陸燕紅張新星嚴永東顧文婧陳正榮朱燦紅王宇清黃 莉邵雪君季 偉

蘇州大學附屬兒童醫(yī)院 1.呼吸科，2.檢驗科（江蘇蘇州 215003）

·論 著·

混合感染因素對難治性肺炎支原體肺炎的影響

陸燕紅1張新星1嚴永東1顧文婧1陳正榮1朱燦紅1王宇清1黃 莉1邵雪君2季 偉1

蘇州大學附屬兒童醫(yī)院 1.呼吸科，2.檢驗科（江蘇蘇州 215003）

目的了解混合感染因素對難治性肺炎支原體肺炎（RMPP）的作用及影響。方法收集并分析2013年1月至2015年12月286例RMPP患兒的病史資料。依據(jù)病原檢測結(jié)果將患兒分為RMPP混合感染組和單純感染組，比較兩組患兒臨床特征及實驗室檢查結(jié)果。結(jié)果混合感染組患兒熱程和住院天數(shù)分別為12.（511.0～14.0）d、12.0（09.0～14.0）d，均明顯高于單純感染組的11.0（9.0～13.0）d、10.0（8.0～12.0）d，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01）?；旌细腥窘M患兒白細胞計數(shù)，中性粒細胞百分比，血小板計數(shù)，乳酸脫氫酶、C反應蛋白（CRP）＞40 mg/L、CRP＞100 mg/L及CK-MB升高發(fā)生率均高于單純感染組，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）?；旌细腥窘M氣胸、呼吸衰竭發(fā)生率高于單純感染組，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。混合感染組血液系統(tǒng)損害、心肌損害、電解質(zhì)紊亂發(fā)生率高于單純感染組，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。結(jié)論混合感染會使RMPP患兒發(fā)熱時間延長，全身炎癥反應加重，肺內(nèi)外并發(fā)癥發(fā)生率升高，并增加患兒的住院時間。

難治性肺炎支原體肺炎； 混合感染； 兒童

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）已成為5歲以上兒童常年社區(qū)獲得性肺炎的重要病原之一，兒童肺炎支原體肺炎（Mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）發(fā)病率占社區(qū)獲得性肺炎的10%～30%，有研究報道2007年MPP的發(fā)生率已是1999年的10倍[1]。近年來發(fā)現(xiàn)，一些MPP患兒即使應用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素進行治療，仍高熱難退，病變加重，或合并肺外系統(tǒng)損害，臨床治療難度增加且容易導致肺部后遺癥，如閉塞性細支氣管炎、壞死性肺炎等[2,3]，稱為難治性肺炎支原體肺炎（refractory Mycoplasma pneumoniae pneumonia，RMPP）。RMPP的發(fā)病機制可能涉及多方面，如過度免疫反應、混合感染、病原體耐藥、菌體載量以及個體免疫反應等[4,5]。本研究對6 340例呼吸道感染患兒進行RMPP臨床及實驗室檢查結(jié)果分析，了解混合感染在兒童RMPP發(fā)病機制中的作用，為RMPP的科學防控及治療提供依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 研究對象

收集2013年1月至2015年12月因呼吸道感染入住蘇州大學附屬兒童醫(yī)院呼吸科的6 340例患兒臨床資料，其中MPP患兒2 318例，RMPP患兒286例，年齡2個月～15歲。RMPP診斷標準：①年齡1個月～15歲；②符合肺炎診斷，有呼吸道癥狀伴或不伴發(fā)熱，X線提示肺部有實質(zhì)性浸潤[6]；③符合MP感染標準，血清MP抗體陽性或痰MP DNA陽性；④符合難治性肺炎標準，在當?shù)丶氨驹簯么蟓h(huán)內(nèi)酯類抗生素治療7 d或以上，仍持續(xù)發(fā)熱、臨床癥狀加重、肺部影像學表現(xiàn)加重[7]。

