5 ml中和，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，在冰浴中冷卻1 h后立即過濾，取續(xù)濾液放置至室溫，備用。

2.4.2堿破壞 取醋酸曲安奈德益康唑乳膏2.5 g，精密稱定，置燒杯中，加甲醇15 ml，置80℃水浴中加熱2 min，使溶解，用甲醇適量移至25 ml量瓶中，放冷。加1 mol/L的氫氧化鈉溶液2.5 ml，搖勻，避光放置2 h后，用1 mol/L鹽酸溶液2.5 ml中和，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，在冰浴中冷卻1 h后立即過濾，取續(xù)濾液放置至室溫，備用。

2.4.3光破壞 取醋酸曲安奈德益康唑乳膏2.5 g，精密稱定，置燒杯中，加甲醇15 ml，置80℃水浴中加熱2 min，使溶解，用甲醇適量移至25 ml量瓶中，放冷。用甲醇稀釋至刻度，搖勻，置4500 Lx的強(qiáng)光下照射48 h，然后在冰浴中冷卻1 h后立即過濾，取續(xù)濾液放置至室溫，備用。

2.4.4熱破壞 取醋酸曲安奈德益康唑乳膏2.5 g，精密稱定，置燒杯中，加甲醇15 ml，置80℃水浴中加熱2 min，使溶解，用甲醇適量移至25 ml量瓶中，放冷。用甲醇適量移至25 ml量瓶中， 再將量瓶置100℃水浴中破壞2 h（每間隔半小時加甲醇1次）后，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，在冰浴中冷卻1 h后立即過濾，取續(xù)濾液放置至室溫，備用。

2.4.5氧化破壞 取醋酸曲安奈德益康唑乳膏2.5 g，精密稱定，置燒杯中，加甲醇15 ml，置80℃水浴中加熱2 min，使溶解，用甲醇適量移至25 ml量瓶中，放冷。加入30%的H2O2 2.5 ml，搖勻，避光放置2 h后，于80℃水浴中加熱2 min，冷卻至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，在冰浴中冷卻1 h后立即過濾，取續(xù)濾液放置至室溫，備用。

按上述色譜條件，分別取制劑的酸、堿、光、熱、氧化破壞溶液進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖5～9，結(jié)果表明：①醋酸曲安奈德益康唑乳膏的酸、堿、光、熱、氧化破壞溶液進(jìn)樣，各降解產(chǎn)物峰之間、各降解產(chǎn)物峰與主峰之間、各降解產(chǎn)物峰與輔料峰之間的分離度均符合規(guī)定；②醋酸曲安奈德益康唑乳膏中硝酸益康唑?qū)庹掌茐妮^穩(wěn)定，對酸、堿、氧化和高溫破壞均敏感，其中，熱破壞和堿破壞將制劑中的另一主藥醋酸曲安奈德和抗氧劑BHA已完全破壞，破壞后降解產(chǎn)生的物質(zhì)統(tǒng)一計算為硝酸益康唑熱破壞降解雜質(zhì)。

2.5精密度試驗

取“2.2.1”項下同一供試品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6針。結(jié)果，醋酸曲安奈德益康唑乳膏中單個最大雜質(zhì)峰面積的RSD=0.44%（n=6），各雜質(zhì)峰面積和的RSD=0.44%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.6樣品溶液穩(wěn)定性

取“2.2.1”項下同一供試品溶液，放置于25℃恒溫箱中，于0、1、2、4、6、8 h后進(jìn)樣測定。結(jié)果，醋酸曲安奈德益康唑乳膏中最大雜質(zhì)峰面積的RSD=0.13%（n=6），各雜質(zhì)峰面積和的RSD=0.74%（n=6），表明供試品溶液在8 h內(nèi)比較穩(wěn)定。

2.7定量限及檢測限考察

取“2.2.1”項下硝酸益康唑?qū)φ諆湟海鸩较♂?，定量限按信噪?0∶1計為0.3 ng，檢測限按信噪比3∶1計為0.1 ng。

2.8重復(fù)性試驗

取“2.2.1”項下硝酸益康唑?qū)φ諆湟?，連續(xù)進(jìn)樣6針，結(jié)果，硝酸益康唑峰面積RSD=0.11%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9線性關(guān)系試驗

