劉玲 翁澤斌 王恒 朱星宇 陳志鵬 吳麗

[摘要]研究青娥丸方中3種有效成分京尼平苷酸、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)過程與其抗骨質(zhì)疏松作用的相關(guān)性。該實驗通過大鼠灌胃給藥青娥丸生品與鹽炙品后，選取不同時間點進(jìn)行眼眶取血，采用UHPLCMS/MS測定大鼠血漿中京尼平苷酸、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的藥物濃度，繪制藥時曲線；以成骨細(xì)胞的增殖率為藥效學(xué)指標(biāo)，采用MTT法測定不同時間點含藥血清作用于成骨細(xì)胞后的增殖率，繪制時效曲線。比較時效曲線和藥時曲線可以發(fā)現(xiàn)，在成骨細(xì)胞的增殖率達(dá)到峰值時，京尼平苷酸和補(bǔ)骨脂素的血藥濃度也在峰值附近，表明兩者具有較好的相關(guān)性。而異補(bǔ)骨脂素的血藥濃度峰值相對于藥效峰值具有一定的滯后性。將青娥丸生品及鹽炙品各成分的時效曲線與藥時曲線進(jìn)行擬合，進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)鹽炙品組各成分的相關(guān)性略高于生品組。上述實驗結(jié)果表明，青娥丸中京尼平苷酸、補(bǔ)骨脂素的藥時曲線和時效曲線具有良好的相關(guān)性，且與生品相比，青娥丸鹽炙品中兩者的相關(guān)性更高。

[關(guān)鍵詞]青娥丸； 藥動學(xué)； 藥效學(xué)； 京尼平苷酸； 補(bǔ)骨脂素； 異補(bǔ)骨脂素

Analysis on pharmacokineticspharmacodynamics correlation of

effective ingredients of Qing′e wan

LIU Ling1，2， WENG Zebin3， WANG Heng1，2， ZHU Xingyu1，2， CHEN Zhipeng1，2， WU Li1，2， LI Weidong1，2*

（1 Jiangsu Key Laboratory of Chinese Medicine Processing， Nanjing University of Chinese Medicine， Engineering Center

for Standardization of Traditional Chinese Medicine Processing under State Ministry of Education， Nanjing 210046， China；

2 Pharmacy College of Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210046， China；

3 China Pharmaceutical University， Nanjing 210009， China）

[Abstract]To study the pharmacokinetics of three active ingredients in Qing′e wan， namely geniposidic acid， psoralen and isopsoralen， in rats， in order to investigate their correlation in the antiosteoporotic effect The rats were taken blood from their eye sockets at different time points after being orally administered with raw and saltprocessed Qing′e wan Geniposidic acid， psoralen and isopsoralen in rats plasma were determined by means of UHPLCMS/MS to draw the concentrationtime curve The proliferation rate of osteoblasts was taken as the pharmacodynamic index， and determined by MTT method to draw effecttime curve In comparison between the effecttime curve and the concentrationtime curve， the blood concentrations of geniposidic acid and psoralen were close to the peak when the cell proliferation rate reached its peak， indicating a good correlation between them The peak blood concentration of isopsoralen was slightly lagging behind the peak of efficacy According to the correlation analysis after fitting the effecttime curve and the concentrationtime curve， saltprocessed Qing′e wan had a better correlation than the raw one The above experimental results showed that the effecttime curve and the concentrationtime curve of geniposidic acid and psoralen had a good correlation， and the correlation of saltprocessed Qing′e wan was better than the raw one

[Key words]Qing′e wan； pharmacokinetics； pharmacodynamics； geniposidic acid； psoralen； isopsoralen

doi：10.4268/cjcmm20162323

青娥丸首載于宋代《太平惠民和劑局方》，并收載于2015年版《中國藥典》，主要用于治療腎虛腰痛，起坐不利，膝軟乏力。處方組成為鹽杜仲、鹽補(bǔ)骨脂、核桃仁（炒）以及大蒜[1]。

