王 娣WANG Di 張仁鳳 - 張 彬 程 柏 許 暉 柯春林 - 任茂生 -

(蚌埠學院生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233030)

百里香酚(Thymol)又稱麝香草酚[1]，是百里香屬植物中重要成分，主要存在于百里香精油和百里香活性提取物中。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)百里香酚對常見食品污染菌如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等均有一定抑制作用[1-4]，對鮮切蔬菜、水果等保鮮也有影響，保鮮效果較好[5-7]，但未發(fā)現(xiàn)用于肉類的保鮮中。單核增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)是常見的肉類食品污染菌，致病性很強，可導致人死亡。調(diào)查發(fā)現(xiàn)中國多個省份都有關(guān)于人和動物感染單核增生李斯特氏菌的案例報道[8]，尤其豬肉、牛肉等生鮮食品容易感染李斯特氏菌[9-11]，目前尚未見到有關(guān)百里香酚對食品污染菌單核增生李斯特氏菌的研究報道。

本試驗采用管碟法研究百里香酚對單核增生李斯特氏菌的最小抑制濃度，并研究不同濃度的百里香酚對單核增生李斯特氏菌生長曲線及細胞滲透性的影響；制作百里香酚-殼聚糖復合膜(CH/TO)，并把復合膜應用于豬肉的保鮮中，研究復合膜對豬肉保藏中菌數(shù)的影響，為百里香酚作為一種新型肉類保鮮劑的開發(fā)與應用提供一定參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料、菌種與試劑

豬后腿瘦肉：購自蚌埠家樂福超市；

單核增生李斯特氏菌(Listeriamomocytogenes)：CGMCC1.9144，中國科學院微生物研究所；

胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂培養(yǎng)基(TSA-YE)：上海博微生物科技有限公司；

胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯培養(yǎng)基(TSB-YE)：上海博微生物科技有限公司；

吐溫-80、冰醋酸、丙三醇、葡萄糖：分析純，天津市永大化學試劑有限公司；

DPPH：分析純,東京化成工業(yè)株式會社；

百里香酚：AR級，國藥集團化學試劑有限公司；

殼聚糖：脫乙酰度95%，BR級，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器

恒溫培養(yǎng)箱：PWT-P42B型，華德利科學器材有限公司；

恒溫振蕩箱：HZQ-X500型，上海一恒科學儀器有限公司；

牛津杯：10 mm×7.8 mm×6 mm，中國科歡有限公司；

高速冷凍離心機：KDC-160HR型，安徽中科中佳科學儀器有限公司；

微生物比濁儀：WBS-100型，北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司；

紫外可見分光光度計：TU-1901型，北京普析通用儀器有限責任公司；

電導率儀：DDBJ-350型，齊威儀器有限公司；

質(zhì)構(gòu)儀：TA.XT Plus型，英國Stable Micro Systems公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 百里香酚抑菌活性研究

(1) 不同濃度百里香酚溶液的配置：取1.00 g百里香酚，加入0.5%吐溫-80，用無菌水溶解，配置成濃度為1.00 mg/mL 的原液密封冷藏，備用。

(2) 最小抑菌濃度(MIC)的測定：采用管碟法檢測百里香酚對單核增生李斯特氏菌的最小抑菌濃度(MIC)[12][13]24,53。制作含單核增生李斯特氏菌的TSA-YE平板，將無菌牛津杯置于平皿內(nèi)，注入不同濃度(100.00，50.00，25.00，12.50，6.25 μg/mL)的百里香酚溶液100 μL，做空白對照。

(3) 百里香酚對單核增生李斯特氏菌生長曲線的影響：研究1/2 MIC、1 MIC百里香酚不同濃度對李斯特氏菌生長曲線的影響[14]。在比色管中加入TSB-YE培養(yǎng)基10 mL，使比色管里的菌體濃度在1×106CFU/mL，百里香酚終濃度為1/2 MIC、1 MIC，做空白對照；生長曲線檢測采用微生物比濁儀，每隔1 h測吸光度值A600 nm。

(4) 細胞膜滲透性及細胞中核酸、蛋白質(zhì)泄露的檢測：利用電導率法研究百里香酚對細菌細胞膜的影響[13]52。電導率是衡量溶液離子強度高低的參數(shù)，抑菌劑會破壞微生物細胞膜，使細胞滲透性增強，電解質(zhì)外泄，電導率上升[14]。在260，280 nm處測吸光度值分析細胞中核酸和蛋白質(zhì)的泄露[15]。參照并改進Kong等[16]的方法，將單核增生李斯特氏菌懸液用5%葡萄糖溶液清洗獲得等滲細胞；移取106CFU/mL 菌懸液至無菌比色管中，加入百里香酚使其終濃度為0，1，2 MIC，每隔0.5 h測1次電導率；測細菌核酸(A260)和蛋白質(zhì)(A280)的泄露量。