RMPP患兒依據(jù)病原檢測結(jié)果分為單純感染組（僅有MP感染）和混合感染組（除MP感染外，還檢出1種或以上其他病原感染）。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料 收集入組患兒的臨床資料，包括年齡、性別、發(fā)熱熱程、臨床癥狀、臨床診斷、實驗室檢查結(jié)果、影像學檢查結(jié)果等。

1.2.2 標本采集 入院24 h內(nèi)用一次性吸痰管插入患兒鼻腔7～8 cm，利用負壓吸取痰液 1～2 mL送檢。入院24 h內(nèi)及治療7～10 d病情好轉(zhuǎn)時采集靜脈血1～2 mL，30 min內(nèi)送檢。

1.2.3 痰MP DNA檢測 采用實時熒光定量PCR法。取新鮮痰液標本，經(jīng)震蕩、離心、去上清，加入裂解液提取DNA，進行PCR擴增。探針結(jié)合序列位于上游引物與下游引物之間。在特異性雜交熒光探針的5’端結(jié)合熒光發(fā)光基團，在3’端結(jié)合熒光吸收基團。將樣品（標本和質(zhì)控品）上清液2 μL直接加入陽性定量參考品于反應管中，12 000 r/min，離心半徑9.5 cm，離心300 s，離心后放入儀器樣品槽。循環(huán)溫度設置：93℃ 2 min→93℃ 45 s→55℃ 60 s，10個循環(huán)；93℃30 s→55℃ 45 s，30個循環(huán)。熒光采集點設置55℃ 45 s。熒光定量PCR的結(jié)果以Ct值顯示，反應結(jié)束電腦自動分析結(jié)果。結(jié)果判定：①Ct值≥39，為陰性；②Ct值＜38，陽性；③Ct值38～39進行重復測定。試劑盒購自廣州中山大學達安基因股份有限公司，儀器為美國BIO-RAD公司的Icycleriq熒光定量PCR儀。

1.2.4 血清MP特異性抗體檢測 采用半定量法檢測。取患兒外周血1～2 mL，常規(guī)離心，取血清10 μL，用樣本緩沖液1:100稀釋，充分混勻后加入抗原包被的微孔板上的微量孔中，將標準血清和對照血清各100 μL加入微量孔中。室溫（18℃～25℃）下溫育30 min，緩沖液洗滌3遍后加入100 μL過氧化物酶標記的抗人IgM（羊）抗體。室溫溫育30 min，倒掉微孔板內(nèi)液體，洗滌3遍后，滴加100 μL色原/底物液至每一微孔，避光溫育15 min。以與加色原/底物液相同的速度和順序滴加100 μL終止液至每一微孔。終止后于酶標儀450 nm波長處測光密度值（D值）。計算樣本D值和標準品D值的比值，通過比值半定量判斷MP-IgM結(jié)果。比值＞1.1為陽性，0.8～1.1為可疑，＜0.8為陰性。對出院時復查的血清MP-IgM較入院時第一次檢測值增高≥1.5倍診斷為MP急性感染[8]。試劑盒購自德國歐蒙醫(yī)學實驗診斷股份有限公司。

1.2.5 其他病原檢測 ①采用直接免疫熒光法檢測呼吸道7種常見病毒，即呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV），腺病毒（adenovirus，ADV），流感病毒A、B型（influenza virus type A and B，IV-A和IV-B），副流感病毒l、2、3型（parainfluenza virus type 1～3，PIV l～3）。檢測試劑為D3 UltraTM Respiratory Virus Screaning & LD KIT（DIAGNOSTIC HYBRIDS，USA），操作步驟及結(jié)果判斷按說明書進行。熒光顯微鏡購自德國萊卡公司。②采用熒光定量PCR法檢測肺炎衣原體（Chlamydia pneumoniae，CP）、博卡病毒（human bocavirus，HBoV），RT-PCR法檢測鼻病毒（human rhinovirus，HRV）、人偏肺病毒（human metapneumovirus，hMPV）。檢測試劑采用中山大學達安基因有限公司的核酸擴增熒光試劑盒，操作步驟嚴格按照試劑盒要求進行，HRV、hMPV以陽性或陰性表示，HBoV、MP及CP記錄DNA的基因拷貝數(shù)量。③細菌培養(yǎng)，取10 μL痰標本制成懸液，取懸液分別接種于哥倫比亞選擇性培養(yǎng)基（血平板、巧克力平板各1塊），置5% CO2培養(yǎng)箱（35℃，18～24 h）培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)基菌落特點、革蘭染色、顯微鏡下觀察及生化反應等方法鑒定細菌，人工計數(shù)菌落＞1.0×103cfu/ mL為陽性。哥倫比亞瓊脂為英國 Oxoid 公司產(chǎn)品。具體操作及結(jié)果判定按標本的細菌學檢驗程序進行。

