趙金磊 范曉鴿 靳三丁 李 萍 張合成

鄭州市兒童醫(yī)院小兒外科（河南鄭州 450053）

熱休克蛋白70在膽道閉鎖肝組織纖維化中作用及對(duì)預(yù)后影響

趙金磊 范曉鴿 靳三丁 李 萍 張合成

鄭州市兒童醫(yī)院小兒外科（河南鄭州 450053）

目的探討熱休克蛋白70在膽道閉鎖（BA）肝組織纖維化中的作用及對(duì)預(yù)后的影響。方法選取擇期行Kasai術(shù)治療的BA患兒46例、膽總管囊腫患兒30例和門靜脈海綿樣變患兒17例；免疫組化染色檢測(cè)肝組織中HSP70蛋白表達(dá)，利用天狼星紅-飽和苦味酸染色液檢測(cè)BA患兒肝組織纖維化，雙重染色法檢測(cè)BA患兒不同纖維化肝組織中HSP70蛋白表達(dá)，所有BA患兒術(shù)后均獲得隨訪。結(jié)果BA、膽總管囊腫以及靜脈海綿樣變患兒三組，HSP70蛋白高表達(dá)比例的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.99，P=0.018），以BA組的HSP70蛋白高表達(dá)比例為最高。等級(jí)相關(guān)分析顯示，肝組織中HSP70蛋白表達(dá)強(qiáng)度與肝纖維化程度呈正相關(guān)（r=0.861，P＜0.001）；46例BA患兒中，死亡15例，生存分析顯示，輕度BA患兒術(shù)后生存率82.4%，中位生存時(shí)間（34.6±2.3）月；中重度患兒術(shù)后生存率58.6%，中位生存時(shí)間（25.5±2.8）月；Log-Rank檢驗(yàn)顯示，兩組生存函數(shù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.27，P=0.012）。BA患兒中，HSP70蛋白低表達(dá)者的生存率85.0%，術(shù)后中位生存時(shí)間（34.0±2.6）月，HSP70蛋白高表達(dá)者生存率53.8%，術(shù)后中位生存時(shí)間（18.3±2.2）月；Log-Rank檢驗(yàn)顯示，兩組生存函數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.77，P=0.029）。結(jié)論BA患兒肝組織中HSP70蛋白呈高表達(dá)，且與肝組織纖維化程度呈正相關(guān)，推測(cè)其可能參與了肝纖維化進(jìn)程，HSP70表達(dá)上調(diào)往往預(yù)示患兒預(yù)后不良。

膽道閉鎖； 熱休克蛋白70； 纖維化； 預(yù)后； 兒童

膽道閉鎖（biliary atresia，BA）作為嬰兒期嚴(yán)重的肝臟疾病，病因未明，是進(jìn)行性膽管炎癥及肝纖維化導(dǎo)致的嬰兒期膽道梗阻性疾病，可導(dǎo)致膽汁淤積、肝硬化、門脈高壓及肝衰竭，甚至死亡[1]。目前，肝門-空腸吻合術(shù)（Kasai術(shù)）是臨床治療BA的第一選擇，可顯著提高患兒生存率[2]，但手術(shù)并不能阻止肝纖維化進(jìn)展，約有70%～80%患兒術(shù)后肝纖維化仍在持續(xù)而影響長(zhǎng)期預(yù)后[3]。熱休克蛋白家族（heat shock protein，HSPs）作為一種免疫蛋白，在先天免疫系統(tǒng)激活及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，亦可作為前膠原的“分子伴侶”參與膠原合成及成熟，并調(diào)控膠原產(chǎn)量[4]，說明其可能在纖維化過程中發(fā)揮重要作用。HSP70作為HSPs重要成員，HSP70在肝纖維化、肺纖維化等多種纖維性疾病中表達(dá)異常[5,6]。本研究旨在分析BA患兒肝組織中HSP70表達(dá)，探討其與肝纖維化的相關(guān)性，以及對(duì)患兒預(yù)后的影響，以期為臨床實(shí)踐提供基礎(chǔ)資料。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2013年3月至2015年6月在鄭州市兒童醫(yī)院擇期行Kasai術(shù)治療的BA患兒46例，入選標(biāo)準(zhǔn)：①均為初診治療者；②術(shù)中造影明確診斷為Ⅲ型膽道閉鎖。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有其他系統(tǒng)嚴(yán)重畸形者。

