王健+齊夢蝶+郭娟+申業(yè)+林慧馨+黃璐琦

[摘要]從穿心蓮葉片中克隆了1個(gè)NAC家族的轉(zhuǎn)錄因子，命名為ApNAC1，GenBank注冊號為KY196416。生物信息學(xué)分析表明該基因的完整編碼區(qū)包含972 bp，編碼1個(gè)323個(gè)氨基酸的多肽，預(yù)測蛋白相對分子質(zhì)量為35.9 kDa，等電點(diǎn)為6.14。原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)研究證實(shí)了ApNAC1-GFP融合蛋白特異定位在穿心蓮葉肉細(xì)胞的細(xì)胞核中，是一個(gè)核定位蛋白。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明ApNAC1基因表達(dá)與穿心蓮內(nèi)酯的積累模式一致：主要在穿心蓮的葉片里表達(dá)，而且茉莉酸甲酯處理能急劇上調(diào)其表達(dá)水平。ApNAC1基因在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)，并且被成功純化。該研究為進(jìn)一步探索ApNAC1蛋白參與穿心蓮內(nèi)酯生物合成的研究奠定了基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 穿心蓮； NAC轉(zhuǎn)錄因子； 亞細(xì)胞定位； 表達(dá)模式； 原核表達(dá)

[Abstract] Andrographis paniculata is widely used as medicinal herb in China for a long time and andrographolide is its main medicinal constituent. To investigate the underlying andrographolide biosynthesis mechanisms， RNA-seq for A. paniculata leaves with MeJA treatment was performed. In A. paniculata transcriptomic data， the expression pattern of one member of NAC transcription factor family （ApNAC1） matched with andrographolide accumulation. The coding sequence of ApNAC1 was cloned by RT-PCR， and GenBank accession number was KY196416. The analysis of bioinformatics showed that the gene encodes a peptide of 323 amino acids， with a predicted relative molecular weight of 35.9 kDa and isoelectric point of 6.14. To confirm the subcellular localization， ApNAC1-GFP was transiently expressed in A. paniculata protoplast. The results indicated that ApNAC1 is a nucleus-localized protein. The analysis of real-time quantitative PCR revealed that ApNAC1 gene predominantly expresses in leaves. Compared with control sample， its expression abundance sharply increased with methyl jasmonate treatment. Based on its expression pattern， ApNAC1 gene might involve in andrographolide biosynthesis. ApNAC1 was heterologously expressed in Escherichia coli and recombinant protein was purified by Ni-NTA agarose. Further study will help us to understand the function of ApNAC1 in andrographolide biosynthesis.

[Key words] Andrographis paniculata； NAC transcription factor； subcellular localization； expression pattern； heterologous expression

穿心蓮為爵床科Acanthaceae植物穿心蓮Andrographis paniculata的干燥地上部分，味苦、性寒，具有清熱解毒、消腫止痛、抗菌及抗癌作用^[1-3]，臨床應(yīng)用于心血管系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、胃腸道系統(tǒng)疾病等^[4]。其抗炎抗感染的主要活性物質(zhì)是二萜內(nèi)酯類， 如穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯等^[5]。

研究表明包括茉莉酸甲酯（MeJA）在內(nèi)的多種誘導(dǎo)子可以刺激穿心蓮內(nèi)酯及其相關(guān)萜類化合物在穿心蓮體內(nèi)的積累^[6-7]。為了闡明穿心蓮體內(nèi)合成機(jī)制，作者對MeJA不同誘導(dǎo)時(shí)間的穿心蓮葉片進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序。在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，一個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員的表達(dá)模式與穿心蓮內(nèi)酯的積累模式較為吻合：在MeJA處理12 h后急劇上升，在隨后的24，48 h里都維持一個(gè)較高的表達(dá)水平。NAC轉(zhuǎn)錄因子超家族是植物中特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，包含了眾多成員。其N-端有一個(gè)高度保守的 NAC 結(jié)構(gòu)域，具有DNA結(jié)合或蛋白質(zhì)和二聚體結(jié)合功能；而其C-端無論是在氨基酸序列還是長度方面都具有高度的多樣性，具有轉(zhuǎn)錄激活、抑制或者與蛋白質(zhì)結(jié)合等功能^[8]。NAC家族的轉(zhuǎn)錄因子參與了植物的發(fā)育、衰老、次生壁形成以及對外界生物和非生物脅迫的各種應(yīng)答反應(yīng)^[9]。然而，NAC轉(zhuǎn)錄因子參與植物次生代謝卻鮮見報(bào)道。為了探索新的調(diào)控萜類代謝的轉(zhuǎn)錄因子并增加對NAC轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控功能的理解，本研究首次克隆得到了穿心蓮NAC家族中的1個(gè)成員，命名為ApNAC1。