1.3 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0軟件包，計數(shù)資料以百分比或率表示，各組陽性率比較采用χ2、校正χ2或Fisher精確概率法檢驗。非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，兩組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

2013年1月—2015年12月間6 340例住院患兒中MPP 2 318例（36.56%），符合RMPP診斷者286例，其中混合感染組68例（23.78%），單純感染組218例（76.22%）?；旌细腥窘M患兒中位年齡為5.70（3.85～7.33）歲，其中男36例、女32例；單純感染組平均年齡為5.98（3.67～8.17）歲，其中男112例、女106例，兩組患兒性別（χ2=0.05，P=0.822），年齡（Z=0.85，P=0.395）差異無統(tǒng)計學意義。

2.2 RMPP患兒混合感染情況

混合感染組68例患兒中，混合RSV感染5例，混合ADV感染2例，混合IV-A感染 3例，混合PIV3感染3例，混合HBoV感染13例，混合HRV感染6例，混合肺炎鏈球菌感染39例，混合流感嗜血桿菌感染5例，混合金黃色葡萄球菌感染2例，混合卡他莫拉菌感染1例，混合大腸埃希菌感染1例，未見IV-B、PIV1、PIV2、hMPV、CP等混合感染?；旌细腥局幸苑窝祖溓蚓腥咀畛Ｒ?，高達57.35%，其次為HBoV。

2.3 兩組臨床及實驗室特征比較

RMPP混合感染組患兒熱程和住院天數(shù)分別為12.5（11.0～14.0）d、12.0（9.0～14.0）d，均明顯高于單純感染組的11.0（9.0～13.0）d、10.0（8.0～12.0）d，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.001）?；旌细腥窘M患兒白細胞計數(shù)（WBC）、中性白細胞百分比（N%）、血小板計數(shù)（PLT）、乳酸脫氫酶 （LDH）均高于單純感染組，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）?；旌细腥窘M患兒C反應蛋白（CRP）升高（＞8 mg/L）發(fā)生率與單純感染組的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但CRP＞40mg/L、CRP＞100mg/L發(fā)生率均高于單純感染組，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。混合感染組患兒心型肌酸激酶（CK-MB）升高發(fā)生率高于單純感染組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而兩組丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）升高發(fā)生率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 混合感染組和單純感染組臨床特征及實驗室檢查比較

2.4 混合感染與單純感染組肺內(nèi)癥狀比較

RMPP混合感染組患兒大葉性肺炎、胸腔積液、肺不張發(fā)生率與單純感染組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。RMPP混合感染組患兒氣胸及呼吸衰竭發(fā)生率均高于單純感染組，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。見表2。

2.5 混合感染與單純感染組肺外并發(fā)癥比較

RMPP混合感染組患兒肺外并發(fā)癥總體發(fā)生率明顯高于單純感染組，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.006）。RMPP混合感染組患兒血液系統(tǒng)損害（包括白細胞、血紅蛋白、血小板減低等）、心肌損害（CK-MB升高）、電解質(zhì)紊亂（低鉀血癥、低鈉血癥等）均高于單純感染組，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），兩組消化系統(tǒng)損害（ALT升高、肝脾腫大等）及皮膚、關(guān)節(jié)損害（皮疹、關(guān)節(jié)腫痛等）的發(fā)生率差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。見表3。