同期，選取膽總管囊腫患兒30例，入選標(biāo)準(zhǔn)：①均為初診并治療；②明確診斷為非梗阻性黃疸表現(xiàn)的膽總管囊腫；③排除合并有其他系統(tǒng)嚴(yán)重畸形者。

選取門靜脈海綿樣變患兒17例，入選標(biāo)準(zhǔn)：①均為初診并治療；②明確診斷為門靜脈海綿樣變；③排除合并有其他系統(tǒng)嚴(yán)重畸形者。所有患兒均于術(shù)中留取右葉肝組織，快速保存于－70℃液氮中以備檢。

本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患兒家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 肝組織中HSP70蛋白表達(dá) 利用免疫組化染色法對(duì)肝組織中HSP70蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。肝組織經(jīng)切片、脫蠟至水、沖洗后，室溫下3%H2O2孵育5 min，PBS沖洗3次，5%正常山羊血清封閉，室溫孵育8 min。加入一抗HSP70單克隆抗體（購(gòu)自北京中山公司，1:200稀釋），4℃過夜孵育。PBS沖洗3次，加入二抗，37℃孵育10 min，PBS沖洗3次，DAB顯色，復(fù)染、脫水透明、封片。于高倍鏡下每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野進(jìn)行觀察，HSP70陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕黃色或黃褐色顆粒狀物質(zhì)，每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞比例及染色程度進(jìn)行評(píng)分。①根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞比例：0分≤5%；1分6～25%；2分25～50%；3分50～75%；4分≥75%；②根據(jù)染色程度：0分：未染色；1分：著色淺、略高于背景色；2分：中度染色；3分：強(qiáng)染色、著色深；③根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞比例和染色程度評(píng)分相加獲得總評(píng)分：（－）0～1分；（+）2～3分；（++）4～5分；（+++）6～7分，其中，－～+為低表達(dá)，++～+++為高表達(dá)。

1.2.2 肝組織纖維化檢測(cè)及分組 采用天狼星紅-飽和苦味酸染色法。取術(shù)中留取的肝組織，石蠟包埋、切片脫蠟至水后，用天狼星紅-飽和苦味酸染色液（購(gòu)自北京吉美生物技術(shù)有限公司）對(duì)膠原纖維進(jìn)行染色15 min，1%醋酸沖洗3次，流水沖洗4 min，風(fēng)干封片，于顯微鏡下觀察，背景為黃色，膠原纖維染為紅色，均由2位病理科具有副高級(jí)職稱以上醫(yī)師單獨(dú)完成讀片，根據(jù)METAVIR分期標(biāo)準(zhǔn)對(duì)肝組織纖維化進(jìn)行分期[7]，Ⅰ期：門管區(qū)輕度纖維化但無間隔；Ⅱ期：門管區(qū)纖維化并見少量間隔；Ⅲ期：出現(xiàn)間隔纖維化；Ⅳ期：肝硬化伴假小葉形成。

1.2.3 不同纖維化肝組織中HSP70蛋白表達(dá) 采用雙重染色法。利用免疫組織化學(xué)和天狼星紅-飽和苦味酸染色液對(duì)組織切片進(jìn)行雙染，方法同上。于高倍鏡下觀察不同纖維化肝組織中HSP70蛋白表達(dá)。

1.2.4 病例隨訪 所有BA患兒術(shù)后均獲得隨訪，隨訪截止2016年6月30日，中位隨訪時(shí)間26個(gè)月（3～39個(gè)月）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各組數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。計(jì)數(shù)資料以百分比或率表示，組間比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)；利用線性相關(guān)趨勢(shì)檢驗(yàn)以及Spearman秩相關(guān)進(jìn)行等級(jí)資料相關(guān)性分析；HSP70表達(dá)對(duì)BA患兒術(shù)后生存時(shí)間影響以及肝纖維化程度對(duì)BA患兒生存時(shí)間影響采用Kaplan-Meier生存分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象一般情況

入選BA患兒46例，其中男21例、女25例，平均手術(shù)日齡（79.2±11.3）d（20～157 d）；膽總管囊腫患兒30例，其中男11例、女19例，平均手術(shù)月齡（29.8±13.1）月（10～106個(gè)月）；門靜脈海綿樣變患兒17例，其中男10例、女7例，平均手術(shù)月齡（55.6±12.5）個(gè)月（7～128個(gè)月）。