本研究首先對ApNAC1基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并對其亞細(xì)胞定位、表達(dá)模式進(jìn)行研究。最后ApNAC1在大腸桿菌進(jìn)行異源表達(dá)，并被成功純化。以上工作為后續(xù)進(jìn)一步研究ApNAC1的體內(nèi)功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料

穿心蓮采自福建漳州，中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心郝近大研究員鑒定為穿心蓮A. paniculata。所有的大腸桿菌菌株均購自全式金生物科技公司。SYBR Green PCR Master Mix購自大連寶生物技術(shù)有限公司，KOD聚合酶購自日本TOYOBO公司，RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司，瓊脂糖膠回收試劑盒購自Thermo Fisher公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司，pEASY-Blunt Zero Cloning Kit，pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit，DNA marker購自全式金生物科技公司，其他試劑為國產(chǎn)分析純。引物合成和測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

2 方法

2.1 穿心蓮葉片RNA 提取

取100 mg穿心蓮葉片，液氮速凍后研磨成粉，加入plant RNA Reagent提取總RNA，利用NanoDrop 2000分光光度計(jì)測定RNA濃度。以總RNA為模板，以oligo（dT）為引物，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

2.2 穿心蓮ApNAC1編碼序列的克隆和測序

根據(jù)穿心蓮轉(zhuǎn)錄組注釋結(jié)果，ApNAC1的序列為全長cDNA。為了擴(kuò)增該基因完整的編碼序列（coding sequence，CDS），設(shè)計(jì)上游引物ApNAC-F1，5′-ATGGGTGTCCGAGAAACCG-3′，下游引物ApNAC-R1，5′-TCACAGCATGAACCCGGAC-3′，以葉片RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。將回收的特異性片段克隆到pEASY-Blunt Zero載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 Trans1 T1中，菌落PCR鑒定陽性克隆，并提取質(zhì)粒進(jìn)行測序分析。

2.3 穿心蓮ApNAC1基因序列的生物信息學(xué)分析

將測序所得的CDS序列翻譯成氨基酸序列，在National Center for Biotechnology Services （NCBI） 數(shù)據(jù)庫中應(yīng)用BLAST程序 （https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov） 進(jìn)行同源性檢索，并應(yīng)用MEGA 7.0，使用NJ 法（bootstrap 1000） 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2.4 穿心蓮ApNAC1 蛋白的亞細(xì)胞定位分析

2.4.1 構(gòu)建ApNAC1亞細(xì)胞定位載體 利用引物ApNAC-F2，5′-CTTCTGCGGGGCCCGGGGATGGGTG- TCCGAGAAACCG-3′和ApNAC-R2：5′-TCCACTAGTATTTAAATGCAGCATATGAACCCGGACCCA-3′，以已測序正確的pEASY-Blunt-Zero-ApNAC1質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增，利用pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit將ApNAC1克隆入雙元載體pCAMBIA1300-GFP，并測序驗(yàn)證，命名為p1300-ApNAC1-GFP。

2.4.2 定位分析 取用生長4周的穿心蓮的幼嫩葉片，根據(jù)文獻(xiàn)的方法^[10]游離葉片原生質(zhì)體，并將p1300-ApNAC1-GFP和不含插入片段的pCAMBIA1300-GFP質(zhì)粒作為對照，分別轉(zhuǎn)化入穿心蓮原生質(zhì)體。室溫孵育24 h，用激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。