表2 混合感染組和單純感染組肺內(nèi)癥狀比較 [n(%)]

表3 混合感染組和單純感染組肺外并發(fā)癥比較 [n(%)]

3 討論

MP主要以氣溶膠形式通過飛沫傳播，一年四季均可發(fā)病，夏秋季節(jié)高發(fā)，每2～3年有一個流行高峰，流行期可持續(xù)2年左右[9,10]。傳統(tǒng)觀念認為，MP感染主要引起上呼吸道感染、肺炎，僅有少數(shù)可引起嚴重的肺外并發(fā)癥，如腎炎、免疫性溶血性貧血等，且MP感染具有一定的自限性，即使不治療，多數(shù)患兒會逐漸自愈。但近年來，臨床上MP感染后短時間內(nèi)出現(xiàn)肺部大片炎癥、中到大量胸腔積液、氣胸等的RMPP病例較前明顯增加，其病情進展迅速，疾病后期出現(xiàn)胸膜增厚，甚至可導致永久的肺部后遺癥，如支氣管擴張、單側(cè)透明肺、急性呼吸窘迫綜合征、閉塞性細支氣管炎、壞死性肺炎、肺纖維化等[3-5]，臨床治療困難，病程遷延。雖然有關(guān)RMPP發(fā)病機制的研究報道較多，但其具體發(fā)病機制目前尚不清楚。有學者認為RMPP發(fā)病主要與患兒對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥、混合感染以及免疫炎癥反應等有關(guān)[1]。也有研究者認為MP感染后患兒病情的輕重可能與MP感染的菌體載量、個體的免疫炎癥反應等有關(guān)[11,12]。有研究認為混合感染可以加重MPP患兒病情，也有MPP混合感染致患兒死亡的報道[13]。本研究顯示，RMPP混合感染中以混合肺炎鏈球菌感染最為常見，高達57.35%，其次為HBoV，其余可見RSV、ADV、IV-A、PIV3、HRV、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌等。

國內(nèi)有研究認為，MPP存在混合感染的患兒發(fā)熱時間明顯長于非混合感染患兒，且住院時間更長[12]。CRP可作為判斷MPP炎癥反應輕重較為靈敏的指標。相關(guān)研究顯示，RMPP的臨床特征包括發(fā)熱持續(xù)10 d以上、CRP＞40 mg/L、肺部高密度均勻一致實變陰影（超過2/3肺葉，CT值＞40 HU，伴或不伴有胸腔積液）等[14]。PLT及LDH水平在RMPP患兒中均有所升高[15]。也有學者發(fā)現(xiàn)RMPP患兒血清中IL-18含量與病情嚴重程度密切相關(guān)，而血清中LDH含量又與IL-18水平呈正相關(guān)，因此血清LDH水平可判斷RMPP的嚴重程度[16]。本研究顯示，存在混合感染的RMPP患兒發(fā)熱時間長于單純感染患兒，其白細胞計數(shù)、中性粒細胞百分比、血小板、LDH均高于單純感染患兒。雖然混合感染患兒CRP升高（＞8 mg/L）發(fā)生率與單純感染患兒的差異不明顯，但其CRP＞40 mg/L、CRP＞100 mg/L發(fā)生率均高于單純感染的患兒，且RMPP混合感染患兒住院時間明顯長于單純MP感染患兒。

有研究認為RMPP患兒胸部影像學表現(xiàn)為大葉性肺炎、胸腔積液的發(fā)生率均較普通MPP患兒高[5]。一項多因素logistic回歸分析研究顯示，肺部影像學表現(xiàn)為大片實變影、CRP升高明顯對早期RMPP的診斷具有一定的臨床指導價值[17]。國內(nèi)學者報道RMPP伴有混合感染的患兒肺不張及肺實變發(fā)生率與非混合感染患兒無明顯差別，但胸腔積液發(fā)生率更高[12]。而本研究顯示RMPP混合感染的患兒大葉性肺炎、胸腔積液及肺不張的發(fā)生與單純MP感染患兒并無明顯差別，但混合感染的患兒氣胸及呼吸衰竭的發(fā)生率更高，需引起重視。

