趙子明，劉新華，趙媛莉，袁 圣，章晉勇

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院,江蘇泰州 225300；2.中國科學院水生生物研究所，淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室，武漢 430072)

荊州碘泡蟲(粘體動物門，碘泡蟲科)重描述及其基于18S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育關系分析

趙子明1，劉新華2，趙媛莉2，袁 圣1，章晉勇2

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院,江蘇泰州 225300；2.中國科學院水生生物研究所，淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室，武漢 430072)

本實驗利用現(xiàn)行主流分類衍征，重新對荊州碘泡蟲(Myxoboluskinchowensis)進行了詳細描述，其分類特征如下：包囊圓形，寄生于鯽肌肉與腎臟，肌肉包囊大小(126.7±1.8) μm，腎臟包囊直徑為94.2 μm；兩寄生部位各形態(tài)參數(shù)無顯著差異,成熟孢子正面觀呈梨形，縫面觀呈紡錘形，含一大一小兩梨形極囊；無明顯囊間突起，孢子后端無褶皺，無粘液膜。組織病理顯示在兩寄生部位均未引起嚴重的炎性反應，且感染強度不高，推測該種對宿主無顯著影響?；?8S rDNA進化分析發(fā)現(xiàn)荊州碘泡蟲與寄生在肌肉部位的碘泡蟲屬種類聚為一個大枝，然后該大枝又根據(jù)地理位置遠近分為北美枝、歐洲枝以及亞洲枝。通過形態(tài)比較研究以及分子分析可確定荊州碘泡蟲為有效種，其寄主為鯽，寄生部位為肌纖維間和腎小囊。此外，兩組織差異明顯的寄生部位出現(xiàn)說明荊州碘泡蟲相應的放射孢子蟲在宿主鯽體內(nèi)存在不同的發(fā)育與移行途徑，而肌肉可能為其常規(guī)寄生部位，腎臟為其異常寄生部位，這種寄生部位的轉(zhuǎn)移與宿主轉(zhuǎn)變可能是粘孢子蟲物種多樣性形成的機制。

粘孢子蟲；荊州碘泡蟲(Myxoboluskingchowensis)；18S rDNA；腎臟；肌肉

粘體動物(Myxozoans)是一類廣范存在的動物寄生蟲，寄主范圍涉及從無脊椎動物到脊椎動物的廣泛宿主，迄今報道的3 000余種主要來自魚類和底棲環(huán)節(jié)動物[1]，該類寄生蟲的多樣性依然被嚴重低估是業(yè)界的普遍認識，隨著研究力度的加大，越來越多的粘體動物會被發(fā)現(xiàn)，尤其是寄生于陸生脊椎動物的種類[2]。我國粘體動物(均為粘孢子蟲綱種類)多樣性豐富，迄今已記述了700余種[3-4]，但大多數(shù)種類僅限于形態(tài)描述，且數(shù)據(jù)尚不十分充分。由于粘孢子蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)簡單、種內(nèi)形態(tài)存在較大變異及種類豐富等因素，種類鑒定及命名過程中產(chǎn)生了大量同物異名或同名異物的現(xiàn)象，需要后續(xù)補充描述并修正[5-6]。此外，長期以來我國學者認為粘體動物(粘孢子蟲)屬原生動物[3,7]，而隨著認識的深入，尤其是比較基因組學的應用，粘體動物已被普遍認為是一類適應寄生生活的刺胞動物[8]。因此，利用包括形態(tài)數(shù)據(jù)、生態(tài)數(shù)據(jù)(寄主、組織趨向性及地理分布等)與系統(tǒng)發(fā)育特征(基于小核糖體RNA)的現(xiàn)行主流粘孢子蟲分類衍征[9]就《中國動物志 粘體動物門 粘孢子綱》所描述的種類，尤其是新種進行厘定，對我們深入理解我國水生粘孢子蟲多樣性及水生動物粘孢子蟲病防控等是十分有必要的[1,4-5,9-11]。