2.5 穿心蓮ApNAC1基因的表達(dá)譜分析

采用SYBR Green Premix染料進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR（real-time qPCR）分析，分別用上游引物ApNAC-F3，5′-GGGAATTTCGATTGGCCTAC-3′，和下游引物 ApNAC-R3，5′-TCAGGCTGAATCGGGTACCG-3′，檢測ApNAC1在MeJA處理穿心蓮水培苗0，12，24，48 h時(shí)的基因表達(dá)變化。PCR體系為SYBR Premix 5 μL，正反引物各0.2 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.2 μL，稀釋10倍的cDNA模板1.0 μL，加ddH₂O至10 μL。PCR程序?yàn)?5 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)立3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2.6 穿心蓮ApNAC1原核表達(dá)載體的構(gòu)建

構(gòu)建原核表達(dá)載體上pET-32a（+）-ApNAC1，首先使用限制性內(nèi)切酶BamH I和Sal I對載體pET-32a（+）進(jìn)行雙酶切線性化。利用引物ApNAC-F4，5′-AGGCCATGGCTGATATCGGAATGGGTG- TCCGAGAAACCG-3′和ApNAC-R4，5′-GTCGACGGAGCTCGAATTCGTCACAGCATGAACCCGGAC-3′，以測序正確的pEASY-Blunt-Zero-ApNAC1質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增。利用pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit同源重組試劑盒進(jìn)行克隆，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Trans1 T1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，并利用含有氨芐青霉素的LB平板進(jìn)行篩選，挑選陽性克隆進(jìn)行PCR鑒定，并送測序。將測序正確的重組質(zhì)粒pET-32a-ApNAC1轉(zhuǎn)化入Transetta（DE3）原核表達(dá)菌株感受態(tài)細(xì)胞中。

2.7 穿心蓮ApNAC1蛋白的原核表達(dá)及分離純化

挑取陽性重組菌的單菌落，接種于2 mL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃活化過夜后，按照1∶50接種200 mL，250 r·min^-1振搖至生長對數(shù)期（A₆₀₀約為1.0），加入終濃度為1 mmol·L^-1的IPTG于16 ℃誘導(dǎo)表達(dá)16 h（留取未加IPTG菌液于相同條件下培養(yǎng)）。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，取200 μL菌液，8 000 r·min^-1離心5 min，收集菌體，用去離子水洗滌2次，加入50 μL PBS緩沖液重懸菌體，加入50 μL 2×SDS上樣緩沖液煮沸10 min，至于4 ℃?zhèn)溆谩⑹Ｓ嗑河? ℃，8 000 r·min^-1離心5 min收集菌體，加入5 mL Buffer A （20 mmol·L^-1 NaH₂PO₄，500 mmol·L^-1 NaCl，20 mmol·L^-1 Imidazole）重懸菌體，超聲破碎7 min，4 ℃，12 000 r·min^-1離心10 min，去除沉淀，加入Ni-NTA agarose 200 μL 于4 ℃搖晃45 min，充分結(jié)合后，4 ℃，1 400 r·min^-1離心10 min，并使用Buffer A 清洗2次后，使用250 μL Buffer B（20 mmol·L^-1 NaH₂PO₄，500 mmol·L^-1 NaCl，500 mmol·L^-1 Imidazole）洗脫蛋白2次。取2 μL洗脫液加入198 μL PBS稀釋，加入200 μL 2×SDS上樣緩沖液煮沸10 min。4 ℃，12 000 r·min^-1離心10 min后取10 μL上樣，用100 g·L^-1的聚丙酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 穿心蓮ApNAC1基因的克隆及序列分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，設(shè)計(jì)特異引物，以穿心蓮葉片的cDNA做為模板，擴(kuò)增該基因從起始密碼子到終止密碼子的完整編碼區(qū)，得到1條大約1 000 堿基對的特異條帶。切膠回收該片段，連接pEASY-Blunt Zero載體，鑒定出陽性克隆后，送往公司測序。測序結(jié)果表明載體中插入了目的片段（圖1）。序列分析表明該片段包含972個(gè)堿基對，編碼1個(gè)包含323個(gè)氨基酸的多肽，相對分子質(zhì)量為35.9 kDa，預(yù)測等電點(diǎn)為6.14。利用NCBI網(wǎng)站的Smart Blast軟件進(jìn)行同源比對，發(fā)現(xiàn)該蛋白與模式植物擬南芥NAC家族RD26和大豆NAC4的同源性分別為70%和59%，而在所有物種中與之同源性最高的是芝麻中的NAC蛋白，同源性高達(dá)72%。該多肽的N端包含了高度保守的NAM結(jié)構(gòu)域。因此，該基因被命名為ApNAC1， GenBank注冊號為KY196416。將ApNAC1與Genbank中17個(gè)物種的23種蛋白的氨基酸序列對比，利用MEGA 7.0，使用NJ（boot-strap 1000）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。ApNAC1與巴旦木Prunus persica NAC5 （PpNAC5， ALK27824.1），蘋果Malus domestica NAC （MdNAC， XP_008345087.1），煙草Nicotiana tomentosiformis NAC （NtNAC， XP_009594219.1），葡萄Vitis vinifera NAC （VvNAC， XP_002284668.1），蓖麻Ricinus communis NAC （RcNAC， XP_002533913.1），芝麻Sesamum indicum NAC （SiNAC， XP_011098342.1），擬南芥Arabidopsis thaliana NAC1-1 （AtNAC1-1， NP_001078452.1）構(gòu)成一支，親緣關(guān)系較近。然而，同一植物內(nèi)不同的NAC成員則具有較大差異。如擬南芥中的NAC1-1，NAC1-2，NAC1-3都分布在不同的分支里，說明盡管NAC家族成員都具有類似的保守結(jié)構(gòu)域，但不同亞家族成員間序列變異顯著（圖2）。

