丁麗華，于 斐，張冠軍，熊亞敏，劉利娥#，吳擁軍，玉崧成

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生化學(xué)教研室 鄭州 450001

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的高靈敏化學(xué)發(fā)光磁酶免疫法檢測(cè)*

丁麗華1)，于 斐2)，張冠軍1)，熊亞敏1)，劉利娥2)#，吳擁軍2)，玉崧成2)

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生化學(xué)教研室 鄭州 450001

#通信作者,女，1966年12月生，博士，教授，研究方向：食物營養(yǎng)與新型分析技術(shù)，E-mail：zzdxlle66@zzu.edu.cn

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇；金磁復(fù)合微粒；化學(xué)發(fā)光磁酶免疫法

目的：建立一種快速簡便、靈敏度高的新型化學(xué)發(fā)光磁酶免疫法(MECLIA)檢測(cè)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)。方法：制備Fe3O4@SiO2@Au金磁復(fù)合微粒及DON與卵清蛋白(OVA)的復(fù)合物(OVA-DON)；以Fe3O4@SiO2@Au為固相載體，優(yōu)化條件，使其表面負(fù)載OVA-DON形成DON金磁免疫復(fù)合微粒；以魯米諾-過氧化氫-辣根過氧化物酶-苯酚類化合物作為增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光體系，建立MECLIA對(duì)小麥中DON進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)所建立的方法進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。結(jié)果：該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-521 951X+2 883 979(X為DON質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)，Y為化學(xué)發(fā)光值，R2=0.998 6)，線性范圍為0.10～20.00 μg/L，檢測(cè)限為31 ng/L；批內(nèi)RSD為2.2%～3.5%，批間RSD為4.9%～9.6%，標(biāo)準(zhǔn)樣品回收率為95.0%～108.0%，小麥樣品回收率為92.0%～106.0%。結(jié)論：該研究建立的MECLIA靈敏度高、精密度好、操作簡單，可用于大批量小麥樣品中DON的快速檢測(cè)。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)又稱嘔吐毒素,是由黃色鐮刀菌、禾谷鐮刀菌和燕麥鐮刀菌等產(chǎn)生的具有強(qiáng)細(xì)胞毒性、胚胎毒性和潛在致癌性的真菌毒素[1]，主要污染小麥、大麥、玉米等谷類作物。DON性質(zhì)穩(wěn)定，一般的食品加工很難將其破壞，對(duì)動(dòng)物和人類的健康危害非常大。因此建立一種靈敏度高、簡便快速的DON檢測(cè)方法是農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)過程監(jiān)控、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、快速篩查和維護(hù)人體健康的迫切需求。常用的DON檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、側(cè)流免疫層析法(LFA)[2]、薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)和氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[3]等，這些方法或靈敏度較低，或分析時(shí)間長、步驟繁瑣[4]，或儀器設(shè)備昂貴[5-6]，不能滿足快速檢測(cè)DON的需求。化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析方法(CLEIA)是將化學(xué)發(fā)光和免疫反應(yīng)相結(jié)合的一種新型檢測(cè)方法，不僅具有檢測(cè)快速、操作簡便、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，而且對(duì)儀器要求低，適合大批量樣品的現(xiàn)場(chǎng)篩查，但該法存在著包被抗體(或抗原)易脫落、固液接觸面積小、反應(yīng)速度慢等缺陷。為彌補(bǔ)CLEIA的不足，該研究利用金磁復(fù)合微粒代替?zhèn)鹘y(tǒng)的微孔板作為固相載體，建立化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析法(magnetic enzyme chemiluminescence immunoassay，MECLIA)用于DON的檢測(cè)，為食品中DON毒素的檢測(cè)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 卵清蛋白(OVA)、DON標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司，DON單克隆抗體(以下簡稱DON單抗，購自北京華安麥科生物技術(shù)有限公司)，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，魯米諾(阿法埃莎化學(xué)有限公司)。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q水?；瘜W(xué)發(fā)光底液A(魯米諾+對(duì)羥基聯(lián)苯)和B(過氧化氫)為作者所在實(shí)驗(yàn)室自制；緩沖溶液采用文獻(xiàn)[7]報(bào)道的方法配制。納米粒度及Zeta電位分析儀(Zetasizer Nano-zs 90，英國馬爾文儀器有限公司)，紅外光譜儀(PE-1710，西德PE公司)，化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(Centro XS3 LB960，BERTHOLD公司)，紫外可見分光光譜儀(UV-1601，日本島津公司)。