1 材料和方法

1.1 樣本采集及處理

于2014年7月發(fā)現(xiàn)武漢市蔡甸池塘養(yǎng)殖異育銀鯽(C.auratusgibelio)口腔附近有疑似粘孢子蟲白色包囊狀物，收集實驗魚(10尾，體重40.1～84.1 g) 并活體運回實驗室，暫養(yǎng)于50 L水族箱中。先用肉眼、放大鏡等仔細觀察魚體表、鰓、鰭、腎臟、肝臟、脾臟、腸道等表面是否具有包囊。同時，各器官均取部分組織進行壓片，顯微觀察是否有肉眼不可見的包囊或離散的粘孢子。若發(fā)現(xiàn)包囊或孢子，立即用光學顯微鏡對新鮮孢子進行觀察、測量、拍照。同時將所感染的病灶組織分別保存在95%酒精或10%中性福爾馬林中，以用于后續(xù)的分子或組織病理分析。

1.2 形態(tài)學比較

取少量感染組織于蓋玻片上，滴少量蒸餾水，置于顯微鏡下(Olympus BX53)觀察、拍照及測量。參照Lom & Arthur[14]建議的描述標準對腎臟和肌肉感染的疑似荊州碘泡蟲進行測量和描述，分別測量了成熟孢子長、寬、厚以及極囊長、寬 (n=50)。測量數(shù)值均以微米(μm)為單位，以平均值±標準差(變化范圍)的形式表示。統(tǒng)計分析主要通過GraphPad Prism5.0軟件來完成。應用CorelDraw X6.0 軟件繪制模式圖。

1.3 組織病理

樣品固定48 h后，即按照常規(guī)組織學方法進行石蠟切片制作，切片厚度4～6 μm，HE染色，Olympus BX53拍照存檔。

1.4 DNA提取、18S rDNA序列的擴增和測定

取部分用95%酒精保存的組織，剪成碎片并用PBS離心洗滌兩次以除去殘余酒精。利用細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(Qiagen,德國)提取樣品基因組DNA。18S rDNA序列片段擴增采用引物MyxospecF (TTCTGCCCTATCAACTWGTTG)[13]和18R (CTACGGAAACCTTGTTACG)[15]。PCR反應體系包括1 μL DNA,12.5 μL 1× PCR mixture (康為，北京)，正反引物各1 μL (10 μmol/L)，然后加雙蒸水至25 μL體系。反應程序為94 ℃預變性4 min，35個循環(huán)：94 ℃ 變性1 min；46 ℃ 退火50 s；65 ℃延伸90 s；65 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒(康為，北京)純化回收，將目的片段連接到PMD18-T載體(Takara,日本)，再轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞DH5α中,50 μL/mL氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)基均勻涂布并培養(yǎng)過夜,挑取陽性克隆,用于測序。測序在自動測序儀ABI PRISM?3730 DNA Sequencer (Applied Biosystems USA)上完成。測序結(jié)果通過BioEdit[16]進行拼接，并根據(jù)測序峰圖人工校正(DNASTAR INC.,Madisom,Wis)，將拼接完畢的序列提交至GenBank。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育關系分析

將所獲得序列通過NCBI網(wǎng)站進行BLAST分析，并從GenBank上選取部分粘孢子蟲18S rDNA序列數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。選取薩氏新角形蟲(CeratonovaShasta)(GenBank登錄號AF001579)為外群。利用CLUSTAL 1.8[17]對選取的序列進行多重比對。分別利用最大似然法 (Maximum Likehood,ML) 和貝葉斯法 (Bayesian Inferences,BI) 進行系統(tǒng)發(fā)育分析。通過jModelTest[18]挑選最佳核苷酸替代模型應用于ML和BI分析。ML分析利用PhyML 3.0[19]軟件進行運算100代。BI分析利用Mr.Bayes[20]軟件進行操作，以隨機樹 (Random)為起始樹，替換模型參數(shù)Nst為6，馬爾科夫鏈的蒙特卡洛方法 (Markov Chain Monte Carlo process) 設置為4條鏈同時運行1 000 000代， 獲得的系統(tǒng)發(fā)育樹用Treeview1.6[21]和Adobe Illustrator (Adobe Systems Inc.美國) 編輯、注釋。

