孫淑娜 黃啟騰 魏海峰 李廣遠(yuǎn) 趙 穎 張曉杰

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·論著·

清熱利濕飲通過調(diào)控FBW7影響HaCaT細(xì)胞Cyclin E的表達(dá)

孫淑娜1黃啟騰1魏海峰2李廣遠(yuǎn)3趙 穎1張曉杰1

目的： 明確清熱利濕飲調(diào)控HaCaT細(xì)胞內(nèi)Cyclin E表達(dá)的機(jī)制。方法： Western blot檢測(cè)HaCaT細(xì)胞蛋白半衰期；免疫沉淀及Western blot檢測(cè)蛋白泛素化水平；Western blot及Real-time PCR檢測(cè)清熱利濕飲對(duì)E3泛素連接酶SCF-FBW7表達(dá)的影響。結(jié)果： 與對(duì)照組比較,清熱利濕飲組Cyclin E蛋白的半衰期較對(duì)照組縮短，Cyclin E蛋白泛素化水平及蛋白降解速度顯著增高，F(xiàn)BW7 mRNA與蛋白水平明顯上調(diào)。結(jié)論： 清熱利濕飲通過調(diào)控FBW7抑制Cyclin E的表達(dá)。

清熱利濕飲； Cyclin E； 泛素化； FBW7

銀屑病病理生理的重要特點(diǎn)之一是表皮基底層的角質(zhì)形成細(xì)胞增殖加速，細(xì)胞周期縮短，組織病理呈現(xiàn)角質(zhì)形成細(xì)胞過度增生[1]。清熱利濕飲是針對(duì)銀屑病證型的有效中藥組方，經(jīng)過臨床觀察療效顯著[2]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)清熱利濕飲能夠抑制角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT細(xì)胞增殖和Cyclin E蛋白表達(dá)下調(diào)，但機(jī)制不明[3]。為明確清熱利濕飲影響細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，我們對(duì)其調(diào)控Cyclin E的表達(dá)機(jī)制進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 人永生化表皮細(xì)胞HaCaT細(xì)胞株購(gòu)于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶與胎牛血清：Gibco公司。Western blot用一抗，siRNA，protein A珠子：Santa cruz公司， Light Cycler 480 SYBR Green I Master：ROCHE公司。MG132，CHX， RIPA裂解液：碧云天生物技術(shù)公司。Trizol，Lipofectamine2000：Invitrogen公司。cNDA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：天根生化科技有限公司。

1.2 主要方法

1.2.1 清熱利濕飲藥液制備 龍膽草6 g，黃芩9 g，柴胡9 g，山梔9 g， 生地黃15 g， 牡丹皮9 g，當(dāng)歸9 g，金銀花30 g，土茯苓30 g，澤瀉9 g，車前子15 g，甘草6 g，上述藥材加10倍量水浸泡1 h,煎煮至沸,保持微沸45 min,過濾,濾渣加入8倍量水再煎煮,沸騰后保持微沸0.5 h,合并兩次煎煮液，將上述中藥液減壓濃縮成200 mL，每毫升藥液含0.78 g生藥，過濾除菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。?xì)胞培養(yǎng)時(shí)稀釋到相應(yīng)終濃度。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將HaCaT細(xì)胞株接種于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中貼壁培養(yǎng)。隔天換液。清熱利濕飲藥物處理組使用終濃度80 μg/mL藥液的DMEM培養(yǎng)細(xì)胞48 h。

1.2.3 Realtime PCR RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量PCR方法參照文獻(xiàn)[4]。將藥物處理的HaCaT細(xì)胞使用Trizol裂解提取RNA并參照說明書取2 μG逆轉(zhuǎn)錄。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系：每10 μL反應(yīng)體系包括無菌去離子水4.2 μL、Light Cycler 480 SYBR Green I Master 5 μL、cDNA 0.5 μL、逆轉(zhuǎn)錄引物0.3 μL，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72度延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。，以GAPDH為內(nèi)參，應(yīng)用Roche LightCycler 480自帶分析程序比較不同樣本同一目的基因的表達(dá)變化情況，并進(jìn)行分析。引物序列qGAPDH-F：5'-CCAGGTGGTCTCCTCTGACTT-3'，qGAPDH-R：5'-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3'；qFBW7-F：5′-CCTCCAGGAATGGCTAAAAA-3′,qFBW7-R：5′-AAGAGTTCATCTAAAGCAAGCAA-3′。