1.2 MECLIA方法原理 MECLIA法檢測(cè)DON的原理如圖1所示，以金磁復(fù)合微粒為固相載體負(fù)載DON-OVA復(fù)合物形成DON金磁免疫復(fù)合微粒；然后加入待測(cè)樣品和DON單抗，待測(cè)樣品中的DON和固相DON競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合DON單抗；磁分離后加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG；再次磁分離，最后加入化學(xué)發(fā)光底液A和B，HRP催化發(fā)光底液產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光；發(fā)光強(qiáng)度與待測(cè)樣品中DON含量成反比。

1.3 DON金磁免疫復(fù)合微粒的制備 用共沉淀法[8]制備Fe3O4磁性微粒，在此基礎(chǔ)上參考文獻(xiàn)[9]的方法制備金磁復(fù)合微粒Fe3O4@SiO2@Au，用納米粒度及Zeta電位、紅外光譜對(duì)其進(jìn)行表征測(cè)定。參考文獻(xiàn)[10]的方法制備DON-OVA人工抗原，用紫外吸收光譜進(jìn)行表征測(cè)定。利用金磁復(fù)合微粒良好的表面相容性負(fù)載DON-OVA形成DON金磁免疫復(fù)合微粒，具體步驟如下：將5.00 mg金磁復(fù)合微粒與1 mL 1.233 μmol/L DON-OVA人工抗原分別加入1 mL 20 mmol/L pH 7.0 Tris-HCl緩沖液中，在優(yōu)化后的條件(反應(yīng)溫度37 ℃、作用時(shí)間30 min)下恒溫振蕩，磁分離；再加入800 μL 封閉液，37 ℃、300 r/min振蕩1 h，磁分離，用PBST洗板3次，得到DON金磁免疫復(fù)合微粒；最后加入1 mL保存緩沖液(10 mmol/L PBS)混勻，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 MECLIA法檢測(cè)DON原理圖

1.4 MECLIA檢測(cè)DON方法的建立 用碳酸鹽緩沖溶液將DON金磁免疫復(fù)合微粒按1100稀釋，將稀釋后的懸浮液加入96孔板中，每孔100 μL，用PBST洗滌1次。每孔加入300 μL封閉液，37 ℃孵育1 h，用PBST洗板2次。每孔再加入100 μL DON與其單克隆抗體的混合液，37 ℃孵育1 h，用PBST洗板3次。隨后每孔加入100 μL用封閉液稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h后用PBST洗板4次。最后每孔再加入發(fā)光底液A和B各100 μL，檢測(cè)各孔的化學(xué)發(fā)光值。 配制質(zhì)量濃度分別為0.05、0.10、0.50、1.00、10.00、20.00 μg/L的DON標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述方法進(jìn)行檢測(cè)，以化學(xué)發(fā)光值為Y，以DON質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)為X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

配制0.1、5.0、20.0 μg/L的DON標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)平行對(duì)照，在3個(gè)96孔板中分別進(jìn)行MECLIA檢測(cè)，測(cè)定DON濃度，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，考察批內(nèi)精密度和批間精密度。

配制0.1、5.0、20.0 μg/L的DON標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，進(jìn)行MECLIA實(shí)驗(yàn)，測(cè)定化學(xué)發(fā)光值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到相應(yīng)的DON濃度，計(jì)算加標(biāo)回收率。

1.6 小麥樣品檢測(cè) 將小麥樣品用高速萬能粉碎機(jī)粉碎，過300目篩，用4分法稱取5 g樣品，用10 mL甲醇-水(體積比為31)溶液振蕩提取30 min，離心15 min，過濾后用PBS稀釋，采用MECLIA方法測(cè)定DON濃度。

在離心管中加入1 mL樣品稀釋液后分別加入1.0、5.0和15.0 μL 1.0 mg/L DON標(biāo)準(zhǔn)品溶液，采用MECLIA方法檢測(cè)DON濃度，計(jì)算加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果

2.1 金磁復(fù)合微粒的表征 ①納米粒度及Zeta電位：Fe3O4、Fe3O4@SiO2-NH2、Fe3O4@SiO2@Au的粒徑及Zeta電位分析結(jié)果見表1。表1說明，3種磁性微粒的分散性和穩(wěn)定性較好。②紅外表征：如圖2所示，與Fe3O4紅外光譜圖相比，F(xiàn)e3O4@SiO2@Au在3 404.39、1 617.62 cm-1處有N-H和O-H伸縮振動(dòng)和彎曲振動(dòng)產(chǎn)生的吸收峰；在1 061.93、1 112.11 cm-1處有Si-O反對(duì)稱伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的吸收峰。上述結(jié)果提示Fe3O4@SiO2@Au金磁復(fù)合微粒制備成功。

