馬忠賢

(清豐縣畜牧獸醫(yī)服務(wù)中心,河南清豐457300)

淺談豬病檢測(cè)中多重PCR技術(shù)的運(yùn)用

馬忠賢

(清豐縣畜牧獸醫(yī)服務(wù)中心,河南清豐457300)

多重PCR技術(shù)具體指的是一種分子診斷技術(shù),通過該技術(shù)的應(yīng)用可以在同一個(gè)反應(yīng)體系中在同一時(shí)間內(nèi)進(jìn)行多個(gè)目的片段的擴(kuò)增,具備有特異,敏感,快捷等眾多優(yōu)勢(shì),非常適合在大量的臨床樣本中展開快速檢測(cè)。本文講述了多重PCR技術(shù)的一些技術(shù)原理,以及進(jìn)豬病檢測(cè)中多重PCR技術(shù)的具體應(yīng)用進(jìn)行了分析。

；豬病檢測(cè);多重PCR技術(shù);應(yīng)用

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)，也用PCR表示，具體是指體外酶促進(jìn)合成的一種反應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)特點(diǎn)DNA序列的大量擴(kuò)增，是在生物學(xué)技術(shù)中經(jīng)常會(huì)被用到的一個(gè)技術(shù)，現(xiàn)階段已經(jīng)在生命科學(xué)的多個(gè)領(lǐng)域中得到了應(yīng)用。伴隨著人們對(duì)PCR技術(shù)的不斷深入研究，PCR技術(shù)已經(jīng)成功衍生出了多種新技術(shù)，特別是多重PCR技術(shù)，該技術(shù)可以在病原診斷中發(fā)揮出非常重大的作用。

1 多重PCR技術(shù)的一些基本原理

多重PCR技術(shù)在范圍內(nèi)屬于PCR眾多技術(shù)中的其中一個(gè)，最早是在1988年提出的，多重PCR技術(shù)具備有實(shí)驗(yàn)進(jìn)程比較快，試驗(yàn)成本非常高，高效快捷，敏感性強(qiáng)，特異性強(qiáng)等多種優(yōu)點(diǎn)，如今已經(jīng)在微生物，動(dòng)物以及人類研究中都得到了非常廣泛的應(yīng)用。該技術(shù)的原理和PCR技術(shù)的原理幾乎一樣，即可以在同一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行多對(duì)或者是兩對(duì)特異性引物的加入，同時(shí)使DNA序列或者是目的基因得以擴(kuò)增。

2 豬病檢測(cè)中多重PCR技術(shù)的應(yīng)用

2.1 常規(guī)豬病的診斷

多重PCR技術(shù)在常規(guī)豬病診斷中的應(yīng)用主要包括有兩個(gè)方面，其一，對(duì)病毒進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)。焦洋等學(xué)者以豬流行性腹瀉病毒的基因序列，豬博卡病毒的基因序列以及豬傳染性胃腸炎的基因序列作為基礎(chǔ)進(jìn)行了三對(duì)特異性印務(wù)的設(shè)計(jì)，從而建立了這三種病毒基因的多重PCR方法，通過該方法對(duì)60份的臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，從而得出豬博卡病毒的基因序列陽性率是21.7%，豬流行性腹瀉病毒的基因序列陽性率是6.7%，豬傳染性胃腸炎的基因序列陽性率是1.6%。Ogawa等學(xué)者展開了豬水泡病毒1型（SUHV-1），豬輪狀病毒A型（PPV，PRRSV，JEV，PEDV，GAR），檢測(cè)蓋塔病毒（GETV）的9重PCR檢測(cè)方法的建立，并且用75份臨床樣本對(duì)該方法展開檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)結(jié)果和普通PCR技術(shù)的結(jié)果沒有差異，因此可以證明該方法具備有非常良好的特異性以及靈敏性。其二，對(duì)細(xì)菌的常規(guī)檢測(cè)。Rossi等學(xué)者將SCAR片段作為基礎(chǔ)進(jìn)行三重PCR的建立從而實(shí)現(xiàn)對(duì)胸膜肺炎放線桿菌，多殺性巴氏桿菌以及嗜血桿菌的建立，得出該方法和普通的PCR所得方法結(jié)構(gòu)基本保持一致，因此可以證明多重PCR技術(shù)在流行性冰雪以及診斷病學(xué)中發(fā)揮著非常重要的意義。安俊卿等學(xué)者以大腸埃希菌23rRNA基因，多殺性巴氏桿菌，沙門菌hut基因?yàn)榛A(chǔ)進(jìn)行三對(duì)特異性引物的合成，借助優(yōu)化反應(yīng)的條件進(jìn)行PCR技術(shù)的建立，最終證明該方面具備有穩(wěn)定性比較好，靈敏度比較高，特異性比較強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，可以在混合的眾多病料中非常清楚的將3中病原菌成功的檢測(cè)出來[1]。