1.2.4 Western blot 方法參考文獻(xiàn)[5]。將藥物處理的HaCaT細(xì)胞使用RIPA裂解液冰上裂解提取蛋白，BCA蛋白定量，取40 μg樣品變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，含5%脫脂奶粉TBS封閉，一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜，二抗37℃孵育1 h，洗膜，化學(xué)發(fā)光，顯影定影。膠片曝光。

1.2.5 泛素化水平檢測(cè) 將細(xì)胞使用30 μM的MG132處理3 h，使用western及IP裂解液冰上裂解并超聲，離心提取蛋白。蛋白上清中加入1 μg anti-Cyclin E抗體，4℃條件下孵育3 h再加入50 μL protein A的珠子，4℃條件下孵育過夜。使用IP裂解液洗滌珠子3遍，每遍10 min，棄上清。加入2×蛋白上樣緩沖液至珠子中，99℃變性5～10 min，樣品進(jìn)行western blot。

1.2.6 Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染siRNA 將細(xì)胞鋪到6孔板中， 24 h后細(xì)胞密度達(dá)到約30%。取1.5 mL無菌Ep管，參照說明，分別加入適量無血清無抗生素的培養(yǎng)基，lipofectamin2000轉(zhuǎn)染試劑和siRNA，混勻，室溫放置20 min。將配制好的轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中siRNA終濃度為50 nM。

2 結(jié)果

2.1 清熱利濕飲縮短Cyclin E的蛋白半衰期，降低蛋白穩(wěn)定性 我們前期發(fā)現(xiàn)清熱利濕飲可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控Cyclin E的表達(dá)，因此我們首先分析了清熱利濕飲對(duì)Cyclin E蛋白穩(wěn)定性的影響。為了排除蛋白翻譯效率的差異對(duì)結(jié)果的影響，我們使用了蛋白合成抑制劑放線菌酮CHX(50 μg/mL)處理細(xì)胞，然后在不同時(shí)間點(diǎn)收取細(xì)胞蛋白，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Cyclin E的蛋白含量。結(jié)果顯示不同時(shí)間點(diǎn)，藥物處理組細(xì)胞內(nèi)Cyclin E蛋白含量明顯少于對(duì)照組細(xì)胞，提示清熱利濕飲處理細(xì)胞內(nèi)Cyclin E蛋白含量降低速度明顯快于對(duì)照細(xì)胞，表明清熱利濕飲能明顯縮短Cyclin E的蛋白半衰期，降低其蛋白穩(wěn)定性(圖1)。

圖1 清熱利濕飲縮短Cyclin E蛋白的半衰期。藥物處理組細(xì)胞使用含80 μg/mL清熱利濕飲藥液的DMEM培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)48 h，對(duì)照組使用含與清熱利濕飲等體積去離子水的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)相同時(shí)間。收取細(xì)胞前使用放線菌酮CHX(50 μg/mL)處理各組細(xì)胞后在所示時(shí)間點(diǎn)收取細(xì)胞，提取總蛋白進(jìn)行western blot檢測(cè)

2.2 清熱利濕飲促進(jìn)Cyclin E的泛素化和蛋白降解 泛素-蛋白酶體降解途徑是調(diào)控Cyclin E在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的重要通路。因此，我們隨后使用蛋白酶體抑制劑MG132處理細(xì)胞。結(jié)果顯示與對(duì)照細(xì)胞(DMSO處理組)相比，MG132可有效抑制清熱利濕飲導(dǎo)致的Cyclin E蛋白表達(dá)下調(diào)(圖2a)，提示清熱利濕飲通過促進(jìn)Cyclin E的蛋白酶體依賴的降解而降低其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。