方中君藥杜仲能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，抑制破骨細(xì)胞活性[2]。研究表明，杜仲中京尼平苷酸、紫云英苷、黃芩苷、咖啡酸4種成分有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟的能力，是杜仲抗骨質(zhì)疏松的活性成分。其中京尼平苷酸還能抑制成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化為破骨細(xì)胞[3]。臣藥補(bǔ)骨脂能刺激成骨細(xì)胞增殖，減少骨量丟失[4]；還有很強(qiáng)的雌激素樣作用[5]。補(bǔ)骨脂中主要活性成分為香豆素類，包括補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素等。補(bǔ)骨脂素具有植物雌激素作用[6]，能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟[7]，抑制破骨細(xì)胞分化成熟[8]；異補(bǔ)骨脂素也具有雌激素樣作用[9]，可選擇性作用于雌激素受體，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟[10]，還能與鋅聯(lián)合應(yīng)用協(xié)同增效，促進(jìn)成骨細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)[11]，是補(bǔ)骨脂治療骨質(zhì)疏松的活性成分?；诜街卸胖佟⒀a(bǔ)骨脂藥材的主要功效，結(jié)合兩者主要化學(xué)成分的藥理作用，復(fù)方青娥丸目前在臨床上主要用于治療骨質(zhì)疏松癥[1213]。實驗采用UHPLCMS/MS監(jiān)測青娥丸方中有效成分的藥動學(xué)變化，以青娥丸生品與鹽品含藥血清對成骨細(xì)胞的增殖率為效應(yīng)指標(biāo)，評價青娥丸有效成分與其抗骨質(zhì)疏松作用的相關(guān)性，進(jìn)一步探討青娥丸抗骨質(zhì)疏松的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

1材料

11儀器與試劑

液相色譜輸液泵（LC10ATvp泵，日本島津公司）；5500 MS系統(tǒng)三重四級桿質(zhì)譜儀（美國ABSCIEX公司）；BEHC18分析柱（21 mm×100 mm， 17 μm，Water公司）；C18保護(hù)柱（21 mm×10 mm， 17 μm，Water公司）。

京尼平苷酸（純度>990%，四川維克奇生物科技有限公司）；大黃酸（純度>990%，中國食品藥品檢定研究院）；補(bǔ)骨脂素（純度>990%，上海友思生物技術(shù)有限公司）；異補(bǔ)骨脂素（純度>990%，上海友思生物技術(shù)有限公司）；濱蒿內(nèi)酯（純度>990%，上海友思生物技術(shù)有限公司）；甲醇（色譜純，加拿大Calepure公司）；甲酸（化學(xué)純，德國Merk公司）；去離子水為實驗室自制。

青娥丸生品：杜仲、補(bǔ)骨脂、核桃仁、大蒜，以上4味按2015年版《中國藥典》制丸；青娥丸鹽炙品：將杜仲、補(bǔ)骨脂生品按藥典標(biāo)準(zhǔn)鹽炙后，加核桃仁、大蒜按藥典標(biāo)準(zhǔn)制丸。

12實驗動物

SpragueDawley大鼠，雌性各半，體重180～220 g（南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心），動物合格證號SCXK（滬）20080016。

13細(xì)胞培養(yǎng)

絕經(jīng)后婦女松質(zhì)骨組織由江蘇省中醫(yī)院骨科提供，無菌條件取出絕經(jīng)后婦女股骨松質(zhì)骨組織，PBS沖洗3遍。剪成1 mm×1 mm×1 mm的骨片。放入培養(yǎng)皿（瓶）中，加入αMEM培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗3遍，加入胰酶消化1 h，血清終止消化。加入含10%胎牛血清的αMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，每48 h更換培養(yǎng)液。7～14 d后細(xì)胞開始貼壁。細(xì)胞匯合鋪滿細(xì)胞瓶后，使用胰蛋白酶消化，1∶3傳代培養(yǎng)，實驗采用P3代細(xì)胞。

2方法

21青娥丸生品及鹽炙品的制備

取青娥丸生品和鹽炙品各10 g，置于圓底燒瓶內(nèi)，精密加入超純水100 mL，加熱回流提取40 min，過濾，減壓濃縮至01 g·mL-1，備用。

22供試品溶液中京尼平苷酸含量的測定

取21項制備的樣品，分別精密吸取青娥丸生品和鹽炙品供試品溶液各1 mL，用純水稀釋10倍，過濾（045 μm微孔濾膜），取續(xù)濾液作為供試品溶液。采用上述色譜條件，測定供試品溶液中京尼平苷酸、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量，其中生品中京尼平苷酸、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2126，2148，1563 mg·g-1；鹽炙品中京尼平苷酸、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3147，2159，2053 mg·g-1。

23藥代動力學(xué)試驗

231UHPLCMS/MS測定條件液相條件：流動相01%甲酸水溶液（A）乙腈（B），梯度洗脫，0～2 min，5%～50%B，2～5 min，50%～95%B，5～6 min，95%B，6～61min，95%～5%B，流速03 mL·min-1；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

