楊宗燦 Zong-can 馮穎杰 - 劉 超 王鵬飛 - 張 展 張耀廣 - 楊永鋒 - 李家美 - 劉向真 - 王紅霞 -

(1. 河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，河南 鄭州 450000；2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450000)

蛋白質(zhì)是煙葉中主要的含氮化合物[1]，其含量對煙葉的吸食品質(zhì)影響較大，對煙氣飽滿和煙香的豐富性具有重要作用。但是，蛋白質(zhì)含量過高會導(dǎo)致煙葉在燃吸時產(chǎn)生似燃燒羽毛的臭味，并產(chǎn)生辛辣、苦澀感[2]。同時，蛋白質(zhì)還是煙葉中許多有害成分的前體物質(zhì)[3-5]。一般來說，優(yōu)質(zhì)烤煙的蛋白質(zhì)含量在7%～11%[6]，而目前中國國產(chǎn)烤煙蛋白質(zhì)含量普遍較高，尤其是河南產(chǎn)區(qū)的煙葉。因此有效降低煙葉蛋白質(zhì)，使其維持在合理范圍，是提高煙葉品質(zhì)的重要途徑。

蛋白質(zhì)屬于大分子化合物，在自然陳化條件下降解緩慢，通過生物技術(shù)加速降解煙葉蛋白具有重要意義。目前的研究[7-8]主要集中在酶法降解和微生物發(fā)酵降解，前者具有降解時間短、降解效率高的優(yōu)勢，但蛋白酶成本較高，導(dǎo)致其難以在工業(yè)中大規(guī)模的應(yīng)用；而后者以成本低廉和工藝簡單成為了當(dāng)前的研究熱點。李梅云等[9]將微球菌屬或桿菌屬的細(xì)菌在濃度為107CFU/mL時處理K326片煙，蛋白質(zhì)降解率最高時為24.46%；馬玲玲[10]從煙葉表面篩選出一株枯草芽孢桿菌，噴施于煙葉表面，蛋白質(zhì)降低了20.00%。但目前為止，利用微生物發(fā)酵法降解煙葉蛋白依然存在蛋白酶活性不高，蛋白降解率偏低等問題，難以在工業(yè)生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

為獲得能夠高效降解煙葉蛋白質(zhì)的菌株，提高煙葉品質(zhì)，本研究從不同年份、不同等級復(fù)烤煙葉表面篩選出一株蛋白酶高產(chǎn)菌株，并對其進行鑒定及應(yīng)用效果探索，以期為高蛋白含量煙葉在卷煙中的應(yīng)用提供新的選擇。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 煙葉

用于菌株篩選的煙葉：采自河南(許昌和三門峽)、福建(三明和南平)以及云南(楚雄和臨滄)6個產(chǎn)地，3個年份(2011～2013年)的復(fù)烤煙葉，共計18份；

供試煙葉(作用效果考察用)：河南許昌C3F。

1.1.2 主要試劑

酪素、牛血清白蛋白：分析純，美國Fluka公司;

馬鈴薯、玉米漿、豆粕：市售;

其他試劑：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉 5 g，去離子水定容至1 000 mL，pH 7.0，固體培養(yǎng)基加15 g 瓊脂粉，121 ℃滅菌20 min，用于細(xì)菌的分離與培養(yǎng)；

YEPD培養(yǎng)基：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，去離子水定容至1 000 mL，pH 7.0，固體培養(yǎng)基加入15 g瓊脂粉，121 ℃滅菌20 min，用于酵母的分離和培養(yǎng)；

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉12 g，去離子水定容至1 000 mL，固體培養(yǎng)基加15 g瓊脂粉，121 ℃滅菌20 min，用于煙葉表面真菌的分離與篩選；

初篩培養(yǎng)基：KH2PO40.36 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，ZnCl20.014 g，Na2HPO4·12H2O 1.07 g，NaCl 0.16 g，CaCl2·H2O 0.002 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.002 g，脫脂奶粉10.0 g，瓊脂15 g，去離子水定容至1 000 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min；