圖2 清熱利濕飲促進(jìn)Cyclin E蛋白泛素化。a.清熱利濕飲處理組和對(duì)照組細(xì)胞使用30 μM的MG132(DMSO為溶劑)或含等體積DMSO的DMEM培養(yǎng)基處理3 h后，收取細(xì)胞提取總蛋白進(jìn)行western blot。b.提取清熱利濕飲處理組和對(duì)照組細(xì)胞總蛋白，蛋白定量后取等量蛋白使用anti-Cyclin E抗體進(jìn)行IP。IP的蛋白使用anti-Ubiquitin和anti-Cyclin E抗體進(jìn)行western blot。

蛋白泛素化是促進(jìn)蛋白被蛋白酶體識(shí)別而進(jìn)一步被后者降解的重要信號(hào)。為了進(jìn)一步明確清熱利濕飲調(diào)控Cyclin E的機(jī)制，我們檢測(cè)了清熱利濕飲對(duì)Cyclin E泛素化的影響。我們使用Cyclin E的抗體進(jìn)行IP并對(duì)利用抗泛素抗體檢測(cè)Cyclin E的泛素化水平。結(jié)果顯示與對(duì)照細(xì)胞相比，清熱利濕飲處理細(xì)胞內(nèi)Cylin E蛋白泛素化水平有明顯上調(diào)(圖2b)。這些結(jié)果顯示清熱利濕飲促進(jìn)Cyclin E蛋白泛素化，從而導(dǎo)致其蛋白酶體依賴的降解加速。

2.3 清熱利濕飲促進(jìn)E3泛素連接酶(FBW7)的表達(dá) E3泛素連接酶SCF-FBW7在調(diào)控Cyclin E泛素化中發(fā)揮著重要功能。因此，我們隨后檢測(cè)了FBW7的表達(dá)。結(jié)果顯示與對(duì)照細(xì)胞相比，清熱利濕飲處理細(xì)胞內(nèi)FBW7的蛋白和mRNA水平均有明顯上調(diào)(圖3a、3b)。隨后我們使用siRNA干擾FBW7的表達(dá)。結(jié)果顯示抑制FBW7的表達(dá)可有效恢復(fù)因清熱利濕飲處理導(dǎo)致的Cyclin E蛋白表達(dá)下調(diào)(圖3c),提示清熱利濕飲可通過上調(diào)FBW7的表達(dá)，促進(jìn)Cylin E的泛素化和蛋白降解。

圖3 通過促進(jìn)FBW7的表達(dá)實(shí)現(xiàn)抑制Cyclin E的蛋白水平。a.利用western blot分析清熱利濕飲處理組HaCaT細(xì)胞與對(duì)照組HaCaT細(xì)胞內(nèi)FBW7蛋白的表達(dá)。b.含80 μg/mL清熱利濕飲或?qū)φ盏腄MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞48 h，收取細(xì)胞提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，利用實(shí)時(shí)定量PCR分析FBW7的mRNA含量，以GAPDH mRNA為內(nèi)參 (*，≤0.05，非配對(duì)t檢驗(yàn))。c.轉(zhuǎn)染干擾FBW7的siRNA (80 nM)或等量的陰性對(duì)照siRNA入HaCaT細(xì)胞，轉(zhuǎn)染8 h后換含80 μg/mL清熱利濕飲或?qū)φ盏腄MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h，收取細(xì)胞提取總蛋白進(jìn)行western blot分析

3 討論

角質(zhì)形成細(xì)胞過度增生是銀屑病皮損的重要特征之一[6]。因此，抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖是治療銀屑病的重要靶點(diǎn)之一[7]。我們前期研究結(jié)果顯示清熱利濕飲可導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞增殖減慢，DNA合成障礙并且在轉(zhuǎn)錄后水平抑制Cyclin E蛋白的表達(dá)[3]。在本研究中我們進(jìn)一步對(duì)清熱利濕飲轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控Cyclin E的機(jī)制進(jìn)行了探討。我們發(fā)現(xiàn)清熱利濕飲可促進(jìn)Cyclin E泛素化。泛素化是蛋白修飾的重要方式之一，存在于生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等幾乎所有生物學(xué)過程[8，9]。多泛素化可導(dǎo)致底物蛋白被26S蛋白酶體降解，是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控蛋白表達(dá)的重要途徑[10]。我們的研究也顯示使用蛋白酶體抑制劑MG132可明顯恢復(fù)清熱利濕飲導(dǎo)致的Cyclin E蛋白減少，說明清熱利濕飲可促進(jìn)Cyclin E的泛素化從而導(dǎo)致其被蛋白酶體降解。Cyclin E在細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)換中扮演著重要的角色，其高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖，并且Cyclin E在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，被認(rèn)為是重要的促癌基因[11，12]。此外有研究發(fā)現(xiàn)Cyclin E在銀屑病皮損中高表達(dá)[13]，提示Cyclin E表達(dá)失調(diào)可能是導(dǎo)致銀屑病的原因之一，因此下調(diào)Cyclin E表達(dá)從而抑制角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖是治療銀屑病的潛在有效途徑。我們的結(jié)果則提示促進(jìn)Cyclin E泛素化蛋白降解可能是清熱利濕飲治療銀屑病的機(jī)制之一。