1.2.2 百里香酚-殼聚糖復合膜(CH/TO)的制作及其性能檢測

(1) CH/TO復合膜的制作：殼聚糖是天然多糖中唯一的陽離子聚合多糖，具有一定抗氧化和抑菌活性[17-18]。將百里香酚和殼聚糖混合制備復合膜，使其在百里香酚膜中含量為0.00%，0.25%，0.50%，1.00%。具體方法：取2.0 g殼聚糖，加入不同量百里香酚(0.25，0.50，1.00 g)，再加入1.0 mL 冰醋酸、1.0 mL丙三醇和200 μL吐溫-80，去離子水定容至100 mL，攪拌混勻后超聲脫氣，40 ℃ 烘干成膜，4 ℃ 冷藏，備用。

(2) CH/TO復合膜的硬度與強度檢測：采用質(zhì)構(gòu)儀檢測百里香酚-殼聚糖復合膜(CH/TO)硬度和穿刺強度。比較不同濃度(0.25%，0.50%，1.00%)百里香酚-殼聚糖復合膜的硬度；選擇直徑2 mm的探針，比較不同濃度百里香酚-殼聚糖復合膜的穿刺力，做空白對照。

(3) CH/TO復合膜對DPPH自由基清除活性：抗氧化試驗參考文獻[19]，比較在15，25 ℃時 CH/TO的抗氧化能力。將CH/TO樣品(3 cm×3 cm)置于50%的乙醇溶液中，每隔1 h取1 mL與4 mL DPPH溶液混勻，避光靜止30 min，于517 nm處測吸光度。DPPH自由基清除能力按式(1)計算：

(1)

式中：

P——DPPH自由基清除率，%；

A0——空白的吸光度值；

Ai——樣品的吸光度值。

1.2.3 CH/TO復合膜對豬肉的保鮮作用

(1) 豬肉保藏中菌落總數(shù)的測定：將豬后腿瘦肉無菌分割成5.0 g肉塊，用殼聚糖膜和百里香酚濃度為1%的CH/TO復合膜包裹，4 ℃冷藏，每隔2 d測定菌落總數(shù)[20]。

(2) 豬肉感官評定：感官評定小組由6人組成，每隔2 d對豬肉的顏色、氣味、百里香味進行綜合評定[21]。按表1采用5點評分法對豬肉進行評分。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌作用研究

表2百里香酚對單核增生李斯特氏菌抑菌圈大小?

Table 2 Inhibitory effect of thymol on the size of inhibitory zone ofListeriamonocytogenes

? “--”表示沒有抑菌圈；不同小寫字母表示同一列數(shù)據(jù)之間有顯著性差異(P<0.05)。

2.1.1 最小抑菌濃度(MIC) 由表2和圖1可知，隨著百里香酚濃度的增加，對單核增生李斯特氏菌的抑菌圈直徑不斷增加，當百里香酚濃度為6.25 μg/mL時，無抑菌圈且牛津杯內(nèi)有少許菌生長。因此確定最小抑菌濃度(MIC)為12.5 μg/mL。

2.1.2 對單核增生李斯特氏菌生長曲線的抑制作用 由圖2 可知，空白對照組中單核增生李斯特氏菌生長正常；而百里香酚濃度為1 MIC時，細菌幾乎不生長；在1/2 MIC濃度下，細菌遲滯期比較長，且菌體生長緩慢，菌數(shù)遠低于空白對照組。

2.1.3 細胞膜滲透性 電導率的改變直接反映出細胞滲透性的變化。由圖3可知，空白對照組電導率變化幅度很小。隨著百里香酚濃度的增加(1 MIC和2 MIC)和時間的延長，電導率值不斷增加，表明有離子釋放出來，可能是一定濃度的百里香酚破壞了單核增生李斯特氏菌的細胞膜滲透性，隨著細胞膜的破壞，細胞內(nèi)組分泄漏所致。

2.1.4 細胞中核酸和蛋白質(zhì)泄露 百里香酚對單核增生李斯特氏菌作用后的菌懸液隨時間的變化情況(A260、A280)見圖4、5。試驗結(jié)果表明，百里香酚能使單核增生李斯特氏菌細胞滲透性增加，使細胞內(nèi)大分子物質(zhì)核酸和蛋白質(zhì)泄漏出來。由圖4、5可知，0.0～0.5 h，吸光度值基本無變化，說明百里香酚抑菌需要作用一段時間，隨著百里香酚濃度的增加和時間的延長，吸光度值開始逐漸增加，并在1.5 h后達到平衡，表明百里香酚破壞了細菌的細胞膜，細胞內(nèi)的核酸和蛋白質(zhì)發(fā)生泄露所致；空白對照組的吸光度則始終未發(fā)生變化，表明細胞中核酸和蛋白質(zhì)的泄露與百里香酚的作用有關(guān)。

