張麗娟ZHANG Li-juan 王 正 廖尚高 -

(1. 貴州理工學院食品藥品制造工程學院，貴州 貴陽 550001；2. 湖北醫(yī)藥學院藥學院，湖北 十堰 442000；3. 貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州 貴陽 550004)

九頭獅子草[Peristrophejaponica(Thunb.)Brem.]為爵床科(Acanthaceae)九頭獅子草屬(PeristtropheNees)植物，別名辣葉青藥、尖經(jīng)藥、咳風尖、暈病藥等，其性味辛、涼，具有清肺瀉火、消腫解毒的功能，在貴州省布依族民間廣泛應用于小兒高熱、小兒驚風等病癥的治療[1]。以咽喉清喉片(貴州奧特藥業(yè))和甘果含片(浙江永寧制藥廠)等為代表的具有抗菌、抗病毒、解熱、抗炎作用的中藥制劑，已在市場上獲得了廣泛認可?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，九頭獅子草以烷烴和甾醇類化合物為其主要成分，也含少量黃酮、木脂素類等化合物[2-4]，具有很好的解熱鎮(zhèn)痛[5-6]、鎮(zhèn)咳祛痰、殺菌止癢、抗炎、保肝、抗肝炎病毒[7]等作用。羅忠圣[8]、覃容貴等[9-10]證實，九頭獅子草的各種粗提物對金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌均有較強的抑制作用。但迄今為止，九頭獅子草抗菌活性的有效部位及其相關物質基礎未見報道。本研究擬采用大孔樹脂柱層析將九頭獅子草95%乙醇提取物分成了化學組成不同、極性差異較大的3個部位，分別對各部位進行抗菌活性評價，從中篩選出抗菌活性組分，再應用氣相色譜-質譜聯(lián)用(GC-MS)技術對該活性組分進行化學分析，以期為九頭獅子草的抗菌藥效物質基礎研究及深度開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

九頭獅子草:由貴陽醫(yī)學院藥用植物學及生藥學教研室鑒龍慶德副教授鑒定，為Peristropejaponica(Thunb) Brem的干燥全草；

標準菌株：大腸埃希氏菌(ATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)、銅綠假單胞菌(ATCC 27853)、奇異變形桿菌(ATCC 35659)：美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)；

MH瓊脂培養(yǎng)基、MH肉湯培養(yǎng)基：杭州微生物試劑有限公司；

D101大孔樹脂：天津浩聚樹脂科技有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

桌上式潔凈工作臺：HJ-VD-650型，上海蘇凈實業(yè)有限公司；

電熱恒溫培養(yǎng)箱：HPX-9052MBE型，上海博迅實業(yè)有限公司；

手提式壓力蒸汽滅菌器：YXQ-SG46-280S型，上海博迅實業(yè)有限公司；

GC-MS聯(lián)用儀：Agilent Technologies 7890A型，美國安捷倫科技公司。

1.2 方法

1.2.1 組分制備 稱取干燥九頭獅子草全草250 g，用10倍質量的95%乙醇回流提取2次，每次2 h。合并濾液后濃縮得浸膏18.0 g，D101大孔樹脂濕法上樣，依次用水、80%乙醇、丙酮溶液洗脫，洗脫液分別濃縮至浸膏，得到大極性的組分A、中極性的組分B以及小極性的組分C。臨用前取各組分低溫冷凍干燥成粉末，再用二甲基亞砜配制成所需濃度。

1.2.2 有效組分篩選

(1) 菌懸液的制備：將供試菌株分別接種于MH瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h后，挑取平板上形態(tài)相同的菌落，用滅菌生理鹽水校正菌液濃度至2.40×10-5mol/L。校正后的菌液均在15 min內(nèi)接種[11-12]。

(2) 紙片擴散法抑菌試驗：用無菌棉簽蘸取菌懸液，在瓊脂表面均勻涂布。平板室溫干燥3～5 min后，用無菌鑷子將直徑6 mm的無菌干燥濾紙片貼在已接種測試菌的瓊脂表面，每塊平板貼4片，并用移液槍吸取各組分溶液1 μL，均勻添加在紙片上，每組分每供試菌平行重復3次試驗。將平板置37 ℃孵育18～20 h后觀察結果，測定抑菌圈直徑大小。用二甲基亞砜做陰性對照，慶大霉素(1 280 μg/mL)做陽性對照[11-12]。

