馬忠賢

(清豐縣畜牧獸醫(yī)服務(wù)中心,河南清豐457300)

淺談豬病檢測中多重PCR技術(shù)的運用

馬忠賢

(清豐縣畜牧獸醫(yī)服務(wù)中心,河南清豐457300)

多重PCR技術(shù)具體指的是一種分子診斷技術(shù),通過該技術(shù)的應(yīng)用可以在同一個反應(yīng)體系中在同一時間內(nèi)進行多個目的片段的擴增,具備有特異,敏感,快捷等眾多優(yōu)勢,非常適合在大量的臨床樣本中展開快速檢測。本文講述了多重PCR技術(shù)的一些技術(shù)原理,以及進豬病檢測中多重PCR技術(shù)的具體應(yīng)用進行了分析。

；豬病檢測;多重PCR技術(shù);應(yīng)用

聚合酶鏈式反應(yīng)反應(yīng)，也用PCR表示，具體是指體外酶促進合成的一種反應(yīng)，可以實現(xiàn)對特點DNA序列的大量擴增，是在生物學(xué)技術(shù)中經(jīng)常會被用到的一個技術(shù)，現(xiàn)階段已經(jīng)在生命科學(xué)的多個領(lǐng)域中得到了應(yīng)用。伴隨著人們對PCR技術(shù)的不斷深入研究，PCR技術(shù)已經(jīng)成功衍生出了多種新技術(shù)，特別是多重PCR技術(shù)，該技術(shù)可以在病原診斷中發(fā)揮出非常重大的作用。

1 多重PCR技術(shù)的一些基本原理

多重PCR技術(shù)在范圍內(nèi)屬于PCR眾多技術(shù)中的其中一個，最早是在1988年提出的，多重PCR技術(shù)具備有實驗進程比較快，試驗成本非常高，高效快捷，敏感性強，特異性強等多種優(yōu)點，如今已經(jīng)在微生物，動物以及人類研究中都得到了非常廣泛的應(yīng)用。該技術(shù)的原理和PCR技術(shù)的原理幾乎一樣，即可以在同一個反應(yīng)體系中進行多對或者是兩對特異性引物的加入，同時使DNA序列或者是目的基因得以擴增。

2 豬病檢測中多重PCR技術(shù)的應(yīng)用

2.1 常規(guī)豬病的診斷

多重PCR技術(shù)在常規(guī)豬病診斷中的應(yīng)用主要包括有兩個方面，其一，對病毒進行常規(guī)檢測。焦洋等學(xué)者以豬流行性腹瀉病毒的基因序列，豬博卡病毒的基因序列以及豬傳染性胃腸炎的基因序列作為基礎(chǔ)進行了三對特異性印務(wù)的設(shè)計，從而建立了這三種病毒基因的多重PCR方法，通過該方法對60份的臨床樣品進行檢測，從而得出豬博卡病毒的基因序列陽性率是21.7%，豬流行性腹瀉病毒的基因序列陽性率是6.7%，豬傳染性胃腸炎的基因序列陽性率是1.6%。Ogawa等學(xué)者展開了豬水泡病毒1型（SUHV-1），豬輪狀病毒A型（PPV，PRRSV，JEV，PEDV，GAR），檢測蓋塔病毒（GETV）的9重PCR檢測方法的建立，并且用75份臨床樣本對該方法展開檢測，發(fā)現(xiàn)結(jié)果和普通PCR技術(shù)的結(jié)果沒有差異，因此可以證明該方法具備有非常良好的特異性以及靈敏性。其二，對細菌的常規(guī)檢測。Rossi等學(xué)者將SCAR片段作為基礎(chǔ)進行三重PCR的建立從而實現(xiàn)對胸膜肺炎放線桿菌，多殺性巴氏桿菌以及嗜血桿菌的建立，得出該方法和普通的PCR所得方法結(jié)構(gòu)基本保持一致，因此可以證明多重PCR技術(shù)在流行性冰雪以及診斷病學(xué)中發(fā)揮著非常重要的意義。安俊卿等學(xué)者以大腸埃希菌23rRNA基因，多殺性巴氏桿菌，沙門菌hut基因為基礎(chǔ)進行三對特異性引物的合成，借助優(yōu)化反應(yīng)的條件進行PCR技術(shù)的建立，最終證明該方面具備有穩(wěn)定性比較好，靈敏度比較高，特異性比較強等優(yōu)勢，可以在混合的眾多病料中非常清楚的將3中病原菌成功的檢測出來[1]。