2.2 各組患兒肝組織中HSP70蛋白表達(dá)

BA患兒、膽總管囊腫患兒以及靜脈海綿樣變患兒HSP 70蛋白高表達(dá)比例的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.99，P=0.018），以BA組的HSP70蛋白高表達(dá)比例為最高。經(jīng)卡方分割進(jìn)行兩兩比較，發(fā)現(xiàn)BA患兒肝組織中HSP70蛋白高表達(dá)比例高于膽總管囊腫患兒（χ2=6.54，P=0.011）；但BA患兒與靜脈海綿樣變患兒，膽總管囊腫患兒與靜脈海綿樣變患兒之間，HSP70蛋白高表達(dá)比例的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見表1。

2.3 BA患兒肝組織中HSP70蛋白表達(dá)與纖維化的關(guān)系

雙重染色法結(jié)果顯示，BA患兒中從肝組織纖維化Ⅰ期～Ⅳ期天狼星紅陽(yáng)性不斷增加，提示肝纖維化程度不斷增加（圖1A～4A）；且從肝組織纖維化Ⅰ期～Ⅳ期HSP70蛋白表達(dá)量不斷增加（圖1B～4B）。

圖1 BA患兒不同纖維化肝組織中HSP70蛋白表達(dá)

BA患兒肝組織中HSP70蛋白表達(dá)強(qiáng)度與肝纖維化程度進(jìn)行等級(jí)秩次的相關(guān)趨勢(shì)分析，Ⅰ期～Ⅳ期分別賦值1、2、3、4，－～+、++、+++分別賦值1、2、3，線性趨勢(shì)檢驗(yàn)F=97.643，P＜0.001。進(jìn)一步進(jìn)行等級(jí)相關(guān)分析，肝組織中HSP70蛋白表達(dá)強(qiáng)度與肝纖維化程度呈正相關(guān)（r=0.861，P＜0.001），見表2。

2.4 BA患兒肝纖維化程度對(duì)患兒生存時(shí)間的影響

46例患兒中，死亡15例，術(shù)后存活31例，1例患兒目前正等待肝移植。根據(jù)肝纖維化程度將患兒分為輕度組（Ⅰ期+Ⅱ期）17例和中重度組（Ⅱ期+Ⅲ期）29例，生存分析顯示，輕度組患兒術(shù)后生存率82.4%，中位生存時(shí)間為（34.6±2.3）個(gè)月；中重度組患兒術(shù)后生存率58.6%，中位生存時(shí)間為（25.5±2.8）個(gè)月；Log-Rank檢驗(yàn)顯示，兩組生存函數(shù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.27，P=0.012），見圖2。

表1 不同疾病患兒肝組織中HSP70蛋白表達(dá)比較 [n(%)]

表2 BA患兒不同纖維化程度肝組織中HSP70蛋白表達(dá)情況 （n=46）

圖2 BA患兒肝纖維化程度對(duì)患兒生存時(shí)間影響

2.5 BA患兒肝組織中HSP70蛋白表達(dá)對(duì)患兒生存時(shí)間的影響

BA患兒中，HSP70蛋白低表達(dá)組生存率85.0%，HSP70蛋白高表達(dá)組生存率53.8%，Kaplan-Meier生存分析顯示，HSP70蛋白低表達(dá)組術(shù)后中位生存時(shí)間為（34.0±2.6）個(gè)月，HSP70蛋白高表達(dá)組術(shù)后中位生存時(shí)間（18.3±2.2）個(gè)月，Log-Rank檢驗(yàn)顯示，兩組生存函數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.77，P=0.029），見圖3。