(3) MIC及MBC的測定：采用試管2倍稀釋法測定MIC。取15支滅菌試管為一組。其中每組第13、14、15管分別標上肉湯對照、檢測菌對照、溶劑對照。每支試管分別加入MH 肉湯2 mL。取抗菌活性最好的組分用MH肉湯稀釋成60 mg/mL的藥液。吸取2 mL 60 mg/mL的藥液加入到第1 管，混勻后吸取2 mL 加入到第2 管，以此類推，直至第12管。第1～12管的藥物濃度分別為60.00，30.00，15.00，7.50，3.75，1.88，0.94，0.47，0.24，0.12，0.06，0.03 mg/mL。除肉湯對照管外，其余各管均加入菌液0.1 mL，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，觀察生長情況。在對照管符合要求的情況下，以無菌生長的最低稀釋度為MIC。在MIC測定的基礎上，將未見細菌生長的各管培養(yǎng)物渦旋混勻后，分別吸取0.1 mL接種于2塊MH固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)18 h。用活菌計數(shù)法測定平板上的菌落，平均數(shù)小于5個的最小稀釋度的藥物濃度即為MBC。該試驗重復3次，并以1 280 μg/mL為初始濃度的慶大霉素做陽性對照[11-12]。

(4) 有效組分中化學成分的GC-MS分析：將樣品用色譜甲醇溶解配制成1 mg/mL的待檢品。色譜條件：色譜柱為DB-17(30 m×250m×0.25m)彈性石英毛細管柱；進樣口溫度230 ℃；程序升溫：起始溫度70 ℃，以20 ℃/min速率升溫至230 ℃；分流比1∶1；進樣量1L；載氣流量2 mL/min；溶劑延遲3.50 min。離子源:電子轟擊源；以氦氣為載氣；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；電子轟擊能量70 eV；電子倍增器電壓1 435 V；接口溫度230 ℃；掃描質量范圍m/z30～800。運用Agilent GC-MS化學工作站對所獲得數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)處理，通過標準質譜庫檢索鑒定成分，按面積歸一化法進行定量分析。

2 結果與分析

2.1 九頭獅子草各組分的抑菌活性

九頭獅子草的各組分藥液(60 mg/mL)對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌及奇異變形桿菌均有不同程度的抑菌作用(見表1)，其中組分C對4種菌株抑制較為明顯，為九頭獅子草的主要抗菌有效組分。

? “-”表示溶劑空白無抑菌圈。

2.2 有效組分的MIC及MBC測定

九頭獅子草組分C對各試驗菌株的MIC及MBC測定結果見表2。結果表明，組分C對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、奇異變形桿菌抑菌作用較強，對銅綠假單胞菌抑菌活性稍弱。并且組分C的MIC均小于MBC。

2.3 GC-MS分析

通過優(yōu)化條件，有效組分的主要色譜峰得到了較好的分離(見圖1)。定性、定量分析結果(見表3)表明，有效組分C中主要含有十八烷酸等26種化合物，這26種化合物的含量占有效組分可測成分含量的80.95%。其中棕櫚酸含量最高(26.14%)，其次是亞油酸(12.08%)、硬脂酸(8.84%)和油酸(6.48%)等。

Figure 1 Total ion current chromatogram of the effective fractions fromPeristrophejaponica(Thunb.) Brem by GC-MS

? 含量低于0.15%的成分未在表中列出。

3 結論

九頭獅子草各組分均有不同程度的抗菌作用，其中大孔樹脂柱層析丙酮洗脫部位抗菌活性最強(組分C)，對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌及奇異變形桿菌均有一定的抗菌作用。GC-MS分析表明，組分C中主要含有脂肪酸及其衍生物，與文獻[13]報道的此類化合物具有較好的抗菌活性相一致。張希等[14]研究發(fā)現(xiàn)棕櫚油酸、油酸、亞油酸等能有效抑制致病性大腸埃希氏菌O157:H7以及白色念珠菌的生長繁殖；Sun等[15]通過比較脂肪酸及其單脂肪酸甘油酯對幽門螺旋桿菌的抑菌效果也發(fā)現(xiàn)，油酸和亞麻酸是抗菌作用最為有效的不飽和脂肪酸；Walters等[16]發(fā)現(xiàn)亞油酸能有效抑制終極腐霉菌、立枯絲核菌、燕麥葉炫菌、可可叢枝病菌(植物病害菌)的生長；葉湘漓等[17]研究發(fā)現(xiàn)椪柑籽的主要成分為油酸、亞油酸、棕櫚酸等，椪柑籽油具有調節(jié)動物血脂的作用。這些脂肪酸及其衍生物主要是作用于微生物細胞膜，引起電子傳遞鏈中斷、氧化磷酸化解偶聯(lián)、細胞內(nèi)容物溶出，同時抑制胞內(nèi)酶活性，減弱細胞對營養(yǎng)物質的吸收利用，并通過自身過氧化、自動氧化反應產(chǎn)生的 H2O2以及活性氧殺死細菌[18]。以上研究說明，以棕櫚酸、油酸、亞油酸、亞麻酸等為主要成分的脂肪酸類化合物可能是組分C的主要抗菌藥效物質，也可能是九頭獅子草的主要抗菌活性成分。由于GC-MS僅能對組分中可揮發(fā)的成分進行分析，組分C的其它成分是否也與其抗菌作用相關，尚需進行進一步的研究。在后期研究中，可以將九頭獅子草揮發(fā)性成分提取純化后開發(fā)成新型食品防腐劑[19]。

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