2 結(jié)果

寄生蟲檢查發(fā)現(xiàn)鯽口腔附近出現(xiàn)的白色囊腫是大量的扁彎口吸蟲(Clinostomumcomplanatum)的囊蚴寄生所致，感染率100%，平均感染強度為122個囊蚴每條魚，但感染魚的飽滿度并未受顯著影響 (未發(fā)表數(shù)據(jù))。涂片發(fā)現(xiàn)脾臟、肝臟、腎臟、肌肉均有粘孢子蟲感染，其中肌肉和腎臟發(fā)現(xiàn)的種類形態(tài)相似，疑是荊州碘泡蟲，而脾臟與肝臟發(fā)現(xiàn)的粘孢子蟲形態(tài)差異明顯(另文分析)。

2.1 形態(tài)學描述

由于肌肉中孢囊過小且少，采用雙玻片法觀察，可見肌肉中有極少量包囊，呈圓形，直徑約為(126.7±1.8 μm) (n=3)，小心分離出現(xiàn)包囊肌肉組織用于組織學觀察，但切片中僅發(fā)現(xiàn)散在于肌細胞間的成熟孢子 (圖1)。腎臟中發(fā)現(xiàn)的包囊也呈圓形，最大的直徑可達到94.2 μm (圖 1)。肌肉與腎臟的孢子形態(tài)非常相似，成熟孢子正面觀呈梨形，側(cè)面觀呈紡錘形，均含一大一小的梨形極囊，詳細形態(tài)分類參數(shù)如下：肌肉寄生的孢子長(11.2±0.55)μm(9.8～12.1 μm)，寬(8.6±0.62)μm(7.1～9.7 μm)，厚(6.6±0.36)μm(5.9～7.4 μm)，極囊大小不等，呈梨形，大極囊長為(6.8±0.51)μm(5.8～7.7 μm)，寬為(3.4±0.33)μm(2.9～4.1 μm)，小極囊長(5.8±0.60)μm(4.8～7.0 μm)，寬(2.7±0.41)μm(1.9～3.6 μm)，極絲圈數(shù)不等，其中大極囊長為8～9圈，而小極囊為5～6圈(圖2,3)。腎臟寄生的孢子形態(tài)大小與肌肉寄生的相差不大，統(tǒng)計分析差異不顯著(圖4)，孢子長(10.8±0.52)μm(10.0～12.1 μm)，寬(8.3±0.53)μm(6.0～9.4 μm)，厚(6.4±0.28)μm(5.5～7.1 μm)，大極囊長(6.8±0.45)μm(5.2～8.0 μm)，寬(3.2±0.29)μm(2.4～3.7 μm)，小極囊長(5.6±0.52)μm(4.6～7.1 μm)，寬(2.6±0.29)μm(2.0～3.4 μm)，極絲圈數(shù)與肌肉上發(fā)現(xiàn)的一致。成熟孢子均無明顯囊間突起，孢子后端也無褶皺，粘液膜未觀察到(圖2,3,4)。兩處寄生的孢子形態(tài)與荊州碘泡蟲基本相似 (表1)，但腎臟發(fā)現(xiàn)的在大小上與《中國動物志，粘體動物門，粘孢子蟲綱》[3]的描述更接近。荊州碘泡蟲各次記述及與相似種的形態(tài)參數(shù)比較，見表1。

圖1 荊州碘泡蟲寄生于肌肉與腎臟病理切片.Fig.1 Histopathology of infected muscle and kidney ofC.auratus gibelio by M.kinchowensis.

示孢囊破碎后散在于肌細胞間的成熟孢子(黑色箭頭),比例尺=20 μm (左)；示寄生于腎小囊的孢囊，比例尺=40 μm (右)。

圖2 荊州碘泡蟲孢子形態(tài).Fig.2 The spore of M.kinchowensis. (a) 殼面觀,比例尺=10 μm；(b) 縫面觀，比例尺=10 μm.

圖3 荊州碘泡蟲模式圖.Fig.3 The schematic drawing of M.kinchowensis. (a)殼面觀；(b)縫面觀；比例尺=5 μm.