負(fù)離子模式質(zhì)譜條件：離子源為ESI源；CUR：35 psi（1 psi=6895 kPa）；CAD：8 V；IS：5 500 N；TEM：550 ℃；GS1：55 psi；GS2：55 psi；CE：-181 V；DP：-550 V；EP：-140 V；CXP：-90 V。用于定量分析的離子分別為[M+H]+m/z 3729/1229（京尼平苷酸）和m/z 2821/1830 （大黃酸）。

正離子模式質(zhì)譜條件：離子源為ESI源；CUR：35 psi；CAD：8 V；IS：5 500 N；TEM：600 ℃；GS1：50 psi；GS2：60 psi；CE：3022 V；DP：8613 V；EP：653 V；CXP：969 V。用于定量分析的離子分別為[M+H]+m/z 1872/1310（補(bǔ)骨脂和異補(bǔ)骨脂素）和m/z 2072/1511（濱蒿內(nèi)酯）。

232血清樣品的采集及處理SD大鼠12只，隨機(jī)分為生品組和鹽炙品組，每組6只，實驗前12 h禁食不禁水，實驗期間自由飲水，實驗12 h后進(jìn)水。按照青娥丸水提物001 mL·g-1的灌胃劑量給藥。分別于給藥后010，025，050，075，100，150，250，400，600，1000，1200，2400 h經(jīng)大鼠眼球后靜脈叢采血約05 mL，置肝素化試管中，3 000 r·min-1離心10 min，分離血清，-20 ℃冷凍保存，備用。

取大鼠血清樣品100 μL置于10 mL具塞離心試管中，加入內(nèi)標(biāo)液10 μL，搖振，再加入300 μL乙腈，渦旋混合3 min，4 000 r·min-1離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至小EP管中，12 000 r·min-1高速離心3 min，取上清液5 μL用于UHPLCMS/MS分析。

24藥效學(xué)實驗

選擇對數(shù)生長期中生長旺盛的人成骨細(xì)胞，按細(xì)胞密度為8×103個/孔，接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h，棄去原培養(yǎng)液，換無血清培養(yǎng)液，饑餓細(xì)胞24 h，棄去無血清培養(yǎng)液，向96孔板中加入20%濃度的各時間點含藥血清培養(yǎng)液，以含10%胎牛血清的培養(yǎng)液為空白對照，每藥重復(fù)6個孔，每孔100 μL，分別培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)液，加入5 g·L-1 的MTT溶液50 μL，37 ℃培養(yǎng)4 h后，吸凈上清液，每孔加入150 μL DMSO，在搖床上振搖10 min使結(jié)晶充分溶解，用酶標(biāo)儀在490 nm處測定吸光值。細(xì)胞增殖率=（A樣品-A空白）/（A對照-A空白）×100%。

25統(tǒng)計學(xué)處理

實驗中所有項目檢測數(shù)據(jù)均以±s表示，采用Excel軟件和藥動學(xué)計算程序DAS 20處理，組間比較采用t檢驗。

3結(jié)果

31藥動學(xué)結(jié)果

青娥丸生品及鹽炙品的水提物灌胃給藥后，采用已建立的UHPLCMS/MS分析方法，測定給藥后不同時間點的大鼠血漿樣品中京尼平苷酸、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的濃度，結(jié)果見圖1。動力學(xué)參數(shù)通過DAS 20軟件進(jìn)行處理，京尼平苷酸在大鼠體內(nèi)的主要藥動學(xué)參數(shù)見表1。從圖1可知，灌胃給藥青娥丸生品和鹽炙品后京尼平苷酸、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的藥時濃度曲線差異比較明顯，表明鹽炙對青娥丸中成分體內(nèi)吸收影響較大。從表1的藥代動力學(xué)參數(shù)可見，青娥丸鹽炙品組京尼平苷酸的Cmax，補(bǔ)骨脂素MRT和Tmax，異補(bǔ)骨脂素的AUC，MRT，Tmax與生品組相比具有顯著性差異，其他參數(shù)也有不同程度的升高，可能與鹽炙增加了有效成分的溶出有關(guān)。

