韓春++王可敬++張谷+徐加杰++鄭偉慧

[摘要] 目的 探討cN0甲狀腺乳頭狀癌中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)的微轉(zhuǎn)移情況，探討逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-qPCR）技術(shù)對診斷淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移灶的價值，并篩選微轉(zhuǎn)移的臨床病理高危因素。 方法 選取2012年11月～2014年3月浙江省腫瘤醫(yī)院收治的cN0甲狀腺乳頭狀癌患者48例，對從中取到136個病理證實無轉(zhuǎn)移的中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)分別用免疫組化和RT-qPCR檢測CK19的表達情況。將患者的各項臨床病理相關(guān)因素作為自變量，以淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移因素作為因變量，應用二分類變量Logistic回歸模型進行多因素分析，以期發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移可能的高危因素。 結(jié)果 免疫組化檢測CK19為15.44%（21/136），RT-qPCR法的陽性檢出率為82.35%（112/136）。RT-qPCR 法與免疫組化法比較具有顯著差異。Logistic回歸模型中篩選出腫瘤甲狀腺包膜侵犯是cN0甲狀腺乳頭狀癌中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的危險因素。 結(jié)論 應用RT-qPCR檢測CK19表達，可提高對甲狀腺癌的淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移陽性檢出率。腫瘤甲狀腺包膜侵犯是淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的獨立危險因素。

[關(guān)鍵詞] 甲狀腺腫瘤；甲狀腺乳頭狀癌；細胞角蛋白19；微轉(zhuǎn)移；聚合酶鏈反應

[中圖分類號] R736.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）02-0001-04

Preliminary study of lymph node micrometastasis in the central compartment of cN0 papillary thyroid carcinoma

HAN Chun1 WANG Kejing1 ZHANG Gu2 XU Jiajie1 ZHENG Weihui1

1.Department of Head and Neck Surgery， Zhejiang Cancer Hospital， Hangzhou 310022， China； 2.Department of Pathology， Zhejiang Cancer Hospital， Hangzhou 310022， China

[Abstract] Objective To investigate the micrometastasis of lymph node in the central compartment of cN0 papillary thyroid carcinoma， to explore the value of reverse transcription polymerase chain reaction（RT-qPCR） in the diagnosis of lymph node micrometastasis， and to screen the clinical pathological risk factors of micrometastasis. Methods A total of 48 patients with cN0 thyroid papillary carcinoma who were admitted to Zhejiang Cancer Hospital from November 2012 to March 2014 were enrolled in this study. The expression of CK19 was detected by immunohistochemistry and RT-qPCR in 136 lymph nodes in the central zone collected from them， which was pathologically confirmed without metastasis. The clinicopathological factors of patients were taken as independent variables， and lymph node micrometastasis factors were taken as the dependent variables. Multivariate analysis was applied by binary variables Logistic regression model， so as to explore the possible risk factors of micrometastasis. Results CK19 was detected by immunohistochemistry in 15.44%（21/136）. The positive rate of CK19 was 82.35%（112/136） by RT-qPCR. RT-qPCR method and immunohistochemical method were compared， and the differences were significant. Logistic regression analysis showed that tumor thyroid capsule invasion was the risk factor of central zone lymph node micrometastasis in cN0 papillary thyroid carcinoma. Conclusion The test of CK19 expression by RT-qPCR can increase the positive detection rate of lymph node micrometastasis in thyroid carcinoma. Tumor thyroid capsule invasion is an independent risk factor for lymph node micrometastasis.

[Key words] Thyroid tumor； Papillary thyroid carcinoma； Cytokeratin 19； Micrometastases； Polymerase chain reaction（PCR）

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤之一，約占全身惡性腫瘤的1%[1，2]，其中又以甲狀腺乳頭狀癌所占比例最高，且近年來發(fā)病率呈增高的趨勢。手術(shù)治療是目前臨床治療甲狀腺癌的主要方法，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移經(jīng)常是手術(shù)治療面臨的重要問題[3-5]。多數(shù)臨床認為對無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者進行擴大淋巴結(jié)清掃無臨床意義，且會增加患者損傷，提高術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生率[6，7]。因此，如何更好地判斷淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移風險，以指導淋巴結(jié)清掃選擇和預后判斷十分重要。