圖4 寄生在肌肉和腎臟荊州碘泡蟲形態(tài)學統(tǒng)計分析Fig.4 The statistical analysis of morphometrical differences between kidney and muscle isolates of M.kinchowensis.

2.2 組織病理

組織病理觀察發(fā)現(xiàn)，肌肉寄生荊州碘泡蟲由于壓片后分離的組織破碎，未見完整的包囊結(jié)構(gòu)，成熟孢子分布于于肌間，肌纖維幾乎保持完整，未見明顯的病理變化；而腎臟寄生荊州碘泡蟲可見完整包囊位于腎小囊中，包囊外包一層上皮細胞，腎小管及腎實質(zhì)保持完整，未見顯著的炎性反應(圖1)。

2.3 分子分析

采用粘孢子蟲通用引物成功擴增出其SSU rDNA部分序列，其中肌肉荊州碘泡蟲為1 717 bp，而腎臟的為1 712 bp，二者進行比對發(fā)現(xiàn)相似性達到99.4%。將二者在NCBI中進行BLAST發(fā)現(xiàn)，與以下種類相似性較高：肌肉碘泡蟲(M.musculi,93%,JQ388891)、餅形碘泡蟲(M.artus,93%,

表1 荊州碘泡蟲與其他相似種類形態(tài)學比較

注：a均值±方差;b最小值-最大值;c均值;SI:寄生部位;H:宿主;SL:孢子長;SW:孢子寬;ST:孢子厚;LPCL:大極囊長;LPCW:大極囊寬;SPCL:小極囊長;SPCW:小極囊寬;NO.PF:極絲圈數(shù);REF:參考文獻。

FJ710799)、鯉碘泡蟲(M.cyprini,93%,AF380140),軍刀碘泡蟲(M.pelecicola,92%，KP241961),假異形碘泡蟲(M.pseudodispar,92%,AF380142) 等，其中最高相似性為93%，遠低于種內(nèi)相似性水平。系統(tǒng)發(fā)育關系分析發(fā)現(xiàn)荊州碘泡蟲與寄生在肌肉的碘泡蟲屬種類聚為一個大枝，而后又根據(jù)地理位置遠近分為北美枝、歐洲枝以及亞洲枝(圖5)。

圖5 基于荊州碘泡蟲 SSU rRNA基因構(gòu)建所得的貝葉斯樹(BI).Fig.5 Phylogenetic tree generated by Bayesian analysis of aligned partial SSU rRNA gene sequences ofM.kinchowensis and related species,rooted at Ceranova shasta. 各分支上的數(shù)值依次為BI法產(chǎn)生的后驗概率和ML法產(chǎn)生的置信度值；荊州碘泡蟲以粗體表示

分類學信息：

荊州碘泡蟲M.kingchowensisMa & Chen,1963.

宿主：異育銀鯽C.auratusgibelio(Bloch).

采樣地點：武漢市蔡甸區(qū).

寄生部位：肌肉和腎臟.

宿主大?。后w重40.1～84.1 g.

感染率：腎臟50% (5/10)、肌肉20% (2/10).

樣本保存：10%福爾馬林固定標本保存于中科院水生生物研究所魚病研究室，標本號：MTR201407301、MTR201407302.

GenBank序列號：KP400624、KP400625.

3 討論

碘泡蟲屬是粘孢子蟲中種類數(shù)量最多的一個屬，目前在中國已報道300多種[3,10-11]。早期的碘泡蟲屬的鑒定均僅是通過經(jīng)典形態(tài)學比較鑒定，而沒有將組織趨向性和宿主特異性這兩個重要分類特征考慮進去，導致在我國所記載的許多種類存在多宿主、多組織器官寄生的現(xiàn)象，因而造成許多隱存種的存在[3,12]。同時，早期報道記錄的種類由于缺少分子數(shù)據(jù)的支持，從而出現(xiàn)許多同名異物、同物異名的現(xiàn)象，如此前鯽寄生的圓形碘泡蟲 (Myxobolusrotundus) 被鑒定為同名異物種，將其重新命名為丑陋圓形碘泡蟲(M.turpisrotundus)，嗜鰾碘泡蟲(M.physophilus)為伯麥碘泡蟲(M.permagnus)的同物異名種，取消伯麥碘泡蟲，信陽單極蟲(Thelohanllusxinyangensis)被厘定為吉陶單極蟲(T.kitauei)，官橋碘泡蟲(M.guanqianensis)被糾正為吳李碘泡蟲(M.wulii)等等[3,5-6]。值得指出的是，早期文獻交流不暢也是導致粘孢子蟲分類及鑒定混亂的一個重要原因。