取硝酸益康唑?qū)φ掌穬湟海?以甲醇為溶劑，分別配制成含硝酸益康唑約為0.2、1.0、2.0、10、100 μg/ml的系列對照品溶液，按上述擬定的色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。以硝酸益康唑的平均峰面積為縱坐標(biāo)，以硝酸益康唑的濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程為y=15.6295x+4.5920（r=0.999 97），結(jié)果表明，硝酸益康唑溶液在0.2～100.0 μg/ml的濃度范圍內(nèi)峰面積與濃度之間呈良好的線性關(guān)系。

2.10試制樣品與市售樣品的有關(guān)物質(zhì)檢查

精密稱取批號為20160701、20160702、20160703三批樣品及市售樣品各2.5 g，分別置燒杯中，加甲醇15 ml，置80℃水浴中加熱2 min，用甲醇適量移至25 ml量瓶中，放冷，定容，濾過取續(xù)濾液作為供試品溶液。精密量取供試品溶液1 ml，置100 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。照上述確定色譜條件檢查，已知雜質(zhì)按外標(biāo)法，未知雜質(zhì)按主成分自身對照法計算其有關(guān)物質(zhì)，結(jié)果見表2。

3討論

3.1檢測波長的選擇

因硝酸益康唑與醋酸曲安奈德的最大吸收波長及色譜條件存在一定的差異，為了更靈敏地檢出產(chǎn)品的雜質(zhì)種類及準(zhǔn)確控制雜質(zhì)的限度，按照兩主成分原料藥項下的有關(guān)物質(zhì)檢查方法分別進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)的檢測，硝酸益康唑在200～400 nm的波長范圍內(nèi)掃描，其最大吸收波長為220 nm，參考硝酸益康唑原料藥《歐洲藥典》標(biāo)準(zhǔn)和《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)物質(zhì)的檢測波長為225 nm，所以確定將225 nm作為檢測波長。

3.2雜質(zhì)的相對保留時間

取硝酸益康唑系統(tǒng)適用性對照品溶液、雜質(zhì)A對照品溶液、雜質(zhì)B對照品溶液及雜質(zhì)C對照品溶液，按上述色譜條件，分別連續(xù)進(jìn)樣2針，結(jié)果，系統(tǒng)適用性溶液中雜質(zhì)A、B、C與主峰的相對保留時間分別約為0.3、0.7、0.9，與EP標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的雜質(zhì)A、B、C與主峰的相對保留時間約為0.2、0.6、1.1不一致。張慧文等[15]研究表明，用不同品牌的C18色譜柱，雜質(zhì)A、B、C的出峰位置和出峰順序有可能不同，所以用相對保留時間對雜質(zhì)A、B、C進(jìn)行定位不準(zhǔn)確。

3.3雜質(zhì)的限度

對比硝酸益康唑原料藥的《歐洲藥典》標(biāo)準(zhǔn)和《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)物質(zhì)的檢測方法，在雜質(zhì)限度控制中，《歐洲藥典》標(biāo)準(zhǔn)更嚴(yán)格，在《歐洲藥典》標(biāo)準(zhǔn)中分別收載了三個已知雜質(zhì)，分別為雜質(zhì)A、B、C，并制定了限度，明確了結(jié)構(gòu)式，而在《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)中未進(jìn)行詳細(xì)的規(guī)定；另外，《歐洲藥典》標(biāo)準(zhǔn)中對未知單雜和總雜的限度較《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)更嚴(yán)，計算方法均為不加校正因子的主成分自身對照法?？紤]到本品為外用制劑，參考《中國藥典》結(jié)合3批樣品和市售樣品的檢驗結(jié)果，擬定的雜質(zhì)限度與硝酸益康唑《中國藥典》質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)一致，即單個未知雜質(zhì)的限度為0.2%，總雜為0.5%。

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（收稿日期：2017-01-02 本文編輯：方菊花）