細胞角蛋白19（Cytokeratin 19，CK19）是近年來發(fā)現(xiàn)的與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的一種腫瘤抗原，其強陽性表達預示著腫瘤的浸潤潛能，與甲狀腺癌的發(fā)生具有明顯的相關(guān)性[8]。近年來，免疫組化方法檢測蛋白標志物已經(jīng)廣泛用于乳頭狀甲狀腺癌的診斷，其靈敏度還存在一定缺陷[9，10]。本研究通過免疫組化及RT-qPCR聯(lián)合檢測CK19的表達用于提高對甲狀腺癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的檢測靈敏度和準確度，并結(jié)合患者臨床病理因素，探討影響淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的危險因素。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究對象為我院腫瘤頭頸外科于2012年11月～2014年3月收治的初治臨床淋巴結(jié)陰性（clinical negative lymph node，cN0）甲狀腺乳頭狀癌患者48例，其中男9例，女39例，中位年齡41（22，70）歲，>45歲36例，≤45歲12例；單發(fā)病灶35例（72.9%），多發(fā)病灶13例（27.1%）；雙側(cè)甲狀腺癌5例（10.4%），單側(cè)甲狀腺癌43例（89.6%）；伴有包膜侵犯23例（47.9%）；5例伴有腺內(nèi)播散及砂礫體（10.4%）。術(shù)后病理根據(jù)美國癌癥聯(lián)合會（AJCC）2010年第7版癌癥分期標準[11]：T1aN0M0 Ⅰ期19例；T1aN1aM0 Ⅰ期9例；T1aN1aM0 Ⅲ期5例；T1bN0M0 Ⅰ期6例；T1bN1aM0 Ⅲ期2例；T2N0M0 Ⅰ期1例；T2N1aM0期2例；T3N0M0 Ⅲ期1例；T3N1aM0 Ⅰ期2例；T3N1aM0 Ⅲ期1例。48例術(shù)前均接受了頸部超聲、胸部CT和甲狀腺功能檢查。均經(jīng)術(shù)中冰凍病理確診為甲狀腺乳頭狀癌。手術(shù)分別行單側(cè)甲狀腺及峽部切除或雙側(cè)甲狀腺全切除術(shù)并施行患側(cè)中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃術(shù)。

1.2 實驗方法

手術(shù)均由同一醫(yī)療組完成。術(shù)中將48例患者行中央?yún)^(qū)清掃的淋巴結(jié)標本，每1枚均剔除周圍脂肪纖維組織，沿最長軸于中間最大切面對半切開，標號后取其中的1/2標本獲取連續(xù)切片兩張，淋巴結(jié)中性福爾馬林固定，石蠟包埋。間隔500 μm 連續(xù)分切淋巴結(jié)，切片厚度為4 μm，分別行HE染色常規(guī)病理檢查和免疫組化CK19檢測，另一半淋巴結(jié)放置于液氮罐中冷凍，并儲存于-80℃ 的低溫冰箱中用于提取mRNA熒光定量RT-PCR檢測CK19的表達。根據(jù)術(shù)后常規(guī)病理診斷結(jié)果，排除HE切片證實病理轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)，選取HE切片病理未見癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)進一步行免疫組化及RT-qPCR檢測。