荊州碘泡蟲在《中國動物志，粘體動物門，粘孢子綱》[3]中的記述非常簡單，并存在多宿主、多寄生部位的描述，且缺乏分子證據(jù)的支持，因此其作為新種描述有必要根據(jù)現(xiàn)行的粘孢子蟲分類標準予以厘定并確定其分類的有效性[3]。我們此次在異育銀鯽肌肉和腎臟所發(fā)現(xiàn)碘泡蟲屬種類，通過形態(tài)學比較及分子系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，兩者均為荊州碘泡蟲，其成熟孢子形態(tài)大小與原始記載雖略有差異，如肌肉上發(fā)現(xiàn)的較腎臟以及原始記載的孢子要長，而孢子寬、厚卻相差不大，同時原始記載的極絲圈數(shù)較少，大極囊5～6圈，而小極囊4～5圈，這可能與當時顯微鏡分辨率不高有關。在此次研究中，我們所觀察到的大極囊圈數(shù)為8～9圈，小極囊圈數(shù)為5～6圈，但均在種內(nèi)形態(tài)變異范圍內(nèi)。肌肉碘泡蟲(M.musculi)主要是在歐洲報道，早期將荊州碘泡蟲鑒定為肌肉碘泡蟲主要是基于寄生部位而言，但其宿主以及形態(tài)大小均與荊州碘泡蟲存在較大差異，18S rDNA比對發(fā)現(xiàn)二者相似性只有93%，這更進一步說明早期鑒定有誤，也說明荊州碘泡蟲的有效性[22]。其它與荊州碘泡蟲形態(tài)相似的種類還有寄生在鯽腎臟的武漢碘泡蟲(M.wuhanensis)以及寄生在鯽鰓上的廣州碘泡蟲(M.cantonensis)[4]。武漢碘泡蟲在腎臟未觀察到包囊結(jié)構(gòu)，同時其大小、極囊極絲圈數(shù)均較荊州碘泡蟲少；廣州碘泡蟲孢子長、寬、厚均較荊州碘泡蟲要大，兩個極囊也較大，但極絲圈數(shù)卻少于荊州碘泡蟲。此外廣州碘泡蟲寄生在鯽魚鰓上，而荊州碘泡蟲寄生在腎臟和肌肉。

組織寄生粘孢子蟲的嚴格組織趨向性(Tissue tropism)或特異性(tissue specificity)已成為學界共識[23],但根據(jù)現(xiàn)行的粘孢子蟲分類標準，近年來頻頻發(fā)現(xiàn)同一種類存在多個寄生部位，如吳李碘泡蟲同時寄生于鯽肝臟和金魚鰓絲[6]，吉陶單極蟲可同時寄生于鯉腸道與皮膚[24]。粘孢子蟲感染魚類主要通過水柱中的放射孢子蟲來完成[25]，水柱中的感染源放射孢子蟲通過魚體表、皮膚的粘液細胞始發(fā)感染，在這個階段抗性宿主和易感宿主在相同棲息地受感染的幾率是一樣的，區(qū)別在于侵染后，抗性宿主自身的免疫機制可阻斷來自放射孢子蟲的感染性胚質(zhì)的發(fā)育及移行至合適的寄生部位，這也是混養(yǎng)不同品種可降低易感品種粘孢子蟲病發(fā)病率與強度的理論基礎[23]。但迄今人們對粘孢子蟲寄生部位多樣性選擇(魚體幾乎每個器官都能被不同粘孢子蟲寄生)機制或決定不同粘孢子蟲選擇不同的寄生部位的關鍵因子缺乏了解。迄今發(fā)現(xiàn)最多類型的三突放射孢子蟲對應的粘孢子蟲可寄生多種組織器官[23]，這是否可推斷出粘孢子蟲多宿主、多部位寄生與不同類型的放射孢子蟲有關？我們認為決定這種選擇多樣性是由于粘孢子蟲-魚之間的相互作用，且這種選擇是可以改變的，即存在感染部位的轉(zhuǎn)變(infection site-shift)，與同一粘孢子蟲存在宿主轉(zhuǎn)變(host-shift) 一樣，這可能是粘孢子蟲物種多樣性形成的基礎[26]。本研究發(fā)現(xiàn)存在于腎臟中的荊州碘泡蟲包囊，可以排除腎臟中的孢子不是寄生于肌肉中的荊州碘泡蟲“老化”后通過排泄系統(tǒng)離開(shedding)而出現(xiàn)的，而是進入宿主的感染性放射孢子蟲胚質(zhì)在經(jīng)歷不同的宿主免疫(環(huán)境)壓力后選擇了不同的發(fā)育與移行途徑。因此，我們建議在物種鑒定及命名過程中，需要有物種形成是進行時而非完成時的概念，尤其是對于進化速率較快的寄生微生物而言。

