羅凱，艾克特，夏理海，李由申，張進(jìn)雄

許巧情，郜衛(wèi)華

3種水產(chǎn)致病弧菌的生長(zhǎng)速度對(duì)比研究

羅凱，艾克特，夏理海，李由申，張進(jìn)雄

采用LB液體培養(yǎng)基，按照1∶500的比例對(duì)鰻弧菌(Vibrioanguillarum)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)和河流弧菌(V.fluvialis)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并測(cè)定不同時(shí)間段細(xì)菌培養(yǎng)液光密度D600nm值和重量來間接反映其生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示,鰻弧菌在5.75h時(shí)D600nm為1.046，溶藻弧菌在4.5h時(shí)D600nm為1.064，河流弧菌在3.75h時(shí)D600nm為1.071。這表明河流弧菌生長(zhǎng)速度最快，溶藻弧菌次之，鰻弧菌生長(zhǎng)速度最慢。

鰻弧菌(Vibrioanguillarum);溶藻弧菌(V.alginolyticus);河流弧菌(V.fluvialis);生長(zhǎng)速度

弧菌能夠誘發(fā)多種養(yǎng)殖動(dòng)物產(chǎn)生疾病,常引起疾病大面積爆發(fā)，不僅發(fā)病率較高,嚴(yán)重的甚至導(dǎo)致死亡。這在南美白對(duì)蝦的養(yǎng)殖中最為突出，給南美白對(duì)蝦的養(yǎng)殖帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。鑒于此，有關(guān)弧菌的致病原理、鑒定方法和防治措施等報(bào)道較多[1～4]。據(jù)有關(guān)資料顯示，溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、鰻弧菌(V.anguillarum)、河流弧菌(V.fluvialis)、霍亂弧菌(V.cholerae)、哈維氏弧菌(V.harveyi)、魚腸道弧菌(V.ichthyoenteri)、燦爛弧菌(V.splendidus)、副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus)、創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)、殺鮭弧菌(V.salmonicida)、美人魚弧菌(V.damsela)、奧氏弧菌(V.ordalii)、費(fèi)氏弧菌(V.fischeri)、鯊魚弧菌(V.carchariae)、海利斯頓氏弧菌(V.pelagius)及最小弧菌(V.mimicus)等多種弧菌可以引發(fā)相關(guān)魚類爆發(fā)疾病[5～11]，其中的一些種類甚至?xí)?dǎo)致其他動(dòng)物和人類致病[12～16]。本研究通過生長(zhǎng)試驗(yàn)比較了鰻弧菌、溶藻弧菌和河流弧菌的生長(zhǎng)速度，以期為相應(yīng)疾病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種來源及活化

菌種來源：鰻弧菌、溶藻弧菌和河流弧菌菌種均為上海海洋大學(xué)所贈(zèng)。

菌種活化：將-80℃冰箱凍存的菌種置于37℃的水浴鍋中解凍溶解，然后放入到新制備的 5mLLB液體培養(yǎng)基(1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%氯化鈉)中在37℃、220r/min的轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)12h。將培養(yǎng)培養(yǎng)12h的菌液采用細(xì)菌平板涂布的方法，接種到LB固體培養(yǎng)基(1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%氯化鈉、1.2%瓊脂糖)中，在恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)12h，培養(yǎng)后的細(xì)菌放入到4℃冰箱保存待用。

1.2 試驗(yàn)方法

將上述鰻弧菌、溶藻弧菌和河流弧菌的固體培養(yǎng)基取出后放置于潔凈工作臺(tái)中，嚴(yán)格按照無菌操作的要求，分別挑取鰻弧菌、溶藻弧菌和河流弧菌的單個(gè)菌落放置于裝有5mL新配制的LB 液體培養(yǎng)基的EP管中，在37℃、220r/min的轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)6h后，以LB 液體培養(yǎng)基作為基準(zhǔn)，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定3種致病弧菌菌體懸浮培養(yǎng)液的D600nm值。每間隔10min測(cè)定1次，待D600nm達(dá)到1.0時(shí)，停止培養(yǎng)。再將D600nm達(dá)到1.0的3種弧菌培養(yǎng)液分別取出100μL，按照1∶500的比例加入到裝有50mL新配制的LB液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，每種弧菌擴(kuò)大培養(yǎng)3組。