1.2.1 免疫組化檢測 全部標本經(jīng)10%中性甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋，將淋巴結(jié)標本4 μm厚度連續(xù)切片、染色。切片均經(jīng)微波抗原修復，采用免疫組化S-P 法檢測，具體操作步驟均按照試劑盒說明書進行。CK19單克隆抗體分別購自丹麥 DAKO 公司和美國 Cell Marque 公司。采用 ZEISS ImagerZ1顯微鏡及VENTANA Image Viewer 3.1.3 圖像軟件。結(jié)果判定：CK19細胞染色均以細胞漿出現(xiàn)的棕黃色顆粒為陽性標準。所有染色標本均進行數(shù)值測量及染色強度判定，每張切片在高倍鏡下（40倍）選取 5 個視野，按照陽性細胞所占百分數(shù)并參考著色強度確定，行半定量積分法，統(tǒng)一判定結(jié)果[12]。按陽性細胞百分比記 0～4分，陽性細胞百分比<5%為0分，6%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～75%為3分，>75%為4分。陽性強度評分標準：不顯色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為 2 分，棕褐色為 3分。兩項指標的評分相加：0～1 分為陰性結(jié)果（-），2～3 分為弱陽性（+），4～5分為中度陽性（++），>5 分為強陽性（+++）。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）檢測 采用實時熒光定量PCR檢測 CK19 mRNA 的表達。淋巴結(jié) RNA 提取和 cDNA 的合成以及 PCR 反應試劑均由廣州達暉生物技術(shù)有限公司提供，嚴格按照試劑說明書進行。逆轉(zhuǎn)錄反應條件為 42℃1 h，70℃，15 min（儀器型號：ABI 2720 Thermal Cycle）。RT-qPCR法檢測 CK19，其中PCR反應體系為 50 μL，擴增反應條件為：預變性95℃ 5 min，然后95℃ 15 s，60℃ 40 s，共45個循環(huán)。同時設置內(nèi)參對照和空白對照（儀器型號：ABI Step One Plus TM Real-Time PCR Instrument）。CK19正向引物：5AGGAGATTGCCACCTACCG3，反向引物：5CC TTCCC ATCCCT CTACCC 3；內(nèi)參基因GAPDH正向引物：5CTCTC TGCT CCTCCT GTTCGAC 3，反向引物：5GCCCAATACGACCAAATCCG 3。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)為分類資料，CK19 mRNA拷貝數(shù)的比較采用χ2檢驗。分析甲狀腺癌患者 RT-qPCR 法檢測CK19的陽性率，對比免疫組化與RT-qPCR法檢測方法是否存在差異。多因素分析采用二分類Logistic回歸模型分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果

48例 cN0 甲狀腺癌患者中，術(shù)中共取到 212 枚中央?yún)^(qū)清掃淋巴結(jié)標本，平均4.4枚。經(jīng)病理證實轉(zhuǎn)移 76 枚，病理證實無轉(zhuǎn)移 136 枚。病理證實無轉(zhuǎn)移的136 枚淋巴結(jié)行進一步檢測。根據(jù)上述免疫組化判定結(jié)果，CK19陽性的數(shù)目分別為 21例，余27例為無轉(zhuǎn)移患者。見封三圖1。

2.2 RT-qPCR檢測結(jié)果

采用Primer 5.0軟件設計檢測GAPDH、CK19引物，并進行2對引物擴增特異性分析。2對引物具有較好的擴增特異性，能保證樣品中目的基因準確檢測，見封三圖2～3。48例甲狀腺癌患者的136枚病理證實無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中，免疫組化CK19陽性數(shù)目為21枚。通過RT-qPCR檢測CK19，陽性數(shù)目為112枚。CK19基因RT-qPCR檢測法較免疫組化具有更高的陽性檢出率，兩種方法比較，差異有統(tǒng)計學意義[15.44（21/136） vs 82.35%（112/136），P<0.05]。見表1。

表1 CK19在免疫組化和 RT-qPCR兩種方法中的表達比較

2.3 淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的臨床病理特征及影響因素

將患者的各項臨床病理相關(guān)因素作為自變量，以淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移因素作為因變量，篩選淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的危險因素。采用分類變量Logistic回歸分析：將性別、年齡、病理T分期、病灶個數(shù)、包膜侵犯、單雙側(cè)、腺內(nèi)播散等因素引入分析，結(jié)果提示：包膜侵犯是淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的主要危險因素，其余變量比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表2。Logistic回歸分析結(jié)果見表3。

3 討論

甲狀腺癌多數(shù)屬于低度惡性、進展相對緩慢，未發(fā)生轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌患者術(shù)后10年生存率超過80%[13]。據(jù)統(tǒng)計超過90%的甲狀腺乳頭狀癌可檢測到淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移。微轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤發(fā)展過程中播散于淋巴系統(tǒng)、血循環(huán)及骨髓等器官中的微小腫瘤細胞灶，是腫瘤局部復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移的根源，是影響患者預后的因素，鑒別是否發(fā)生淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移對于臨床處理具有較大的指導意義。對于有淋巴結(jié)累及的患者應行淋巴結(jié)清掃（包括中央?yún)^(qū)和/或側(cè)頸部），但對于術(shù)前超聲檢測及術(shù)中探查未發(fā)現(xiàn)明顯可疑淋巴結(jié)的患者是否應行常規(guī)清掃仍有爭議。目前為止，還沒有非常可靠的技術(shù)和檢測指標能用于準確評估甲狀腺癌的轉(zhuǎn)移。