3.2 穿心蓮ApNAC1蛋白的亞細(xì)胞定位

由于預(yù)測ApNAC1蛋白是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，而轉(zhuǎn)錄因子通常為核定位蛋白。為了驗(yàn)證ApNAC1的亞細(xì)胞定位，通過同源重組技術(shù)ApNAC1基因被克隆到了綠色熒光蛋白（GFP）的N末端。通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，ApNAC1基因被瞬時(shí)表達(dá)在葉肉細(xì)胞中。培養(yǎng)24 h后，在熒光顯微鏡下觀察ApNAC1蛋白的亞細(xì)胞定位，以未融合其他基因的空載體作為對照。空載體對照中，GFP的熒光廣泛地分布于細(xì)胞的各個(gè)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。而融合了ApNAC1的GFP蛋白集中地分布在細(xì)胞核中，細(xì)胞的其他部位觀察不到GFP熒光。該結(jié)果驗(yàn)證了生物信息學(xué)的預(yù)測結(jié)果，證實(shí)了ApNAC1定位于細(xì)胞核中，是一個(gè)核蛋白（圖3）。

3.3 穿心蓮ApNAC1基因的表達(dá)模式

穿心蓮中最重要的藥效成分穿心蓮內(nèi)酯主要分布在穿心蓮的葉片中，而且它的含量受到茉莉酸甲酯（MeJA）的誘導(dǎo)^{[6， 11]}。為了探討ApNAC1參與穿心蓮內(nèi)酯積累的可能性，對該基因的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。首先，檢測了該基因的組織特異性表達(dá)。實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果表明ApNAC1主要分布葉片中，而在根和莖中的分布遠(yuǎn)低于葉片中的分布。在MeJA處理后，該基因表達(dá)水平急劇增加，在12 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高。在24，48 h時(shí)盡管表達(dá)水平略有下降，但依然遠(yuǎn)高于未處理對照組（圖4）。該qPCR的結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果吻合。因此，不論是從組織特異性還是MeJA處理后的mRNA積累，ApNAC1基因都呈現(xiàn)出與穿心蓮內(nèi)酯一致的表達(dá)模式。這個(gè)結(jié)果表明ApNAC1有可能參與穿心蓮內(nèi)酯生物合成途徑的調(diào)節(jié)。