多項研究表明，RMPP可累及多個肺外器官，發(fā)生多種肺外并發(fā)癥，如心肌炎、腎炎、腦炎、癲癇、免疫性溶血性貧血、Stevens-Johnson綜合征等[2,3,17,18]。有研究報道混合其他病原感染后可進一步加重MP肺外并發(fā)癥的發(fā)生[18]。本研究發(fā)現(xiàn)RMPP混合感染患兒更容易發(fā)生血液系統(tǒng)損害、心肌損害、皮膚及關(guān)節(jié)損害、電解質(zhì)紊亂等方面的并發(fā)癥，但混合感染并沒有增加消化系統(tǒng)并發(fā)癥的發(fā)生率，這與本課題組前期研究結(jié)論一致[5]。

綜上所述，混合感染會使RMPP患兒發(fā)熱時間延長，全身炎癥加重，使肺內(nèi)外并發(fā)癥發(fā)生率升高，并增加患兒的住院時間。通過本研究，初步了解混合感染在RMPP患兒發(fā)病中的作用及影響，為臨床醫(yī)師合理治療RMPP提供參考依據(jù)。

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Role and in fl uence of coinfection factor to refractory Mycoplasma pneumoniae pneumonia in children

LU Yanhong，ZHANG Xinxing，YAN Yongdong，GU Wenjing，CHEN Zhengrong，ZHU Canhong，WANG Yuqing， HUANG Li， SHAO Xuejun，JI Wei (1.Department of Respiratory Disease, 2.Department of Clinical Laboratory， Children's Hospital of Soochow University, Suzhou 215003, Jiangsu, China)

ObjectiveTo study the role and in fl uence of coinfection factor to refractory Mycoplasma pneumoniae （MP）pneumonia (RMPP) in children.MethodsClinical data and sputum specimen of 286 hospitalized children of RMPP were collected from January, 2013 to December, 2015.According to the results of pathogen detection, children were divided into RMPP coinfection group and simple MP infection group.Clinical features and laboratory tests were compared between the two groups.ResultsThe durations of fever and hospitalization of the RMPP coinfection group were 12.5（11.0-14.0）days and 12.0（9.0-14.0）days, respectively, which were significantly longer than those of simple MP infection group, 11.0（9.0-13.0）days and 10.0（8.0-12.0）days (Z=3.947, P＜0.001, Z=3.519, P＜0.001).In the RMPP coinfection group, white blood cell count, the percentage of neutral granulocytes, pleteltes count, lactate dehydrogenase and the incidence of C-reaction protein (CRP) greater than 40 mg/L, and CRP greater than 100 mg/L, elevated CK-MB of were higher than those of simple MP infection group (all P＜0.05), but the incidence of CRP greater than 8 mg/L and elevated ALT in the two groups showed no signi fi cant difference (both P＞0.05).The incidence of pneumothorax and respiratory failure in children of RMPP coinfection group were higher than those in the simple MP infection group (χ2=5.873, P=0.015, χ2=11.995, P=0.001), but the incidence of lobar pneumonia, pleural effusion, atelectasis in the two groups had no signi fi cant difference (all P＞0.05).The incidence of blood system damage, myocardial damage, skin and joint damage and electrolyte disorders in RMPP coinfection group were higher than those of simple MP infection group (all P＜0.05).ConclusionsChildren with RMPP coinfection tend to be with prolonged duration of fever, increased systemic inflammation, higher incidence of pulmonary and extrapulmonary complications, and longer duration of hospitalization.

refractory Mycoplasma pneumoniae pneumonia; coinfection; child

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.02.001

2016-08-15)

(本文編輯：蔡虹蔚)

蘇州市“科教興衛(wèi)”青年科技項目（No.KJXW2016019）；國家自然科學基金項目（No.81570016）；國家青年自然科學基金項目 （No.81401296）

季偉 電子信箱:szdxjiwei@163.com