CK19是一種低分子量角蛋白，主要在上皮細胞中表達，但不會在間質(zhì)組織中表達，是一個上皮組織來源腫瘤特異的微轉(zhuǎn)移標志物[14]。在甲狀腺癌中可以強烈而彌漫的表達，而在正常甲狀腺組織、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫中不表達或灶狀表達，可用于預測甲狀腺癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移。已有不少研究顯示：CK19的表達能反映甲狀腺乳頭狀癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的狀態(tài)[15-17]。

運用RT-qPCR技術(shù)對比目前普遍采用的HE染色技術(shù)對淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的檢測分析比較，RT-qPCR 技術(shù)是較為靈敏的方法，可以檢測淋巴結(jié)的微小轉(zhuǎn)移。本研究用免疫組化和RT-qPCR方法對136枚甲狀腺癌淋巴結(jié)組織的CK19進行檢測，其中RT-qPCR法陽性檢出率更高，兩種檢測方法比較差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。在本研究中可見RT-qPCR 技術(shù)比免疫組化更敏感。因此，在影像學檢查及觸診未及頸淋巴結(jié)的cN0患者中，可對清掃術(shù)后病理陰性淋巴結(jié)標本進一步應用RT-qPCR技術(shù)檢測淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的狀況。對于RT-qPCR檢測結(jié)果陽性的患者可考慮選擇較為積極的治療策略如頸淋巴結(jié)清掃術(shù)，或嚴密隨訪必要時手術(shù)。反之則可選擇暫不行淋巴結(jié)清掃，定期復查。

檢測甲狀腺乳頭狀癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移可作為病理狀態(tài)的有效補充，但本研究結(jié)果顯示，cN0甲狀腺乳頭狀癌淋巴結(jié)的微轉(zhuǎn)移與甲狀腺癌患者大部分的臨床病理高危因素無顯著統(tǒng)計學差異。張磊等[18]在cN0甲狀腺乳頭狀癌常規(guī)病理淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的多因素分析中顯示非微小癌、男性、年齡<40歲是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的高危因素。一些研究[19-23]也認為男性，年齡<45歲、腫瘤有腺外侵犯、多病灶者，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率明顯增加。但本研究中在腫瘤的大小、性別、年齡這三個因素中，均未顯示是淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的危險因素。一方面與本研究的樣本量小有關(guān)，另一方面也提示，淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的高危因素的篩選較常規(guī)病理的轉(zhuǎn)移更為困難，說明微轉(zhuǎn)移發(fā)生在較早的腫瘤進展過程中，預測該相關(guān)因素與臨床病理特征，需要進一步深入研究。

本研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺包膜侵犯這一因素是淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的獨立危險因素。優(yōu)勢比OR=4.000意味著伴有包膜侵犯的患者，發(fā)生淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的危險是無包膜侵犯的4倍。因此伴有包膜侵犯的患者需要更多的關(guān)注淋巴結(jié)的處理方法，包括中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)的積極清掃，右側(cè)甲狀腺癌的患者，還有必要行右側(cè)喉返神經(jīng)深面淋巴結(jié)的清掃等。

總之，本研究一方面認為RT-qPCR法檢測甲狀腺癌微轉(zhuǎn)移具有相對優(yōu)勢。另一方面，淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的預測模型的優(yōu)化建立需要擴大樣本量，并關(guān)注包膜侵犯這一因素，具有一定的臨床指導意義。

[參考文獻]

[1] Mai KT，Truong L D，Ball C G，et al. Lymphatic endothelial cancerization in papillary thyroid carcinoma：Hidden evidence of lymphatic invasion[J]. Pathology International，2015，65（5）：220-230.

[2] Erdem H，Gündogdu C，Sipal S. Correlation of E-cadherin，VEGF，COX-2 expression to prognostic parameters in papillary thyroid carcinoma[J]. Exp Mol Pathol，2011， 90（3）：312-317.

[3] Xing M. Molecular pathogenesis and mechanisms of thyroid cancer[J]. Nat Rev Cancer，2013，13（3）：184-199.

[4] 沈樑，黃穎烽，梁柳森，等. 甲狀腺癌前哨淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移分子檢測及其臨床意義[J]. 臨床醫(yī)學，2008，28（11）：98-99.

[5] 王建軍. RT-PCR法檢測前哨淋巴結(jié)ck19在甲狀腺癌治療中的應用研究[J]. 牡丹江醫(yī)學院學報，2012，33（6）：29-30.