3.4 穿心蓮ApNAC1基因原核蛋白的表達(dá)

電泳遷移率變動分析（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）是研究轉(zhuǎn)錄因子功能的重要手段。獲取有活性的轉(zhuǎn)錄因子蛋白是進(jìn)行該研究的前提條件。為了獲得可溶ApNAC1蛋白，重組質(zhì)粒pET32a-ApNAC1被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株Transetta （DE3）中，在IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，進(jìn)行 SDS-PAGE 凝膠電泳分析（圖5）。第1泳道為未加入IPTG誘導(dǎo)的陰性對照，第2泳道為誘導(dǎo)后的菌體蛋白。比較這2道菌體蛋白，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后比誘導(dǎo)前的蛋白在55 kDa附近之間明顯增加了1個(gè)蛋白條帶。ApNAC1蛋白預(yù)期相對分子質(zhì)量為35.9 kDa，而原核表達(dá)載體pET-32a的表達(dá)標(biāo)簽約為20 kDa，所以該重組蛋白大小約為56 kDa。因此表達(dá)出來的蛋白大小符合預(yù)期。采用親和色譜法，用 Ni-NTA Agarose對ApNAC1進(jìn)行純化。第3泳道為純化后的蛋白，結(jié)果顯示已經(jīng)獲得了純度較高的重組蛋白。

4 討論

逆境（包括生物和非生物脅迫環(huán)境）是導(dǎo)致植物體內(nèi)次生代謝物增加的重要原因^[12]。在各種逆境下，植物能夠產(chǎn)生茉莉酸及其衍生物，誘導(dǎo)編碼次生代謝物合成酶及轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)，以適應(yīng)脅迫環(huán)境^[13]。穿心蓮生物合成途徑的研究表明，在MeJA處理24 h后，穿心蓮內(nèi)酯含量增加了5.25倍^[7]。目前已知AP2/ERF，bHLH，MYB 以及 WRKY等多種轉(zhuǎn)錄因子都參與了茉莉酸相關(guān)的次生代謝物積累途徑的調(diào)控^[14]。但植物中特有的轉(zhuǎn)錄因子家族——NAC家族成員直接參與次生代謝的報(bào)道卻甚為少見。最近研究顯示AaNAC2，AaNAC3，AaNAC4蛋白能夠與AaTPS1基因啟動子結(jié)合，參與調(diào)控獼猴桃果實(shí)成熟過程中單萜的合成。該結(jié)果首次表明NAC轉(zhuǎn)錄因子直接參與萜類代謝^[15]。在前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中，盡管多種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)都隨著MeJA處理時(shí)間的延長而增加，但是ApNAC1的表達(dá)增加得最為明顯：在MeJA處理12 h時(shí)，ApNAC1的表達(dá)量增加了100倍以上。本研究的qPCR數(shù)據(jù)驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果，并進(jìn)一步證明了該基因的葉片組織特異性分布。穿心蓮內(nèi)酯和ApNAC1的積累模式的一致性暗示了ApNAC1可能參與了穿心蓮內(nèi)酯合成的調(diào)控。但要確定ApNAC1基因在穿心蓮體內(nèi)的功能還需要通過RNAi或過表達(dá)等手段，觀察相應(yīng)的表型，最后才能闡明其確切的生物學(xué)功能。

用基因槍瞬時(shí)轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞是研究蛋白亞細(xì)胞定位的常用方法，但是它也存在需要特定設(shè)備、價(jià)格昂貴、操作較為繁瑣等缺點(diǎn)。本研究借鑒擬南芥的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)，用穿心蓮葉肉細(xì)胞的原生質(zhì)體進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)研究，不僅比基因槍法方便快捷，而且能夠更加真實(shí)地反映ApNAC1蛋白的亞細(xì)胞定位。穿心蓮葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化技術(shù)不僅能用于研究穿心蓮蛋白的亞細(xì)胞定位，還可以通過共轉(zhuǎn)化報(bào)告基因的方法用于鑒定轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能。由于穿心蓮尚未建立穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，所以這項(xiàng)技術(shù)對鑒定轉(zhuǎn)錄因子的功能顯得尤為重要。