圖3 BA患兒肝組織中HSP70蛋白表達(dá)對(duì)患兒生存時(shí)間影響

3 討論

BA是導(dǎo)致嬰兒病理性黃疸的常見原因，易與生理性黃疸重疊而不易早期診斷，該病病因復(fù)雜，主要病理學(xué)改變?yōu)楦?、膽管?xì)胞損傷，膠原沉著及肝組織纖維化，最終可導(dǎo)致患兒死亡[8]。研究表明，肝纖維化在BA病程中發(fā)揮重要作用[9]。亦有研究指出[10]，BA患兒在接受Kasai術(shù)治療后，肝纖維化進(jìn)程并未停止。因此，如何有效阻止BA患兒肝組織纖維化以改善患兒預(yù)后已成為臨床研究重點(diǎn)。HSP70是HSPs家族重要成員，是組織細(xì)胞在受到外界刺激時(shí)產(chǎn)生的一種應(yīng)激性物質(zhì)，在細(xì)胞信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用，亦是組織器官纖維化復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過程中的關(guān)鍵性位點(diǎn)[11]。本研究顯示，BA患兒肝組織中HSP70蛋白高表達(dá)比例顯著高于膽總管囊腫患兒，說明HSP70蛋白在BA患兒肝組織中呈高表達(dá)，可能參與了BA發(fā)病過程。

研究表明，HSP70可激活先天免疫系統(tǒng)及促進(jìn)炎癥反應(yīng)，并可影響膠原合成[12]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，HSP 70可促進(jìn)透明質(zhì)酸及Ⅲ型前膠原合成而促進(jìn)肝組織纖維化[13]。本研究顯示，從肝組織纖維化Ⅰ期～Ⅳ期HSP70蛋白表達(dá)量不斷增加，說明HSP70蛋白表達(dá)隨著肝纖維化進(jìn)程而逐漸增加，進(jìn)一步進(jìn)行等級(jí)相關(guān)分析，肝組織中HSP70蛋白表達(dá)強(qiáng)度與肝纖維化程度呈正相關(guān)，提示HSP70表達(dá)可能與肝纖維化有關(guān)，可能參與了肝纖維化進(jìn)程。BA患兒行Kasai術(shù)治療后，影響預(yù)后的因素較多，其中，肝纖維化是影響患兒手術(shù)療效的重要因素[14]，本研究顯示，BA患兒中，HSP70蛋白低表達(dá)組生存率85.0%，HSP70蛋白高表達(dá)組生存率53.8%，說明HSP70蛋白表達(dá)與BA患兒Kasai術(shù)治療預(yù)后有關(guān)。Kaplan-Meier生存分析顯示，HSP70蛋白低表達(dá)組術(shù)后中位生存時(shí)間為（34.0±2.6）個(gè)月，HSP70蛋白高表達(dá)組術(shù)后中位生存時(shí)間（18.3±2.2）個(gè)月，進(jìn)一步說明BA患兒肝組織中HSP70蛋白高表達(dá)預(yù)示患兒預(yù)后不良，可作為判斷BA患兒預(yù)后的輔助指標(biāo)。

綜上所述，BA患兒肝組織中HSP70蛋白呈高表達(dá)，且與肝組織纖維化程度呈正相關(guān)，推測(cè)其可能參與了肝纖維化進(jìn)程，HSP70表達(dá)上調(diào)往往預(yù)示患兒預(yù)后不良，可作為判定患兒預(yù)后的輔助指標(biāo)。但本研究入選病例不多，可能存在一定誤差，且HSP70在肝纖維化中具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究明確。

[1] Ramachandran P, Safwan M, Reddy MS, et al.Recent trends in the diagnosis and management of biliary atresia in developing countries [J].Indian Pediatr, 2015, 52(10):871-879.

[2] Nio M, Wada M, Sasaki H, et al.Effects of age at Kasai portoenterostomy on the surgical outcome:a review of the literature [J].Surg Today, 2015, 45(7):813-818.

[3] Bijl EJ, Bharwani KD, Houwen RH, et al.The long-term outcome of the Kasai operation in patients with biliary atresia:a systematic review [J].Neth J Med, 2013, 71(4):170-173.

[4] Martinez-Rossi NM, Jacob TR, Sanches PR, et al.Heat shock proteins in dermatophytes:current advances and perspectives [J].Curr Genomics, 2016, 17(2):99-111.

[5] He W, Zhuang Y, Wang L, et al.Geranylgeranylacetone attenuates hepatic fibrosis by increasing the expression of heat shock protein 70 [J].Mol Med Rep, 2015, 12(4):4895-4900.

[6] Kim JS, Son Y, Jung MG, et al.Geranylgeranylacetone alleviates radiation-induced lung injury by inhibiting epithelial-to-mesenchymal transition signaling [J].Mol Med Rep, 2016, 13(6):4666-4670.