利用配制的LB液體培養(yǎng)基作為參照，測(cè)定每種弧菌在不同培養(yǎng)時(shí)間段的D600nm值，取其平均值并記錄數(shù)據(jù)。同時(shí)分別取對(duì)應(yīng)時(shí)間段的弧菌培養(yǎng)液1mL于已稱其重量的EP管中，利用高速離心機(jī)12000r/min離心1min，使弧菌菌體沉淀于EP管底部，用移液槍盡可能取盡上清LB液體，稱量并計(jì)算對(duì)應(yīng)時(shí)間段菌體重量，取其平均值并記錄數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鰻弧菌的生長(zhǎng)速度

圖1A為鰻弧菌菌液在不同培養(yǎng)時(shí)間的光密度D600nm，圖1B為每毫升鰻弧菌菌液在不同培養(yǎng)時(shí)間的菌體重量。由圖1可知，鰻弧菌在LB 液體培養(yǎng)基中37℃、220r/min的轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)，5.75h后D600nm為1.046，其在0～5.5h之間生長(zhǎng)速度不斷加快，而5.5～5.75h之間生長(zhǎng)速度減慢。

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間的鰻弧菌菌液D600nm值(A)和菌體重量(B)

2.2 溶藻弧菌的生長(zhǎng)速度

圖2A為溶藻弧菌菌液在不同培養(yǎng)時(shí)間的光密度D600nm，圖2B為每毫升溶藻弧菌菌液在不同培養(yǎng)時(shí)間的菌體重量。由圖2可知，溶藻弧菌在LB 液體培養(yǎng)基中在37℃、220r/min的轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)，4.5h后D600nm為1.064，其在0～4.25h之間生長(zhǎng)速度不斷加快，在4.25～4.5h之間生長(zhǎng)速度有放緩的趨勢(shì)。

圖2 不同培養(yǎng)時(shí)間的溶藻弧菌菌液D600nm值(A)和菌體重量(B)

2.3 河流弧菌生長(zhǎng)速度結(jié)果

圖3A為河流弧菌菌液在不同培養(yǎng)時(shí)間的光密度D600nm，圖3B為每毫升河流弧菌菌液在不同培養(yǎng)時(shí)間的菌體重量。由圖3可知，河流弧菌在LB液體培養(yǎng)基中在37℃、220r/min的轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)，3.75h后D600nm為1.071，其在0～3.5h之間生長(zhǎng)速度不斷加快，在3.5～3.75h之間生長(zhǎng)速度稍有減慢。

圖3 不同培養(yǎng)時(shí)間的河流弧菌菌液D600nm值(A)和菌體重量(B)

3 討論與小結(jié)

細(xì)菌最常見的生長(zhǎng)繁殖方式是細(xì)胞壁沿著橫向開始分裂開而形成2個(gè)子代細(xì)菌，結(jié)合細(xì)菌在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的特點(diǎn)將細(xì)菌的生長(zhǎng)分為4個(gè)主要階段：適應(yīng)階段、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段、穩(wěn)定階段和衰亡階段[17]。適應(yīng)階段主要是細(xì)菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)，數(shù)目基本保持不變，僅僅是細(xì)菌個(gè)體增大，極少細(xì)菌出現(xiàn)分裂；對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段細(xì)菌大量生長(zhǎng)繁殖，呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)；平衡階段是受環(huán)境的限制，細(xì)菌數(shù)目維持在穩(wěn)定狀態(tài)；衰亡階段細(xì)菌開始出現(xiàn)大量死亡，活菌數(shù)減少。通過細(xì)菌生長(zhǎng)速度的研究，可以了解細(xì)菌的生長(zhǎng)規(guī)律，對(duì)科研、生產(chǎn)等具有重要意義。