2.2 在豬病分型方面的鑒別

多重PCR技術(shù)在病豬分型方面的檢測(cè)也可以分為以下兩種，其一，在病毒分型方面的檢測(cè)，王曉波等學(xué)者將GenBank中所公布出來的序列作為基礎(chǔ)對(duì)呼吸綜合征病毒，經(jīng)典豬繁殖，高致病豬繁殖展開了特異性引物的設(shè)計(jì)，并且講多重RT-PCR技術(shù)展開的建立以及優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以借助這兩種=對(duì)引物實(shí)現(xiàn)對(duì)三種病毒的實(shí)時(shí)檢測(cè)。徐磊等學(xué)者將源性病毒2型b序列，2型a序列，圓形病毒1系列展開特異性引物的設(shè)計(jì)，同時(shí)在優(yōu)化反映條件之下展開了三重PCR技方法的建立，結(jié)果可以證明該方法具備有引物特異性非常良好，靈敏性非常高等特點(diǎn)，同時(shí)各個(gè)引物之間并沒有出現(xiàn)各類交叉反映。其二，對(duì)細(xì)菌分型的檢測(cè)。LiuZ等學(xué)者借助全基因組測(cè)序展開了特異性引物的設(shè)計(jì)，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)多重PCR技術(shù)的建立，采用該方法對(duì)鏈球菌展開鑒別診斷，最終結(jié)果是，通過多重PCR四次之后，成功的將33種血清型鑒別出來[2]。

2.3 和其他技術(shù)的結(jié)合以及創(chuàng)新應(yīng)用

其一，和熒光定量PCR技術(shù)相結(jié)合。王乃富[3]等學(xué)者價(jià)將豬水泡病病毒，水泡性口炎，口蹄疫病毒的蛋白編碼基因作為依據(jù)進(jìn)行了特異性探針以及引物的設(shè)計(jì)，從而建立可以可以在同一時(shí)間對(duì)三種病毒展開檢測(cè)的多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法。通過擴(kuò)增結(jié)果顯示，該方法具有特異性良好并且靈敏度非常高等特點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)混合感染病毒的同一時(shí)間的檢測(cè)。其二，和LAMP技術(shù)的有效結(jié)合，Park等學(xué)者對(duì)可以使豬換上增生性腸病的勞森氏菌中包含的不同基因展開了四段引物的設(shè)計(jì)，并且將LAMP技術(shù)和PCR技術(shù)展開有效的結(jié)合，最后得出結(jié)果證明該方法具備有特異性性特別強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)該技術(shù)的靈敏性和RT-PCR進(jìn)行比較有明顯的提升，使檢測(cè)時(shí)間以及試劑成本都得到了節(jié)約[4]。

3 結(jié)語

綜上所述，多重PRC技術(shù)具備有靈敏度比較高，特異性非常好，高效并且快速等眾多優(yōu)點(diǎn)，可以在流行病以及病原檢測(cè)方面發(fā)揮出費(fèi)查清重要的作用，因此需要人們給予多重PCR技術(shù)一定的重視，增加該技術(shù)和其他技術(shù)的結(jié)合，從而使多重PCR技術(shù)可以獲得更加廣泛的應(yīng)用，使多重PCR技術(shù)可以在病學(xué)研究中發(fā)揮出更大的價(jià)值。

[1] 王隆柏，張志剛，蘇永裕，等.5種豬病多重PCR檢測(cè)方法的建立[J].中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（2）：21-25.

[2] 馬銳，黃小波，楊國淋，等.多重PCR技術(shù)在豬病檢測(cè)中的應(yīng)用[J].四川畜牧獸醫(yī)，2016，43（5）：31-33.

[3] 楊顯榮.豬病診斷和防治過程中PCR技術(shù)的應(yīng)用[J].當(dāng)代畜禽養(yǎng)殖業(yè)，2016，（11）：8，9.

馬忠賢（1964—），男，清豐人，獸醫(yī)師，主要從事畜禽疫病防治技術(shù)推廣。