32藥效學(xué)結(jié)果

青娥丸生品及鹽炙品的水提物灌胃給藥后，不同時間點的血清對成骨細(xì)胞具有一定的促增殖作用，其時間效應(yīng)曲線見圖2。

33藥動學(xué)與藥效學(xué)相關(guān)性分析

采用 DAS 20 軟件，對京尼平苷酸、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素血藥濃度（X）與成骨細(xì)胞增殖率（Y） 進(jìn)行量效關(guān)系分析，用散點相關(guān)法，X取對數(shù)進(jìn)行作圖，見圖3，以Y=a+b·lnX數(shù)學(xué)模型進(jìn)行擬合，結(jié)果見表2。

由圖3可以看出，京尼平苷酸、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的血藥濃度與青娥丸生品及鹽炙品含藥血清促成骨細(xì)胞增殖能力之間具有良好的相關(guān)性，當(dāng)京尼平苷酸血藥濃度達(dá)到最大值時，其成骨細(xì)胞增殖率也達(dá)到最大值；當(dāng)成骨細(xì)胞增殖率達(dá)到最大值時，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的血藥濃度也接近最大值，顯示具有良好的相關(guān)性。

4討論

根據(jù)受體動力學(xué)原理，藥物進(jìn)入機(jī)體后，先與體內(nèi)特殊部位如受體相結(jié)合才能產(chǎn)生效應(yīng)，藥效強(qiáng)度與藥物在靶部位的濃度相關(guān)。由于靶部位的藥物濃度難以直接測定，一般通過檢測血液中藥物的濃度間接反映靶部位藥物濃度，并以其預(yù)測藥效強(qiáng)度，指導(dǎo)臨床用藥。但有時靶部位藥物濃度與血藥濃度并不一致，藥效的消長規(guī)律也不一定與血藥濃度變化過程完全同步。因此，研究藥物動力學(xué)和藥效動力學(xué)的相互關(guān)系，建立兩者的相關(guān)性模型，對臨床合理用藥以及研究藥物體內(nèi)過程和作用機(jī)制具有重要意義。

現(xiàn)代研究表明，杜仲鹽炙后能促進(jìn)京尼平苷酸的吸收，增加其生物利用度[14]。補(bǔ)骨脂中補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素在大鼠血液中的吸收與消除過程都較慢[15]，鹽炙后能促進(jìn)補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的體內(nèi)吸收[16]。現(xiàn)有的研究大多關(guān)注于單味藥材中單體化合物的藥效學(xué)或藥動學(xué)，未將兩者結(jié)合，也鮮有研究中藥復(fù)方活性成分PKPD的相關(guān)性。而中醫(yī)藥治療疾病，基本是將中藥配伍成復(fù)方用于臨床，或制成不同劑型后進(jìn)入體內(nèi)起效，所以對于中藥復(fù)方的研究尤為重要。本實驗以復(fù)方青娥丸為研究對象，將京尼平苷酸、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的藥動學(xué)與其促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖作用的藥效學(xué)結(jié)果相結(jié)合，探討3種成分藥動學(xué)與抗骨質(zhì)疏松作用藥效學(xué)的相關(guān)性，更能闡明復(fù)方青娥丸抗骨質(zhì)疏松作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，從而更好地指導(dǎo)臨床用藥，該研究模式將在中藥復(fù)方的研究中起到一定的示范作用。

實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，灌胃給予生品及鹽炙品青娥丸水提液后，大鼠含藥血清對成骨細(xì)胞的增殖均有促進(jìn)作用，且鹽炙品的效果較好。比較時間效應(yīng)曲線和血藥濃度時間曲線可以發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞增殖率達(dá)到峰值時，京尼平苷酸和補(bǔ)骨脂素的血藥濃度也在峰值附近，兩者具有較好的相關(guān)性。異補(bǔ)骨脂素的血藥濃度峰值相對藥效峰值具有一定的滯后性。比較生品及鹽炙品各成分的藥動藥效相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，鹽炙品組各成分的相關(guān)性略高于生品組（異補(bǔ)骨脂素除外）。揭示鹽炙后青娥丸中京尼平苷酸和補(bǔ)骨脂素與藥效的相關(guān)性更高。

由于中藥藥效是多種成分相互協(xié)同作用的結(jié)果，故以中藥某一單體成分進(jìn)行藥動學(xué)和藥效學(xué)研究，并不能完全反映中藥復(fù)方的真實情況。后續(xù)實驗中，應(yīng)建立中藥多成分、多靶點的藥動學(xué)和藥效學(xué)研究，并建立合適的數(shù)學(xué)模型，更好的為臨床用藥提供參考。

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[責(zé)任編輯曹陽陽]