綜上所述，本研究不僅鑒定了荊州碘泡蟲的有效性，還補充了其形態(tài)學數(shù)據(jù)以及系統(tǒng)發(fā)育關系，同時也為后續(xù)粘孢子蟲分類學研究提供了幾點思考。

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(責任編輯：張瀟峮)

Redescription and phylogenetic analysis based on 18S rDNA ofMyxoboluskinchowensis(Myxozoa:Myxobolidae)

ZHAO Zi-ming1,LIU Xin-hua2,ZHAO Yuan-li2,YUAN Sheng1,ZHANG Jin-yong2

(1.JiangsuAnimalHusbandry&VeterinaryCollege,Taizhou，225300Jiangsu,China;2.StateKeyLaboratoryofFreshwaterEcologyandBiotechnology,InstituteofHydrobiology,ChineseAcademyofSciences,Wuhan430072,China)

MyxoboluskingchowensisMa & Chen,1963 was originally described from multi-organs of several cyprinid fishes with insufficient data which should be supplemented and validated by current taxonomic criteria.The morphological features of the concerned species are as follows:plasmodia dwelling in trunk muscle and renal capsule,with diameter of 126.7±1.8 μm and 94.2 μm in maximum,respectively;no significant differences among all taxonomic parameters of two isolates;mature spores were pyriform in frontal view and fusiform in sutural view,with tapering anterior end and round posterior end；spore surface smooth with thick straight sutural ridge；polar capsule,unequal,locating in the anterior part of spores;no significant intercapsular process,edge marking on the spore posterior end and mucus envelope surrounding the spore valves.Histopathological observations showed that no significant inflammatory responses occurred in both kidney and muscle,so it can be assumed that the infection of this species has no significant detrimental effects on host taking the low infection intensity into account.Phylogenetic analysis showed thatM.kingchowensisclustered with several muscle-infectingMyxobolusspecies and formed an independent clade among cyprinid-infecting species,and showing a tendency to cluster according to the geographical distribution of their fish hosts.In addition,the occurrence of two infection sites forM.kingchowensisindicated that there are two routes of migration and development after the invasion of the fish host by infective actinospores.However,muscle is the primary infection site and kidney the secondary site.We thought that this infection site-shift and host-shift are the possible mechanisms of the occurrence of high species diversity of fish myxosporean parasites.

Myxosporea;Myxoboluskingchowensis;18S rDNA;kidney;muscle.

2016-07-22；

2016-10-08資助項目：江蘇省水產(chǎn)三新工程項目(D2015-11)；國家自然科學基金(31472296)；江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院課題(NSFRC1304、00010115018)

趙子明(1962- )，男，副教授，主要從事魚類生物學與養(yǎng)殖技術研究。E-mail:zzm0282678@163.com 通訊作者：章晉勇。E-mail:zhangjy@ihb.ac.cn

S941.5

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1000-6907-(2017)02-0079-07