[7] Hu G, Chan Q, Quan X, et al.Intravoxel incoherent motion MRI evaluation for the staging of liver fi brosis in a rat model [J].J Magn Reson Imaging, 2015, 42(2):331-339.

[8] Chen Y, Nah SA, Chiang L, et al.Postoperative steroid therapy for biliary atresia:Systematic review and metaanalysis [J].J Pediatr Surg, 2015, 50(9):1590-1594.

[9] Zhou K, Xie G, Wen J, et al.Histamine is correlated with liver fi brosis in biliary atresia [J].Dig Liver Dis, 2016, 48(8):921-926.

[10] 熊曉峰, 馮杰雄.膽道閉鎖Kasai手術(shù)效果影響因素的研究進(jìn)展[J].中華小兒外科雜志, 2016, 37(5):382-386.

[11] Yang Y, Takeda A, Yoshimura T, et al.IL-10 is signi fi cantly involved in HSP70-regulation of experimental subretinal fi brosis [J].PLoS One, 2013, 8(12):e80288.

[12] Shin JU, Lee WJ, Tran TN, et al.HSP70 knockdown by siRNA decreased collagen production in keloid fi broblasts [J].Yonsei Med J, 2015, 56(6):1619-1626.

[13] 鄧麗麗, 臧家娜, 應(yīng)華忠, 等.熱休克蛋白70在兔非酒精性脂肪肝纖維化過程中的作用[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué), 2014, 34(2):107-112.

[14] Baruah RR, Bhatnagar V, Agarwala S, et al.Correlation of pre- and post-operative liver function, duct diameter at porta hepatis, and portal fi brosis with surgical outcomes in biliary atresia [J].J Indian Assoc Pediatr Surg, 2015, 20(4):184-188.

Heat shock protein 70 in liver fi brosis in infants with biliary atresia and its impact on prognosis

ZHAO Jinlei, FAN Xiaoge, JIN Sanding, LI Ping, ZHANG Hecheng (Department of Pediatric Surgery, Children's Hospital of Zhengzhou City, Zhengzhou 450053, Henan, China)

ObjectiveTo investigate the role of heat shock protein 70 (HSP70) in liver fi brosis in infants with biliary atresia (BA) and its impact on prognosis.MethodsFourty-six (46) cases of infants with BA undergoing elective Kasai surgery were selected.In the same period, 30 cases of children with choledochal cyst and 17 cases of children with portal vein cavernous transformation were selected.The expressions of HSP70 in liver tissues were detected using immunohistochemical staining.The liver fi brosis in children with BA was detected using Sirius red-saturated picric acid staining.The expressions of HSP70 proteins in different fi brotic liver tissues were detected by using double staining.All postoperative BA infants were followed up and ended at June 30, 2016.ResultsThe proportion of high expression of HSP 70 proteins in BA infants were signi fi cantly higher than that in children with choledochal cyst and vein cavernous transformation (P＜0.05).Rank correlation analysis showed that the expressions of HSP70 in liver tissues were positively correlated with the degree of liver fi brosis (r=0.861, P＜0.05).15 patients died among 46 cases of BA infants.The survival rate in BA children with mild liver fi brosis was 82.4%, which was signi fi cantly higher than 58.6% in the severe group (P＜0.05).The survival rate in HSP70 protein low expression group was 85.0%, while in HSP70 protein high expression group was 53.8%.Kaplan-meier survival analysis showed that the median survival time in the HSP70 protein low expression group was (34.0±2.6) months, while in the HSP70 protein high expression group was (18.3±2.2) months, the difference was statistically signi fi cant (χ2=4.765, P=0.029).ConclusionsThe expressions of HSP70 proteins in liver tissues in infants with BA were high and were positively correlated with the degree of hepatic fi brosis.It suggested the possible involvement of HSP70 in the process of liver fibrosis.The upregulated expressions of HSP70 often indicated poor prognosis in children.It could be used as determining biomarker for prognosis.

biliary atresia; heat shock protein 70; fi brosis; prognosis; child

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.02.007

2016-08-13）

（本文編輯：鄒 強(qiáng)）

靳三丁 電子信箱：zyh20160503@sina.com