2.2 百里香酚-殼聚糖復合膜(CH/TO)的制作及其性能檢測

2.2.1 CH/TO復合膜的制作 由圖6可知，空白的殼聚糖膜顏色比較淡，隨著百里香酚濃度的增加，混合溶液呈現(xiàn)乳白色，可能是吐溫-80乳化作用所致，成膜后膜顏色隨百里香酚濃度的增加而加深，呈淡黃色，同時散發(fā)出百里香酚的獨特芳香氣味。

2.2.2 CH/TO的硬度與穿刺強度 由表3可知，隨著百里香酚濃度的增加，穿刺強度從106.35±2.35逐漸減小至70.6±2.3，硬度從236.7±11.1逐漸降至80.1±7.7，降幅明顯，可能是百里香酚屬疏水性物質(zhì)，會破壞膜的均一性和連續(xù)性，使膜的韌性下降。

? 不同小寫字母表示同一列數(shù)據(jù)之間有顯著性差異(P<0.05)。

2.2.3 DPPH法測定百里香酚-殼聚糖復合膜抗氧化作用

由圖7、8可知，百里香酚能有效清除DPPH自由基，清除率隨百里香酚濃度的增加不斷增大并趨于平衡；溫度對DPPH自由基清除能力也有一定影響，15 ℃效果低于25 ℃，百里香酚濃度為1.00%的CH/TO， 25 ℃溫度下4 h時DPPH自由基清除率超過75%，而15 ℃溫度下DPPH自由基清除率不到60%?？赡芨邷馗欣贒PPH自由基的清除。

2.3 百里香酚-殼聚糖復合膜對豬肉的抑菌保鮮作用

Figure 7 DPPH removal rate of different concentration thymol of compound membrane at 25 ℃

Figure 8 DPPH removal rate of different concentration thymol of compound membrane at 15 ℃

2.3.1 菌落總數(shù)檢測 在NY 5029—2008中規(guī)定，鮮豬肉的菌落總數(shù)標準為≤1×106CFU/g。由圖9可知，在0～2 d 時，殼聚糖膜和CH/TO復合膜包裹的豬肉菌落總數(shù)基本相同，殼聚糖膜包裝的豬肉在第8天超過了NY 5029—2008標準限值，菌落總數(shù)增加了60%，而CH/TO包裝的豬肉，在12 d后菌落總數(shù)仍低于標準限值，只增長了19%，表明百里香酚-殼聚糖復合膜可以有效抑制微生物的生長，延長豬肉的貯藏期。

2.3.2 感官評定 由表4和圖10可知，經(jīng)過10 d的冷藏，使用保鮮膜包裹的豬肉色澤由初始值1增加到最大值5，在第10天肉色失去光澤、發(fā)綠并伴有腐敗臭味。CH/TO復合膜處理后的豬肉，冷藏到10 d色度略增加，沒有出現(xiàn)臭味。

3 結(jié)論

? 不同小寫字母表示同一列數(shù)據(jù)之間有顯著性差異(P<0.05)。

本試驗對百里香酚的抑菌活性進行研究，結(jié)果表明其對食品污染菌單核增生李斯特氏菌具有一定抑菌作用，最小抑菌濃度為12.5 μg/mL；且百里香酚會破壞單核增生李斯特氏菌細胞膜，細胞內(nèi)含物滲出引起電導率變化，使核酸和蛋白質(zhì)發(fā)生泄漏；百里香酚-殼聚糖復合膜性質(zhì)檢測試驗表明膜的硬度和穿刺強度會隨著膜中百里香酚濃度的增加而逐漸降低，且復合膜具有一定抗氧化能力，對DPPH自由基清除率為75%(1.00%百里香酚，25 ℃)；為完善復合膜的性能，后續(xù)試驗將添加不同濃度的乳化劑和塑化劑與百里香酚復合成膜，并用于豬肉油脂的抗氧化研究中；百里香酚-殼聚糖復合膜豬肉保鮮試驗結(jié)果表明復合膜能有效地抑制豬肉中微生物的生長繁殖，降低菌落總數(shù)，延長豬肉的冷藏期，后續(xù)試驗將深入研究百里香酚對豬肉腐敗菌群的抑制作用，進一步提高百里香酚的實際應用價值。

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