復(fù)篩培養(yǎng)基：玉米漿15.0 g，豆粕15 g，蛋白胨1.0 g，NH4Cl 5.0 g，KH2PO41.0 g，Na2HPO45.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO40.1 g，pH 7.0，去離子水定容至1 000 mL，121 ℃ 滅菌20 min。

1.1.4 主要儀器

分光光度計：WFJ2100型，尤尼柯(上海)儀器有限公司；

冷凍離心機：Sigma2-16K型，德國Sigma公司；

PCR儀：Mastercycler nexus X型，德國Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 煙葉中微生物的初步分離 稱取0.5 g煙葉粉末，加入含有4.5 mL無菌水的10 mL滅菌試管中，于搖床200 r/min 水平震蕩15 min，然后豎直靜置5 min。用移液槍吸取上清菌懸液1 mL于含有9 mL無菌水的滅菌10 mL試管中，依次稀釋為10-2和10-3的菌懸液；分別吸取10-2、10-3稀釋度的菌懸液100 μL，涂布于NA和PDA培養(yǎng)基平板，分別于37，28 ℃培養(yǎng)過夜。

觀察菌落大小、形態(tài)特征，對不同菌落進行編號，記錄菌落特征及長勢。

1.2.2 產(chǎn)蛋白質(zhì)降解菌篩選 將上述分離獲得的細(xì)菌、真菌依次接種到蛋白質(zhì)降解菌選擇培養(yǎng)基上，細(xì)菌在37 ℃培養(yǎng)，真菌在30 ℃培養(yǎng)。觀察并計算透明圈直徑與菌落直徑的比值和透明圈明顯程度，通過統(tǒng)計學(xué)分析選擇出酶活較高的菌株。

將能夠在蛋白質(zhì)降解菌選擇培養(yǎng)基上產(chǎn)生透明圈的菌株，按菌株種類的不同接種到NA或YEPD培養(yǎng)基，37 ℃或30 ℃下150 r/min震蕩培養(yǎng)12 h，按照2%的接種量接入50 mL 產(chǎn)蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，37 ℃下150 r/min發(fā)酵48 h。取發(fā)酵液于3 500 r/min離心10 min后取上清液，測酶活。

1.2.3 蛋白質(zhì)降解菌的蛋白酶活性測定 采用福林酚法[11]，以2%的酪蛋白溶液為底物。

1.2.4 煙葉蛋白含量的測定 采用Brad-Ford法[12]，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5 蛋白質(zhì)降解菌的16S rDNA分析 菌株總DNA的提取，采用改良的SDS方法進行提取。PCR擴增采用通用引物，得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后送至上海鉑尚生物技術(shù)有限公司進行測序，測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中利用BLAST進行序列分析。

下載同源性較高菌株的16S rDNA序列，與測得序列通過DNAMAN軟件進行序列比對分析。

1.2.6 煙葉中蛋白質(zhì)降解菌的形態(tài)學(xué)與理化鑒定 在NA固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h后，觀察菌落外部形態(tài)特征；使用顯微鏡油鏡觀察細(xì)菌形態(tài)[13]。

參照文獻[14]對蛋白酶產(chǎn)生菌HN-3進行革蘭氏染色、接觸酶反應(yīng)、V-P反應(yīng)、酪素水解反應(yīng)等試驗。

1.2.7 菌株降解煙葉蛋白質(zhì)的應(yīng)用 將保藏的HN-3菌株轉(zhuǎn)接到NA培養(yǎng)基內(nèi)，于37 ℃、150 r/min震蕩培養(yǎng)24 h，至菌懸液OD值為2.0時，3 600 r/min離心10 min，棄上清，加入等體積的無菌生理鹽水，得到種子液。