在泛素化這一過程中，E3泛素連接酶負(fù)責(zé)底物的特異性選擇，因此被認(rèn)為是調(diào)控的核心[14]。Cyclin E泛素化受到包括SCF-FBW7和CRL4等多種E3泛素酶的影響[15，16]。我們研究顯示清熱利濕飲導(dǎo)致FBW7蛋白和mRNA的增多，而利用siRNA干擾其表達(dá)可部分恢復(fù)清熱利濕飲導(dǎo)致的Cyclin E表達(dá)下調(diào)，說明清熱利濕飲通過調(diào)控FBW7的表達(dá)從而影響Cyclin E的泛素化。由于FBW7的mRNA也有明顯上調(diào)，提示清熱利濕飲對(duì)FBW7的調(diào)控是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。需要指出的是，在實(shí)驗(yàn)中我們利用siRNA 干擾FBW7的表達(dá)。盡管siRNA干擾后清熱利濕飲處理細(xì)胞內(nèi)FBW7的表達(dá)與對(duì)照細(xì)胞相比沒有明顯差異，但也只能部分恢復(fù)清熱利濕飲導(dǎo)致的Cyclin E的蛋白減少，說明清熱利濕飲轉(zhuǎn)錄后調(diào)控Cyclin E表達(dá)還有非依賴FBW7的生物學(xué)途徑。總之，這些結(jié)果表明清熱利濕飲治療銀屑病的部分療效是通過抑制Cyclin E的表達(dá)而進(jìn)一步對(duì)異常增生角質(zhì)細(xì)胞的增殖進(jìn)行抑制而實(shí)現(xiàn)的。此外，鑒于FBW7在Cyclin E表達(dá)調(diào)控以及細(xì)胞增殖中的重要作用，針對(duì)其開發(fā)相應(yīng)的靶向藥物也可能成為未來銀屑病治療的可選方法之一。

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(收稿：2016-09-29 修回：2016-11-16)

The expression of Cyclin E affected by Qingrelishi recipe through regulating FBW7 in HaCaT cells

SUNShuna1,HUANGQiteng1,WEIHaifeng2,LIGuangyuan3,ZHAOYing1,ZHANGXiaojie1.

1.DepartmentofDermatology,AffiliatedHospitalofShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250012,China; 2.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250355,China; 3.AgriculturalBankofChinaShandongBranch,Jinan250014,China

ZHANGXiaojie,E-mail:qlzxj@126.com

Objective: To determine the mechanism of the expression of Cyclin E affected by Qingrelishi recipe in HaCaT cells. Methods: Half-life of Cyclin E in HaCaT cells was detected by Western blot. The ubiquitination level of Cyclin E was detected through IP and Western blot. The level of ubiquitin ligase E3 SCF-FBW7 affected by Qingrelishi recipe was detected by Western blot and Real-time PCR. Results: Compared with control group, the Half-life of Cyclin E was shorter, the ubiquitination level and the degradation speed of Cyclin E were higher and the level of FBW7 mRNA and protein was higher in the Qingrelishi recipe group. Conclusion: Qingrelishi recipe can inhibit the Cyclin E expression through the regulation of FBW7.

Qingrelishi recipe; Cyclin E; ubiquitination; FBW7

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：ZR2012HM075)

1山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，濟(jì)南,250011 2山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南,250355 3中國(guó)農(nóng)業(yè)銀行山東分行，濟(jì)南,250014