閆立（安徽省宣城中學(xué)安徽宣城 242000）

劉皓（安徽省肥東縣圣泉中學(xué)安徽合肥 231600）

淺談影印平板培養(yǎng)法
——從一道高考題談起

閆立（安徽省宣城中學(xué)安徽宣城 242000）

劉皓（安徽省肥東縣圣泉中學(xué)安徽合肥 231600）

影印平板培養(yǎng)法是一種通過蓋印章的方式，達(dá)到在一系列培養(yǎng)皿平板的相同位置上出現(xiàn)相同遺傳型菌落的接種和培養(yǎng)方法。從一道高考試題入手，對影印平板培養(yǎng)法進(jìn)行了分析，解答了學(xué)生解題中的困惑。

影印平板培養(yǎng)法 高考試題 選擇培養(yǎng)

文件編號：1003－7586（2017）01－0005－02

（2016全國Ⅰ卷）某一質(zhì)粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會導(dǎo)致相應(yīng)的基因失活（Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因）。有人將此質(zhì)粒載體用BamH I酶切后，與用BamH I酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌?；卮鹣铝袉栴}：

圖1 質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意

（1）質(zhì)粒載體作為基因工程的工具，應(yīng)具備的基本條件有＿＿（答出兩點(diǎn)即可）。而作為基因表達(dá)載體，除滿足上述基本條件外，還需具有啟動子和終止子。

（2）如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，在上述四種大腸桿菌細(xì)胞中，未被轉(zhuǎn)化的和僅含有環(huán)狀目的基因的細(xì)胞是不能區(qū)分的，其原因是＿＿＿＿；并且＿＿和＿＿的細(xì)胞也是不能區(qū)分的，其原因是＿＿。在上述篩選的基礎(chǔ)上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌的單菌落，還需使用含有是＿＿的固體培養(yǎng)基。

答案：

（1）能夠自我復(fù)制、具有標(biāo)記基因、具有一個至多個限制酶切割位點(diǎn)（答出兩點(diǎn)即可）

（2）二者均不含氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上都不能生長含有質(zhì)粒載體含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒（或答含有重組質(zhì)粒）二者都含氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均能生長四環(huán)素

1 問題的提出

在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中，未被轉(zhuǎn)化的和含有環(huán)狀目的基因的大腸桿菌因無氨芐青霉素抗性基因而不能存活，所以不能區(qū)分；含有質(zhì)粒載體的和重組質(zhì)粒的由于具有氨芐青霉素抗性基，能在該培養(yǎng)基上生存。所以在上述篩選的基礎(chǔ)上，還需要進(jìn)一步篩選出含重組質(zhì)粒的大腸桿菌。

為什么加入四環(huán)素就能篩選出含重組質(zhì)粒的大腸桿菌呢？不少學(xué)生（包括部分教師）會產(chǎn)生這樣的疑問：由于目的基因插入到四環(huán)素抗性基因內(nèi)部從而導(dǎo)致該基因失活，加入四環(huán)素不就把含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌殺死了嗎，怎么還能夠?qū)⑵浜Y選出來呢？其中，實際上運(yùn)用了一種方法——影印平板培養(yǎng)法。

2 影印平板培養(yǎng)法簡介

影印平板培養(yǎng)法是一種通過蓋印章的方式，達(dá)到在一系列培養(yǎng)皿平板的相同位置上出現(xiàn)相同遺傳型菌落的接種和培養(yǎng)方法。1952年，萊德伯格夫婦的論文《平板影印培養(yǎng)法和細(xì)菌突變株的間接選擇》，以確切的事實證明了微生物的抗藥性是在未接觸藥物前自發(fā)地產(chǎn)生的，這一突變與相應(yīng)藥物環(huán)境毫不相干。

萊德伯格影印平板培養(yǎng)法的實驗過程如下：把長有許多菌落的母種培養(yǎng)皿倒置于包有一層滅菌絲絨布的木質(zhì)圓柱印章上，使其均勻地沾滿來自母培養(yǎng)皿平板上的菌落。然后可把這一“印章”上的菌落一一接種到不同的選擇性培養(yǎng)基平板上。經(jīng)培養(yǎng)后，對各平板相同位置上的菌落進(jìn)行對比，就可選出適當(dāng)?shù)耐蛔冃途辍Ｒ虼送ㄟ^影印平板培養(yǎng)法，就可以從非選擇性條件下生長的細(xì)菌群體中，分離到過去只有在選擇性條件下才能分離到的相應(yīng)突變株。

3 釋疑解惑

如何通過影印平板培養(yǎng)法篩選出含重組質(zhì)粒的大腸桿菌呢？如圖2所示，簡單地說，將原始菌種（含質(zhì)粒載體的大腸桿菌和重組質(zhì)粒載體的大腸桿菌）接種在不含藥物的普通平板表面，待其長出密集的菌落后，用影印法接種到含四環(huán)素的平板上。由于含重組質(zhì)粒的大腸桿菌在含有四環(huán)素的選擇培養(yǎng)基上不能生存，故在該平板上相應(yīng)位置沒有菌落出現(xiàn)；比較平板2和3，就可以在平板2上的相同位置找到含重組質(zhì)粒的大腸桿菌。把平板2中相應(yīng)位置的菌落挑選至普通培養(yǎng)液中繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，再涂布到平板5上，重復(fù)以上步驟，最終就可以得到純度較高的含重組質(zhì)粒的大腸桿菌。

圖2 影印平板培養(yǎng)法

Q-49

E