[6] Keshtgar M，Aresti N，Macneil F，et al. Establishing axillary Sentinel Lymph Node Biopsy（SLNB） for early breast cancer in the United Kingdom：a survey of the national training program[J]. European Journal of Surgical Oncology，2010，36（4）：393-398.

[7] Sadeghi R，Alesheikh G，Zakavi SR，et al. Added value of blue dye injection in sentinel node biopsy of breast cancer patients：Do all patients need blue dye？[J]. International Journal of Surgery，2014，12（4）：325-328.

[8] Liu Z，Yu P，Xiong Y，et al. Significance of CK19，TPO，and HBME-1 expression for diagnosis of papillary thyroid carcinoma[J]. Int J ClinExp Med，2015，8（3）：4369-4374.

[9] Paunovic I，Isic T，Havelka M，et al. Combined immunohistochemistry for thyroid peroxidase，galectin-3，CK19 and HBME-1 in differential diagnosis of thyroid tumors[J]. APMIS，2012，120（5）： 368-379.

[10] Gabryel B，Brominski G，Owecki M，et al. The prevalence of thyroid nodular disease in patients with increased titers of anti-thyroidal peroxidase antibodies[J]. Neuro Endocrinol Lett，2012，33（4）：442-445.

[11] 〔美〕萊斯利.索賓，〔加〕瑪麗.高斯伯德羅維茲，〔德〕克里斯坦.維特金德，主編. 周清華，孫燕，主譯. 惡性腫瘤TNM分期（第7版）[M]. 天津：天津科技翻譯出版公司，2012：57-62.

[12] 田君才，杜國亮，張桂霞. 人工免疫組化判定結(jié)果與灰度值相關(guān)性[J]. 臨床與實驗病理學雜志，2010，26（1）：112-113.

[13] Caminha LS，Momesso DP，Vaisman F，et al. Long-term follow-up of patients with differentiated thyroid cancer who had negative 131I whole-body scan at first evaluation after treatment[J]. Clin Nucl Med，2013，38（10）：765-769.

[14] Ni YQ，Liu QJ，Tian YX. Clinical value of cancer cells joint detection in peripheral blood plasma of thyroid cancer patients[J]. Chinese-German J Clin Oncol，2014， 13（11）：518-522.

[15] 郭苗，張冠軍，GuoMiao，等. 甲狀腺微小乳頭狀癌CK19和CD56的表達及與疾病進展的關(guān)系[J]. 西南國防醫(yī)藥，2015，25（10）：1098-1100.

[16] Hu Y，Li M，Cai W. Exploration on Correlation between Thyroid Cancer and Cytokeratin 19 as well as Thyroid Transcription Factors[J]. Health Education & Health Promotion，2013.

[17] Gong L，Chen P，Liu X，et al. Expressions of D2-40，CK19，galectin-3，VEGF and EGFR in papillary thyroid carcinoma.[J]. Gland Surgery，2012，1（1）：25-32.

[18] 張磊，楊進寶樊，宇芳，等. cN0甲狀腺乳頭狀癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險因素分析[J]. 中國癌癥雜志，2016，26（1）：73-79.

[19] 林曉東，陳曉意，杜嘉林，等. cN0期甲狀腺乳頭狀癌中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響因素分析[J]. 中國普外基礎與臨床雜志，2015，22（6）：683-687.

[20] 王萍萍，曹慧，韓曉婷，等. 臨床cN0期甲狀腺微小乳頭狀癌中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移危險因素分析及手術(shù)方式探討[J]. 中華內(nèi)分泌外科雜志，2015，9（1）：6-8.

[21] 宋方彬，翁明哲，徐軍明，等. cN0期甲狀腺乳頭狀癌中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移影響因素分析[J]. 中華內(nèi)分泌外科雜志，2016，10（4）：291-293.

[22] 顧梓群，單成祥，劉佳，等. cNO甲狀腺乳頭狀癌中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移規(guī)律及危險因素分析[J]. 第二軍醫(yī)大學學報，2016，37（5）：544-547.

[23] 馬寧，李進讓，郭紅光. cN0甲狀腺乳頭狀癌患者Ⅵ區(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險因素分析[J]. 臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2016，20（8）：641-644.

（收稿日期：2016-06-12）