電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（electrophoretic mobility shift assay， EMSA）是檢測轉(zhuǎn)錄因子與體內(nèi)特定基因啟動子結(jié)合的重要手段。獲得可溶的轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)是進(jìn)行EMSA實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟。本文通過原核表達(dá)獲得了高純度的重組蛋白。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中我們將利用純化的ApNAC1蛋白，通過EMSA實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證其能否與穿心蓮內(nèi)酯相關(guān)合成酶的啟動子的特定區(qū)段結(jié)合，闡明其是否直接參與穿心蓮內(nèi)酯生物合成的調(diào)控。本研究為進(jìn)一步探索ApNAC1在穿心蓮內(nèi)酯生物合成中的功能奠定了基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 何恩其，趙烽. 穿心蓮的藥理作用及研究進(jìn)展[J]. 中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)， 2007（5）： 107.

[2] Mishra S K， Tripathi S， Shukla A， et al. Andrographolide and analogues in cancer prevention[J]. Front Biosci （Elite Ed）， 2015，7： 255.

[3] Mir H， Kapur N， Singh R， et al. Andrographolide inhibits prostate cancer by targeting cell cycle regulators， CXCR3 and CXCR7 chemokine receptors[J]. Cell Cycle， 2016，15（6）： 819.

[4] 朱艷玲.穿心蓮化學(xué)成分和藥理作用的研究進(jìn)展[J]. 中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用， 2013（14）：238.

[5] Hossain M S， Urbi Z. Andrographis paniculata （Burm. f.） Wall. ex Nees： a review of ethnobotany，

phytochemistry， and pharmacology[J]. Scientific World J， 2014，2014： 28.

[6] Sharma S N， Jha Z， Sinha R K， et al. Jasmonate-induced biosynthesis of andrographolide in Andrographis paniculata[J]. Physiol Plant， 2015，153（2）： 221.

[7] Gandi S， Rao K， Chodisetti B， et al. Elicitation of andrographolide in the suspension cultures of Andrographis paniculata[J]. Appl Biochem Biotechnol， 2012，168（7）： 1729.

[8] Olsen A N， Ernst H A， Leggio L L， et al. NAC transcription factors： structurally distinct， functionally diverse[J]. Trends Plant Sci， 2005，10（2）： 79.

[9] Puranik S， Sahu P P， Srivastava P S， et al. NAC proteins： regulation and role in stress tolerance[J]. Trends Plant Sci， 2012，17（6）： 369.

[10] Yoo S D， Cho Y H， and Sheen J. Arabidopsis mesophyll protoplasts： a versatile cell system for transient gene expression analysis[J]. Nat Protoc， 2007，2（7）： 1565.

[11] Garg A， Agrawal L， Misra R C， et al. Andrographis paniculata transcriptome provides molecular insights into tissue-specific accumulation of medicinal diterpenes[J]. BMC Genomics， 2015，16： 659.

[12] 黃璐琦，郭蘭萍. 環(huán)境脅迫下次生代謝產(chǎn)物的積累及道地藥材的形成[J].中國中藥雜志， 2007， 32（4）：277.

[13] De Geyter N， Gholami A， Goormachtig S， et al. Transcriptional machineries in jasmonate-elicited plant secondary metabolism[J]. Trends Plant Sci， 2012，17（6）： 349.

[14] Zhou M， Memelink J. Jasmonate-responsive transcription factors regulating plant secondary metabolism[J]. Biotechnol Adv， 2016，34（4）：441.

[15] Nieuwenhuizen N J， Chen X， Wang M， et al. Natural variation in monoterpene synthesis in kiwifruit： transcriptional regulation of terpene synthases by NAC and ethylene-insensitive3-like transcription factors[J]. Plant Physiol， 2015，167（4）：1243.

[責(zé)任編輯 呂冬梅]