取100 g許昌復(fù)烤煙葉，選擇發(fā)酵時間、施加菌液量、發(fā)酵溫度為影響因素，通過單因素試驗確定了各因素的水平范圍，并設(shè)計三因素三水平正交試驗，優(yōu)化菌株有效降解煙葉蛋白質(zhì)的適宜條件[15]。正交試驗因素和水平見表1。

將煙葉切絲，制成煙支規(guī)格(20+64) mm×24.5 mm的煙支樣品，在22 ℃、相對濕度60%的恒溫恒濕箱中平衡48 h后待評。由11名專業(yè)評吸員按9分制打分，匯總結(jié)果去除最高分和最低分后取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)降解菌的初篩

從不同類型復(fù)烤煙葉樣品中，經(jīng)菌落大小、顏色、形態(tài)分析，共分離獲得細(xì)菌123株，真菌9株。這些細(xì)菌、真菌經(jīng)蛋白質(zhì)降解菌選擇培養(yǎng)基篩選，獲得能夠產(chǎn)生透明圈的菌株18株。

18株菌株在蛋白質(zhì)降解菌選擇培養(yǎng)基上生長48，72 h之后產(chǎn)生的透明圈分別見圖1、2。

進一步測定18株菌株在蛋白質(zhì)降解菌選擇培養(yǎng)基上生長48，72 h之后透明圈/菌落直徑比值的平均值，并通過均值方差分析法分析差異顯著性，結(jié)果見表2。

? 99% 整體置信區(qū)間，分組中不共享字母的均值之間具有顯著差異；*表示由于該菌落形態(tài)極不規(guī)則，無法計算直徑，或長度無法計算，或透明圈與菌落直徑比值無法計算。

方差分析結(jié)果表明，48 h和72 h的透明圈菌落直徑比中，HN-3、YN-6和YN-10的比值較大，差異性分組均不共享字母，差異性顯著。HN-4的48 h比值差異不顯著，考慮到72 h的結(jié)果差異顯著以及透明圈較大，列為待考察菌株。YN-13和FJ-18菌落形態(tài)不規(guī)則，但實際觀察中透明圈較大，因此同樣列為待考察菌株。

2.2 煙葉中蛋白質(zhì)降解菌的復(fù)篩

將6個菌株接種于產(chǎn)蛋白酶培養(yǎng)基上，30 ℃下150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后，經(jīng)測定OD660并計算，結(jié)果見圖3。其中，HN-3具有最高的蛋白酶活力(3 417 U/mL)，因此選擇為試驗菌株，應(yīng)用于煙葉蛋白的降解。

2.3 菌株的16S rDNA序列測定

采用16S rDNA基因片段通用引物FP/RP，對HN-3進行PCR擴增以及克隆測序，獲得一條1 422 bp的片段，將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中的基因序列進行比對，發(fā)現(xiàn)HN-3與短小芽孢桿菌的同源性高達100%，確定HN-3是短小芽孢桿菌。使用DNAMAN軟件，選取同源性較高的7種模式細(xì)菌菌株，進行系統(tǒng)進化分析，顯示HN-3與短小芽孢桿菌的親緣關(guān)系最近(圖4)。

2.4 HN-3的形態(tài)學(xué)觀察

在37 ℃培養(yǎng)48 h后，HN-3菌落呈白色至淡黃色，表面無光澤，不透明，表面不平整，凸起，菌落近圓形或不規(guī)則，菌落邊緣不規(guī)則，在蛋白質(zhì)降解菌選擇培養(yǎng)基上生長速度較快。菌株個體0.6～0.7 μm×2.0～3.0 μm，呈桿狀(圖5)，很少呈鏈狀，芽孢橢圓形。