表1 磁性微粒的粒徑及Zeta電位

圖2 磁性微粒的紅外吸收光譜圖

2.2 DON金磁免疫復(fù)合微粒的制備 DON-OVA人工抗原紫外吸收光譜表征:圖3顯示，在280 nm處OVA有吸收峰；在345 nm處DON有吸收峰。DON-OVA人工抗原在280和345 nm附近均有吸收峰，提示偶聯(lián)成功。

圖3 DON-OVA的紫外吸收光譜圖

2.3 MECLIA標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法學(xué)評(píng)價(jià) MECLIA法檢測(cè)DON的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=-521 951X+2 883 979(X為DON質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)，Y為化學(xué)發(fā)光值)，R2=0.998 6，線性范圍為0.10～20.00 μg/L。該方法的檢測(cè)限為31 ng/L；批內(nèi)RSD為2.2%～3.5%(n=6)，批間RSD為4.9%～9.6%(n=6)；標(biāo)準(zhǔn)品的回收率范圍為95.0%～108.0%。

2.4 MECLIA法檢測(cè)小麥樣品 MECLIA法測(cè)得小麥樣品稀釋液中DON濃度為1.5 μg/L。加標(biāo)回收率見表2，回收率范圍為92.0%～106.0%。

表2 MECLIA法加標(biāo)回收率(n=3)

3 討論

該研究用金磁復(fù)合微粒代替?zhèn)鹘y(tǒng)微孔板作為固相載體建立了一種簡便快速的MECLIA檢測(cè)小麥中DON殘留。其靈敏度顯著高于傳統(tǒng)的CLEIA法，檢測(cè)限為31 ng/L。Li等[11]運(yùn)用傳統(tǒng)免疫分析方法檢測(cè)DON，檢測(cè)限為6.12 μg/L，改良后LOD仍為0.94 μg/L。該方法靈敏度較高原因在于利用金磁復(fù)合微粒替代傳統(tǒng)的微孔板作為固相載體，避免了傳統(tǒng)免疫分析中由于抗體(或抗原)擴(kuò)散脫落而引起的檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確；增大了固液接觸面積，提高了免疫反應(yīng)速率，使反應(yīng)更徹底；此外，金磁復(fù)合微粒在一定程度上也起到了信號(hào)增強(qiáng)的作用[12]。

總之，該研究所建立的方法精密度好，回收率高，準(zhǔn)確性較好；且樣品前處理簡單、操作方便，耗時(shí)短，可用于大批量小麥樣品中DON的檢測(cè)，有望實(shí)現(xiàn)DON的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

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(2016-07-28收稿 責(zé)任編輯徐春燕)

Determination of deoxynivalenol by a sensitive method of magnetic enzyme chemiluminescence immunoassay

DINGLihua1),YUFei2),ZHANGGuanjun1),XIONGYamin1),LIULi'e2),WUYongjun2),YUSongcheng2)

1)DepartmentofNutritionandFoodHygiene,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)DepartmentofSanitaryChemistry,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

deoxynivalenol;gold magnetic partical;magnetic enzyme chemiluminescence immunoassay

Aim: To propose a magnetic enzyme chemiluminescence immunoassay(MECLIA) for rapid and sensitive detection of deoxynivalenol(DON).Methods: Fe3O4@SiO2@Au particles and the conjugation of DON to ovalbumin(OVA-DON) were prepared.Then,the DON-OVA was coated on the surface of Fe3O4@SiO2@Au by using Fe3O4@SiO2@Au as immobile phase. After that, MECLIA based on the luminol-H2O2-HRP-phenols system for detection of DON was established. The accuracy and sensitivity of the established method were evaluated.Results: The standard curve equation wasY=-521 951X+2 883 979(Xwas the logarithm of the concentration of DON,Ywas the illumination value of the standard concentration,R2=0.998 6), the linear range was 0.10～20.00 μg/L, the limit of detection was 31 ng/L, the relative standard deviations were less than 3.5% and 9.6% for intra- and inter-assay, respectively, and the recoveries ranged from 95.0% to 108.0%. The proposed method was satisfactorily applied to determine DON in wheat sample and the recoveries ranged from 92.0% to 106.0%.Conclusion: The developed MECLIA is sensitive and simple with good precision for DON residue analysis in wheat samples.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.02.007

*國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目 81402721；河南省教育廳自然科學(xué)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目 14A330008；2014鄭州大學(xué)研究生教育科研專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目

R155.5+2