本研究比較了3種常見的水產(chǎn)致病弧菌(鰻弧菌、溶藻弧菌和河流弧菌)在LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)規(guī)律，間接反應(yīng)其在水生動(dòng)物中的致病能力。朱蘇琴[18]在研究河流細(xì)菌突變株生長(zhǎng)曲線時(shí)，利用1∶100的比例擴(kuò)大培養(yǎng)，在條件為28℃、120r/min的轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)了23h，根據(jù)酶標(biāo)儀測(cè)得的D550nm為0.7，并繪制出河流弧菌突變株的生長(zhǎng)曲線。與本研究相比，雖然培養(yǎng)條件不同，但是細(xì)菌在波長(zhǎng)為600 nm時(shí)有最大吸收峰，同時(shí)弧菌最佳培養(yǎng)溫度在35℃附近[19,20]，因此本研究測(cè)定的鰻弧菌在LB液體培養(yǎng)基中37℃、220r/min下培養(yǎng)，5.75h后D600nm為1.046，在0～5.5h生長(zhǎng)速度加快，5.5～5.75h生長(zhǎng)速度減慢的結(jié)果更符合細(xì)菌生長(zhǎng)的一般規(guī)律。程海燕[21]將3種溶藻弧菌突變株(ΔtoxR、ΔacfA、C-acfA)分別接種到TSB培養(yǎng)基中，擴(kuò)大培養(yǎng)前原菌液D600nm為0.5，然后按照1∶1的比例，在28℃、200r/min的條件下培養(yǎng)，在4～5h之間溶藻弧菌的D600nm達(dá)到1.0。本研究在LB液體培養(yǎng)基中37℃、220r/min下培養(yǎng)，4.5h后其菌液的D600nm為1.064，0～4.25h生長(zhǎng)速度加快，4.25～4.5h生長(zhǎng)速度減慢，但減慢趨勢(shì)不明顯，兩者結(jié)果基本一致，但溫度和擴(kuò)大培養(yǎng)的倍數(shù)不同，有關(guān)溫度、培養(yǎng)基種類和擴(kuò)大培養(yǎng)倍數(shù)對(duì)結(jié)果的影響需要進(jìn)一步探討。有關(guān)鰻弧菌生長(zhǎng)速度的研究較少，因此本研究發(fā)現(xiàn)其在LB液體培養(yǎng)基中37℃、220r/min下培養(yǎng)，5.75 h后D600nm為1.046，0～5.5h生長(zhǎng)速度加快，5.5～5.75h生長(zhǎng)速度減慢。測(cè)定這3種致病性弧菌的生長(zhǎng)速度，在生產(chǎn)實(shí)踐中具有重要的意義，可以間接反映致病性弧菌在侵襲動(dòng)物科學(xué)宿主到爆發(fā)疾病，再到疾病傳播的速度，可讓生產(chǎn)者及時(shí)采取預(yù)防和治療措施，減少經(jīng)濟(jì)損失。比較3種致病性弧菌的生長(zhǎng)速度可以發(fā)現(xiàn)，在37℃的條件下，河流弧菌生長(zhǎng)速度最快，因此河流弧菌在進(jìn)入機(jī)體后能夠快速地達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，大量繁殖并產(chǎn)生細(xì)菌毒素，對(duì)魚體能夠造成快速損傷，所以當(dāng)生產(chǎn)者發(fā)現(xiàn)河流弧菌感染時(shí)，應(yīng)該盡早采取緊急治療措施，減少經(jīng)濟(jì)損失；鰻弧菌生長(zhǎng)速度最慢，而溶藻弧菌生長(zhǎng)速度介于河流弧菌和鰻弧菌之間，說明溶藻弧菌和鰻弧菌侵入機(jī)體時(shí)，致病速度相對(duì)較慢，可以采取抗生素治療的同時(shí)利用中草藥制劑增加魚體的抗病能力達(dá)到治愈的目的。但是疾病的發(fā)生與傳播還受宿主生理?xiàng)l件、侵入的數(shù)量和種類、環(huán)境條件等因素影響，所以生產(chǎn)實(shí)踐種應(yīng)視具體情況采取適當(dāng)預(yù)防措施。

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[編輯] 余文斌

2016-09-29

濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心(長(zhǎng)江大學(xué))開放課題(KF201608)。

羅凱(1992-)，男，碩士生，研究方向?yàn)槊厮a(chǎn)養(yǎng)殖。通信作者：郜衛(wèi)華，35507883@qq.com。

S917.1

A

1673-1409(2017)02-0025-04

[引著格式]羅凱，艾克特，夏理海，等.3種水產(chǎn)致病弧菌的生長(zhǎng)速度對(duì)比研究[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版)，2017，14(2)：25～28.