2.2 在豬病分型方面的鑒別

多重PCR技術(shù)在病豬分型方面的檢測也可以分為以下兩種，其一，在病毒分型方面的檢測，王曉波等學(xué)者將GenBank中所公布出來的序列作為基礎(chǔ)對呼吸綜合征病毒，經(jīng)典豬繁殖，高致病豬繁殖展開了特異性引物的設(shè)計，并且講多重RT-PCR技術(shù)展開的建立以及優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以借助這兩種=對引物實現(xiàn)對三種病毒的實時檢測。徐磊等學(xué)者將源性病毒2型b序列，2型a序列，圓形病毒1系列展開特異性引物的設(shè)計，同時在優(yōu)化反映條件之下展開了三重PCR技方法的建立，結(jié)果可以證明該方法具備有引物特異性非常良好，靈敏性非常高等特點，同時各個引物之間并沒有出現(xiàn)各類交叉反映。其二，對細菌分型的檢測。LiuZ等學(xué)者借助全基因組測序展開了特異性引物的設(shè)計，從而實現(xiàn)了對多重PCR技術(shù)的建立，采用該方法對鏈球菌展開鑒別診斷，最終結(jié)果是，通過多重PCR四次之后，成功的將33種血清型鑒別出來[2]。

2.3 和其他技術(shù)的結(jié)合以及創(chuàng)新應(yīng)用

其一，和熒光定量PCR技術(shù)相結(jié)合。王乃富[3]等學(xué)者價將豬水泡病病毒，水泡性口炎，口蹄疫病毒的蛋白編碼基因作為依據(jù)進行了特異性探針以及引物的設(shè)計，從而建立可以可以在同一時間對三種病毒展開檢測的多重熒光RT-PCR檢測方法。通過擴增結(jié)果顯示，該方法具有特異性良好并且靈敏度非常高等特點，可以實現(xiàn)對混合感染病毒的同一時間的檢測。其二，和LAMP技術(shù)的有效結(jié)合，Park等學(xué)者對可以使豬換上增生性腸病的勞森氏菌中包含的不同基因展開了四段引物的設(shè)計，并且將LAMP技術(shù)和PCR技術(shù)展開有效的結(jié)合，最后得出結(jié)果證明該方法具備有特異性性特別強的優(yōu)勢，同時該技術(shù)的靈敏性和RT-PCR進行比較有明顯的提升，使檢測時間以及試劑成本都得到了節(jié)約[4]。

3 結(jié)語

綜上所述，多重PRC技術(shù)具備有靈敏度比較高，特異性非常好，高效并且快速等眾多優(yōu)點，可以在流行病以及病原檢測方面發(fā)揮出費查清重要的作用，因此需要人們給予多重PCR技術(shù)一定的重視，增加該技術(shù)和其他技術(shù)的結(jié)合，從而使多重PCR技術(shù)可以獲得更加廣泛的應(yīng)用，使多重PCR技術(shù)可以在病學(xué)研究中發(fā)揮出更大的價值。

[1] 王隆柏，張志剛，蘇永裕，等.5種豬病多重PCR檢測方法的建立[J].中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（2）：21-25.

[2] 馬銳，黃小波，楊國淋，等.多重PCR技術(shù)在豬病檢測中的應(yīng)用[J].四川畜牧獸醫(yī)，2016，43（5）：31-33.

[3] 楊顯榮.豬病診斷和防治過程中PCR技術(shù)的應(yīng)用[J].當代畜禽養(yǎng)殖業(yè)，2016，（11）：8，9.

馬忠賢（1964—），男，清豐人，獸醫(yī)師，主要從事畜禽疫病防治技術(shù)推廣。