2.5 HN-3的理化鑒定

HN-3經(jīng)試驗分析，發(fā)現(xiàn)該菌革蘭氏染色呈陽性，甲基紅反應(yīng)呈陰性，接觸酶反應(yīng)呈陽性，V-P測驗呈陽性，產(chǎn)酸反應(yīng)呈陽性，在7% NaCl中不能生長，酪素水解反應(yīng)呈陽性，淀粉水解反應(yīng)呈陽性，硝酸鹽還原試驗呈陰性，最低生長溫度10 ℃，最高生長溫度50 ℃(表3)。參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[16]，確定HN-3為短小芽孢桿菌。

2.6 HN-3降解煙葉中蛋白質(zhì)的效果

測得對照煙葉的蛋白質(zhì)含量為112.47 mg/g。由表4可知，最優(yōu)水平組合為A3B1C2，即時間為84 h、菌液施加比例為3%、發(fā)酵溫度為37 ℃；菌液施加比例對整個作用條件的影響最大，其次是發(fā)酵溫度，而發(fā)酵時間的影響最小。

由于最優(yōu)化組合A3B1C2并不在9組正交處理方案中，因此對優(yōu)化處理方案進行了驗證實驗。結(jié)果表明，將菌液按照3%的煙葉質(zhì)量比例施加于抽梗后的煙葉表面，在溫度為37 ℃的條件下發(fā)酵84 h后，煙葉中蛋白質(zhì)降解率可達最高值(29.66%)。

2.7 HN-3處理煙葉后感官評吸效果

進一步對菌液處理前后的煙葉進行感官質(zhì)量評價，結(jié)果見表5。

由表5可知，煙葉經(jīng)過菌液處理后，香氣質(zhì)變好，香氣量、煙氣濃度有所提高，雜氣減少，余味有所改善，與對照相比，總得分提高1.13分，煙葉整體感官質(zhì)量得到明顯提升。

?T=(A+B)×2.3+C×1.5+D+E+F+G。

3 結(jié)論

本研究從不同類型復(fù)烤煙葉樣品中分離出18株蛋白質(zhì)降解菌株，觀察其在蛋白質(zhì)降解菌選擇培養(yǎng)基上生長48 h和72 h降解蛋白質(zhì)的情況可知，HN-3、HN-4、YN-6、YN-10、YN-13、FJ-18降解蛋白的能力較強。進一步測定菌株蛋白質(zhì)酶活力表明，6種菌株的蛋白酶活性分別為3 417，2 217，3 246，2 789，2 217，3 017 U/mL，蛋白酶活力最高的菌株是在蛋白質(zhì)降解菌選擇培養(yǎng)基上生長快且透明圈與菌落直徑比值較大的HN-3。

通過16Sr DNA測序，HN-3與短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)的同源性高達100%，親緣關(guān)系最近，結(jié)合形態(tài)學(xué)與理化特性，參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》，確定HN-3為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)。在之前的研究中，黃靜文等[17]從烤煙表面分離到1株短小芽孢桿菌Van35，將其制成菌液施用于卷煙煙絲，22 ℃于60%恒溫恒濕箱發(fā)酵20 d，結(jié)果表明，煙葉纖維素含量、總氮均明顯降低，短小芽孢桿菌處理后的煙葉，煙香、細(xì)膩醇均明顯提升，煙葉刺激性、雜氣均明顯下降，但未報道短小芽孢桿菌Van35是否具有降解煙葉中蛋白質(zhì)的功能。本研究將由HN-3制成的菌液噴施于煙葉表面，煙葉中蛋白質(zhì)降解率可達29.66%，證明短小芽孢桿菌HN-3能有效降解煙葉中的蛋白質(zhì)，且能顯著改善煙葉的整體感官質(zhì)量。綜合之前研究可推測短小芽孢桿菌可有效降解煙葉中蛋白質(zhì)、纖維素等大分子物質(zhì)，減少這些大分子物質(zhì)在煙葉燃吸時產(chǎn)生的刺激氣體等，從而有效改善煙葉的吸食品質(zhì)，相關(guān)結(jié)果有待進一步驗證。

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